مقالة منهجية

باستخدام Sensillum واحدة تسجيل لكشف الردود الشم العصبية من بق الفراش لSemiochemicals

DOI:

10.3791/53337

⸱

يناير 18, 2016

 , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يعتمد بق الفراش

على الخلايا العصبية المستقبلة الشمية الموجودة في حس حاسة الشم الهوائي للكشف عن المواد الكيميائية شبه الكيميائية في البيئة. باستخدام تسجيل حسي واحد ، نوضح طريقة لتقييم استجابة بق الفراش للمواد الكيميائية شبه الكيميائية واستكشاف عملية الترميز المعنية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النظام الشمي الحشرات تلعب دورا هاما في الكشف عن semiochemicals في البيئة. على وجه الخصوص، والشعيرات antennal التي تؤوي الخلايا العصبية واحدة أو متعددة في الداخل، وتعتبر لجعل مساهمة كبيرة في الاستجابة للمؤثرات الكيميائية. عن طريق تسجيل مباشرة إمكانات العمل في Sensillum وحاسة الشم بعد التعرض للمؤثرات، وتوفر تسجيل sensillum واحد (SSR) تقنية طريقة فعالة للتحقيق الردود العصبية من الحشرات للمؤثرات الكيميائية. لبق الفراش، وهو طفيل الإنسان سيئة السمعة، وقد اتسمت أنواع متعددة من Sensillum وحاسة الشم. في هذه الدراسة، أثبتنا الردود العصبية من بق الفراش الشعيرات حاسة الشم للمؤثرات الكيميائية اثنين والردود التي تعتمد على الجرعة إلى واحد منهم باستخدام طريقة SSR. هذا النهج يتيح للباحثين لإجراء الفحص المبكر لالمحفزات الكيميائية الفردية على بق الفراش حاسة الشم الشعيرات، والذي من شأنه أن يوفر معلومات قيمة للجمعةاإلمنائية الجديدة جاذبة بق الفراش أو طارد والفوائد جهود مكافحة بق الفراش.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علة السرير المشترك البق الفراشي L (نصفيات الجناح: البقيات)، باعتباره طفيلي خارجي مؤقت، هو حشرة تمتص الدم ملزمة، مما يعني بقائهم على قيد الحياة، والتنمية، والاستنساخ تتطلب مصادر الدم من المضيفين، بما في ذلك كل من البشر والحيوانات 1،2. على الرغم من انتقال الفيروس نادرا ما يتم الإبلاغ بسبب C. الفراشي، وإزعاج العض التي تم إنشاؤها بواسطة الإصابة يؤثر على محمل الجد المضيفين على حد سواء جسديا ونفسيا 3. إدخال واستخدام واسع النطاق للمبيدات الحشرية الكيميائية، خصوصا مادة الدي دي تي، خفضت خطر من المناطق الموبوءة ونهاية تفشي 1950s كانت في مثل هذا المستوى المتدني أنها لم تعد تشكل قلقا خطيرا العام. ومع ذلك، فقد أدى عدد من العوامل الممكنة لعودة السكان في بق الفراش في جميع أنحاء العالم، مثل تقلص استخدام المبيدات الحشرية، وانخفاض الوعي العام، وزيادة النشاط السفر، وتطور مقاومة للمبيدات الحشرية 4-9.

تم الكشف عن العظة الكيميائية في البيئة ومعترف بها من قبل الحشرات من خلال أجهزة الشم مثل الهوائيات وpalps العلوية. وحاسة الشم الشعيرات على الهوائيات الحشرات تلعب دورا حاسما في الكشف عن هذه الاشارات الكيميائية. الجزيئات الكيميائية تدخل بشرة antennal من خلال المسام على سطح بشرة. الرائحة البروتينات ملزمة في مأزق الليمفاوية antennal لهذه الجزيئات الكيميائية ونقلها على مستقبلات الرائحة 10. يتم التعرف على مستقبلات الرائحة وزملائهم في مستقبلات من قناة الموجبة أيون غير انتقائية على الغشاء العصبي، والتي سيتم استقطابها مرة واحدة هذه الجزيئات الكيميائية من قبل مستقبلات الرائحة 11.

وقد وضعت تسجيل sensillum واحد (SSR) للكشف عن تغيير خارج الخلية في إمكانات العمل الناجمة عن تطبيق أي من المحفزات الكيميائية أو غير الكيميائية. عن طريق إدراج القطب تسجيل في الليمفاوية Sensillum و، والقطب المرجعيةفي أي جزء آخر من الجسم الحشرات (عادة إما عيونا أو البطن)، ومعدل اطلاق النار من الخلايا العصبية في استجابة للمؤثرات يمكن تسجيل 12. تغييرات في عدد من المسامير تمثل حساسية الحشرات للمؤثرات محددة. والمحفزات الكيميائية الهويات وتركيز مختلفة تثير استجابات عصبية مختلفة، مع معدلات اطلاق مختلفة وهياكل مؤقتة، وبالتالي يمكن استخدامها لتحقيق عملية الترميز للحشرة لمواد كيميائية معينة.

لعلة السرير المشترك، سواء الاستغلال الجنسي تتقاسم نفس النمط من الشعيرات حاسة الشم على هوائيات: تسعة مخدد الشعيرات ربط C، +29 يشبه الشعر E (E1 و E2) الشعيرات، وزوج واحد لكل من Dα، Dβ، Dγ ربط سلس الشعيرات 13،14. كما تم التعرف على الخلايا العصبية متعددة في كل نوع من Sensillum و، فإنه ليس من السهل التمييز بين إمكانات العمل من الخلايا العصبية المختلفة الموجودة في نفس Sensillum و، وذلك لهذه التجربة TOTAاحصي أرقام لتر من إمكانات العمل خارج الخط لفترة ميللي ثانية 500 قبل وبعد التحفيز. ثم تم طرح عدد من إمكانات العمل بعد التحفيز من عدد من إمكانات العمل قبل التحفيز وتضاعفت من قبل اثنين من أجل قياس التغيرات في معدل اطلاق النار في كل Sensillum والأفراد في المسامير في الثانية 15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الآلات، حلول المحفزات، وبق الفراش

  1. إعداد 50٪ كنو 2 الحل (ث / ت) في زجاجة 20 مل.
  2. شحذ اثنين الميكروية التنغستن في كنو 2 الحل في 5 V عن طريق غمس مرارا الأقطاب التنغستن والخروج من الحل.
    1. تقريبا شحذ السلك التنغستن عن طريق غمس حوالي 10 ملم من سلك التنغستن الدخول والخروج من الحل كنو 2 في سرعة 2 الانخفاضات / ثانية لمدة 5 دقائق، والتي يمكن أن تستهلك كثيرا من الواجهة الأمامية للسلك التنغستن.
    2. بدقة شحذ القطب بواسطة غمس حوالي 1 ملم من طرف سلك داخل وخارج من الحل في سرعة 2 الانخفاضات / ثانية ل1 دقيقة على الأقل وذلك لجعل نقطة غرامة وحادة من القطب. تحقق القطر القطب غيض تحت المجهر في كثير من الأحيان حتى تصل إلى 0،2-0،5 ميكرون، والتي ينبغي أن يكون على ما يرام بما فيه الكفاية لثقب بشرة من بق الفراش Sensillum وحاسة الشم.
      ملاحظة: في حين حاد يدوياملمسه القطب، وسرعة غمس السلك التنغستن في حل كنو 2 ليست ثابتة في كل وقت. مع مزيد من الممارسة، فمن الأسهل بكثير للحفاظ على سرعة ثابتة نسبيا في شحذ القطب. الوقت شحذ غير مؤكدة أيضا اعتمادا على كيفية غرامة ينبغي أن يكون القطب. هنا، وهي غيض الكهربائي مع قطر ~ 0.2 ميكرون هي كافية لثقب من خلال Sensillum وحاسة الشم.
  3. تمييع كل من المحفزات الكيميائية في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) من مجمع أنيق إلى التركيز الأولي 01:10 ت / ت كحل الأسهم. إنشاء سلسلة من التخفيفات decadic اعتمادا على عدد الجرعات المطلوبة في التجربة، ومرة ​​أخرى مع DMSO، من كل من الحلول الأسهم لكل مادة كيميائية. هنا، استخدم 10٪ (+) - β-بينين ويوكاليبتول.
  4. ضع أيام unfed أو سبعة بعد الرضاعة بق الفراش الكبار (سواء الذكور أو الإناث) من نهاية المباراة. ديكس مستعمرة (هدية من الدكتور هاينز في جامعة كنتاكي) لاستخدامها في تيانه تجربة في طبق بتري.
    ملاحظة: ليس هناك عدد محدد لبق الفراش وضعها في طبق بتري. ويمكن أن يكون القليل أو الكثير.

2. سرير علة إعداد هوائيات

  1. تخدير بق الفراش على الجليد (2-3 دقائق).
  2. إصلاح كل من الهوائيات والجسم الحشرات على ساترة المجهر مع الشريط على الوجهين وإزالة الساقين مع مقص غرامة.
  3. استخدام دبوس صغير للمس بلطف هوائيات ذلك إلى التمسك بها على الشريط بشكل مطرد.
  4. ضع ساترة ضد كرة صغيرة (~ 1 سم القطر) من الشمع الأسنان لتسهيل التلاعب وتعديله إلى زاوية مناسبة (~ 90 درجة) على القطب تسجيل (الشكل 1).
  5. مرة واحدة مضمونة، ضع بق الفراش تحت المجهر ستيريو، بدوره على مصدر ضوء بارد وضبط شدة الإضاءة حتى يتم تقديم الهوائي بشكل واضح، والتركيز المجهر على السوط الثاني من الهوائي بق الفراش في تضخم عالية (720X) .
    ملاحظة: شدة الإضاءة المستخدمة في التجربة لا quantitated، الذي يعتمد حقا على كيف يشعر عيون المجرب في شدة الإضاءة.

3. Sensillum واحدة تسجيل

  1. توصيل المضخم (10X) مع وحدة تحكم اكتساب إشارة، وهذا مرتبط مع جهاز الكمبيوتر لتسجيل الإشارات والتصور. قم بتشغيل الكمبيوتر وإطلاق البرنامج، على سبيل المثال، AutoSpike32 وانقر على وضع "سجل" من شريط القوائم. ثم اختر "موجة" وذلك لبدء تسجيل إشارات الموجة.
    ملاحظة: خط مستو يمتد من اليسار إلى اليمين من الشاشة بشكل متكرر يجب أن يكون الآن مرئية. هنا، نافذة تسجيل يدوم 40 ثانية. ماكس تسجيل موجة هو 10 ثانية. معدل أخذ العينات المحدد هو 96000 ومعدل أخذ العينات الرقمية 240. وهناك 0٪ تعويض وليس الترشيح، أي تصحيح للإشارات تسجيل. يمكن تعديل كل هذه الإعدادات معلمة في البرنامج حسب الحاجة.
    2. <لى> قم بتشغيل مكبر صوت متصل المضخم، والذي يستخدم لتقديم طريقة التنغيم للردود العصبية من Sensillum وantennal.
  2. إدراج القطب إشارة إلى البطن من بق الفراش استقرت.
    ملاحظة: تم عقد القطب المرجعية من قبل حامل معدني تعلق مغناطيسيا إلى طاولة الهواء.
  3. بعد أن تم توصيل القطب إشارة إلى بطن بق الفراش، ونقل القطب تسجيل، وهذا مرتبط إلى المضخم والتلاعب بها من قبل micromanipulator، نحو نهاية الخلفي من هوائي علة السرير.
  4. عندما القطب تسجيل في اتصال مع طرف الأيمن من الهوائي، تشغيل المجهر وتحديد القطب في التكبير المنخفض.
  5. ضبط القطب تسجيل مع زيادة تدريجية في التكبير حتى كل من القطب وSensillum وantennal في نفس الطائرة واضحة للعيان تحت المجهر.
    ملاحظة: وبحلول ذلك الوقت، المجهر هو المعتادلاي على أعلى التكبير.
  6. إدراج القطب تسجيل في رمح من Sensillum وباستخدام micromanipulator والتعمق قليلا إذا ضجيج الخلفية مرتفع مقارنة مع إمكانات العمل.
  7. مرة واحدة لوحظ إمكانات العمل واضحة من Sensillum وسجلت، وملء micropipette مع 10٪ (+) - β-بينين. استخدام micropipette لإيداع 10 ميكرولتر قسامة من 10٪ (+) - β-بينين على شريط ورق الترشيح (~ 3 × 15 مم) وضعت داخل ماصة باستير الزجاج.
    1. ربط ماصة تحميلها إلى مخرج من أنبوب تدفق نبض تحكم التحفيز ووضع غيض من ماصة في حفرة صغيرة في الأنبوب موجهة نحو الهوائي.
  8. عندما استقرت كل هذه الاتصالات، كساد FOOTSWITCH وحدة تحكم التحفيز لتقديم نفخة 0.5 ثانية من التحفيز (0.5 لتر / دقيقة) في مجرى الهواء مرطب المستمر. وسيبدأ تسجيل إمكانات العمل في وقت واحد عندما footswitcح هو الاكتئاب. فإن عملية التسجيل تكون آخر لمدة 10 ثانية اعتبارا من 1 ثانية قبل التحفيز.
  9. عد إمكانات العمل خارج الخط لمدة 500 ميللي ثانية فترات، واحدة قبل واحدة بعد التحفيز. طرح أي تغيير في معدل ارتفاع خلال 500 مللي ثانية بعد التحفيز من النشاط العفوي سجلت خلال السابقة 500 ميللي ثانية وتحويل التهم في نطاق التقليدية السنابل / الصورة عن طريق ضربها ب 2.

4. التحفيز استبدال في SSR

  1. مرة واحدة وقد تم إطلاق FOOTSWITCH، تسليم 10٪ (+) - β-بينين في ماصة على السرير علة هوائيات وتسجيل استجابة لهذه الرائحة معينة لمدة 10 ثانية، وبعد ذلك يتم إزالة ماصة.
  2. تسمية ماصة جديدة أخرى مع يوكاليبتول 0.001٪ لفحصها. ضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح على الذي تم تطبيقه 10 ميكرولتر من التحفيز، في ماصة جديدة.
  3. الانتظار لمدة 2-5 دقائق حتى التحفيز هو vapori تمامازد في ماصة الزجاج. إرفاق ماصة على مخرج من أنبوب تدفق النبض.
  4. إدراج غيض ماصة في حفرة صغيرة من الأنبوب موجهة نحو الهوائي. كساد FOOTSWITCH والبدء في تسجيل 10 ثانية.
  5. قطع ماصة وإعداد ماصة أخرى مع 0.01٪ يوكاليبتول.
  6. اختبار كل ما تبقى من جرعات يوكاليبتول (من 0.001٪ إلى 10٪) على الشعيرات antennal لمراقبة ردود تعتمد على الجرعة. اختبار من أكثر تمييع لأقل تخفيف جرعات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسجيل Sensillum واحد هو أسلوب التحقيق القوية المستخدمة في الدراسات من الحشرات البيئة الكيميائية وعلم وظائف الأعضاء العصبية. التحقيق في الاستجابات العصبية للحشرات لمركبات طيارة مختلفة، وخصوصا تلك التي يعتقد أنها مرتبطة بيئيا لبقاء وتطور الحشرات، لا يعطي لنا رؤى لا تقدر بثمن في عملية الشم الحشرات، ولكن أيضا يفتح آفاقا جديدة واعدة التي يمكن ان تؤدي لتطوير الكواشف جديدة مفيدة لمكافحة الآفات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقنية Sensillum واحدة تستخدم على نطاق واسع تسجيل في اختبار الاستجابات العصبية من الحشرات مثل ذباب الفاكهة والبعوض والبق الفراش للمؤثرات الكيميائية المختلفة في البيئة. وغالبا ما حل هذه المحفزات الكيميائية وتخفيفه في مذيب المشترك من أجل إعداد جرعات مختلفة من العلاجات. ومع ذلك، يمكن مذيبات مختلفة تنتج معدلات الانبعاث مختلفة تماما عن المنبهات. الدراسات السابقة على بعض الحشرات درس على نطاق واسع مثل ذبابة الفاكهة السوداء البطن، بعوض الملاريا، كوينكيفاسكياتس الكي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم المشروع من قبل جائزة AAES 461Hatch / Multistate Grants ALA08-045 و ALA015-1-10026 إلى NL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سلك التنغستنأنظمة AM# 716500تستخدم لتحضير القطب الكهربائي
KNO2Sigma# 310484تستخدم لشحذ سلك التنغستن
مصدر طاقة التيار المترددBK Precision1653Aتوفير الجهد في شحذ سلك التنغستن
Leica Z6 APO المجهرLeica 10447424تستخدم لمراقبة الحسية على الهوائيات
وحدة تحكم SimulusSyntechCS-55تستخدم للتحكم في تطبيق التحفيز
وحدة تحكم اكتساب USB ذات 4 قنواتSyntechIDAC-4الوقت الحقيقي على شاشة عرض جميع الإشارات قبل وأثناء التسجيل
مصدر الضوءSCHOTTA20500توفير مصادر الضوء للمراقبة
MicromanupulatorLeica115378تستخدم للحركة البسيطة
مكبر صوتالكهربائي Juster95aمتصل بوحدة التحكم في الاستحواذ IDAC-4 ويوفر الصوت للإشارة
الحامل المغناطيسيNarishigeGJ-1يستخدم لحمل القطب المرجعي ، بق الفراش المستقر وأنبوب توصيل التحفيز
TMC طاولة عزل الاهتزازTMCTMC 63-500تستخدم لعزل الاهتزاز عن المعدات
CoverslipTedpella2225-1يستخدم لحمل بق الفراش
شريط على الوجهين3MXT6110يستخدم لتثبيت بق الفراش على مشبك
الغطاء شمع الأسنانDentakitDK-R012يستخدم لدعم مشبك الغطاء حيث يتم تثبيت بق الفراش  
في القطب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartonicka, T., Gaisler, J. Seasonal dynamics in the numbers of parasitic bugs (Heteroptera, Cimicidae): a possible cause of roost switching in bats (Chiroptera, Vespertilionidae). Parasitol Res. 100 (6), 1323-1330 (2007).
  2. Thomas, I., Kihiczak, G. G., Schwartz, R. A. Bed bug bites: a review. Int J Dermatol. 43 (6), 430-433 (2004).
  3. Anderson, A. L., Leffler, K. Bed bug infestations in the news: a picture of an emerging public health problem in the United States. J Environ Health. 70 (9), 24-27 (2008).
  4. Boase, C. Bed bugs (Hemiptera: Cimicidae): an evidence-based analysis of the current situation. Sixth international conference on urban pests. OOK-Press Kft. Robinnson, W., Bajomi, D. Budapest, Hungary, , (2008).
  5. Doggett, S. L., Geary, M. J., Russell, R. C. The Resurgence of bed bugs in Australia: with notes on their ecology and control. Environ Health. 4 (2), 30-38 (2004).
  6. Ter Poorten, M. C., Prose, N. S. The return of the common bedbug. Pediatr Dermatol. 22 (3), 183-187 (2005).
  7. Yoon, K. S., Kwon, D. H., Strycharz, J. P., Craig, S., Lee, S. H., Clark, J. M. Biochemical and molecular analysis of deltamethrin resistance in the common bed bug (Hemiptera: Cimicidae). J Med Entomol. 45 (6), 1092-1101 (2008).
  8. Wang, L., Xu, Y., Zeng, L. Resurgence of bed bugs (Hemiptera: Cimicidae) in mainland China. Fla Entomol. 96 (1), 131-136 (2013).
  9. Haynes, K. F., Potter, M. F. Recent progress in bed bug management. Advanced technologies for managing insect pests. Ishaaya, I., Palli, S. R., Horowitz, A. R. , Springer. New York. 269-278 (2013).
  10. Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 12987-12995 (2011).
  11. Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annu Rev Entomol. 58, 373-391 (2013).
  12. Den Otter, C. J., Behan, M., Maes, F. W. Single cell response in female Pieris brassicae. (Lepidoptera: Pieridae) to plant volatiles and conspecific egg odours. J Insect Physiol. 26 (7), 465-472 (1980).
  13. Levinson, H. Z., Levinson, A. R., Muller, B., Steinbrecht, R. A. Structural of sensilla, olfactory perception, and behavior of the bed bug, Cimex lectularius., in response to its alarm pheromone. J Insect Physiol. 20 (7), 1231-1248 (1974).
  14. Harraca, V., Ignell, R., Löfstedt, C., Ryne, C. Characterization of the antennal olfactory system of the bed bug (Cimex lectularius). Chem Senses. 35 (3), 195-204 (2010).
  15. Liu, F., Haynes, K. F., Appel, A. G., Liu, N. Antennal olfactory sensilla responses to insect chemical repellents in the common bed bug, Cimex lectularius. J Chem Ecol. 40 (6), 522-533 (2014).
  16. Olson, J. F., Moon, R. D., Kells, S. A., Mesce, K. A. Morphology, ultrastructure and functional role of antennal sensilla in off-host aggregation by the bed bug, Cimex lectularius. Arthropod Struct Dev. 43 (2), 117-122 (2014).
  17. Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30 (2), 537-552 (2001).
  18. Qiu, Y. T., Loon, J. J. A., Takken, W., Meijerink, J., Smid, H. M. Olfactory coding in antennal neurons of the malaria mosquito, Anopheles gambiae. Chem Senses. 31 (9), 845-863 (2006).
  19. Ghaninia, M., Ignell, R., Hansson, B. S. Functional classification and central nervous projections of olfactory receptor neurons housed in antennal trichoid sensilla of female yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Eur J Neurosci. 26 (6), 1611-1623 (2007).
  20. Hill, S. R., Hanson, B. S., Ignell, R. Characterization of antennal trichoid sensilla from female southern house mosquito, Culex quinquefasciatus Say. Chem Senses. 34 (3), 231-252 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة