نقدم بروتوكولا يصف طريقة شبه كمية لقياس كليهما ، ربط فيروس الأنفلونزا A بخلايا A549 ، بالإضافة إلى استيعاب جزيئات الفيروس في الخلايا المستهدفة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الارتباط بالخلايا المستهدفة متبوعا بالاستيعاب هي الخطوات الأولى في دورة حياة فيروس الأنفلونزا A (IAV). نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لقياس التغيرات النسبية في كمية الجسيمات الفيروسية التي ترتبط بخلايا A549 ، وهي خط خلايا ظهارية للرئة البشرية ، وكذلك في كمية الجسيمات التي يتم استيعابها في الخلية. نحن نستخدم الفيروسات الحيوية التي يمكن اكتشافها بسهولة بعد تلطيخها باستخدام الستربتافيدين المسمى Cy3 (STV-Cy3). نصف نمو وتنقية وبيوتينيل A / WSN / 33 ، وهي سلالة مختبرية IAV مستخدمة على نطاق واسع. يتم تلطيخ جزيئات IAV الحيوية المرتبطة بالبرودة على خلايا A549 ب STV-Cy3 ويتم قياسها باستخدام قياس التدفق الخلوي. للتحقيق في امتصاص الجسيمات الفيروسية ، يسمح للفيروس المرتبط بالبرودة باستيعاب 37 درجة مئوية. من أجل التمييز بين الجسيمات الفيروسية الخارجية والداخلية ، يتم تطبيق خطوة حظر: ترتبط بقع الارتباط الحرة على البيوتين للفيروس المتصل على سطح الخلية بالستربتافيدين غير المسمى (STV). ثم يتيح نفاذية الخلايا وتلبيخها اللاحق باستخدام STV-Cy3 اكتشاف الجسيمات الفيروسية الداخلية. نقدم عملية حسابية لتحديد الكمية النسبية للفيروس الداخلي. هذا الاختبار مناسب لقياس آثار العلاجات الدوائية أو التلاعب الآخر على ارتباط أو استيعاب IAV.
المقدمة
دخول فيروس الانفلونزا (IAV) هو عملية متعددة الخطوات التي تبدأ مع ربط الفيروس إلى المستقبلات على غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 1. مستقبلات للIAV هو الحامض اللعابي التي هي موجودة على مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات السكرية والسكرية. وهيماغلوتينين (HA) البروتين من IAV التي هي موجودة في المغلف الفيروسي بربط الحامض اللعابي وبالتالي يتوسط مرفق من الجسيمات الفيروسية إلى غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 2. ويدخل الفيروس الخلايا عن طريق بوساطة بالكلاذرين الإلتقام ولكن أيضا مسارات دخول بديلة، مثل macropinocytosis، وقد وصفت 3-6. التفاعل بين HA والحامض اللعابي يبدو أن يكون كافيا للوساطة على حد سوا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة قبل البداية: غطاء محرك السيارة استخدام تدفق الصفحي والاحتواء المناسب عند العمل مع فيروسات حية. هنا، نحن تصف ظروف النمو المناسبة لسلالة فيروس الإنفلونزا الثقافة A / WSN / 33. قد تختلف وافر من العدوى (وزارة الداخلية) وحضانة مرات اعتمادا على سلالة الفيروس المستخدمة.
1. إعداد البيروكسيديز A / WSN / 33 الفيروسات
- البذور مادين-داربي kindey الكلاب (MDCK) الخلايا في قارورة T175 سم 2 باستخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين، ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد الكرتون واصفا الشروط الأربعة تجريبية مختلفة في الشكل 1 يتم عرض نتائج تجربة تمثيلية في الشكلين 2 - 5. في "0 دقيقة" عينة والفيروسات المعقدة البيروكسيديز بارد محددة لاستهداف الخلايا التي يمكن تصور من قبل STV-CY3 تلطيخ (الشكلان 1 و 2). عندما يتم تطبيق خطوة حجب (في "0 دقيقة + STV" عينة)، الفيروس على سطح الخلية لا يمكن الكشف عنها بواسطة STV-CY3 تلطيخ. ونتيجة لذلك، يتم تقليل كثافة إشارة في ".......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف بروتوكول لدينا وسيلة سهلة لقياس مرفق الفيروس واستيعاب التدفق الخلوي. لأنها تتيح استخدام المسمى فيروس wildtype الذي يحاكي عن كثب العدوى بالفيروس مقارنة مع استخدام جزيئات الفيروسات مثل (فلب). في حين تم تحسين بروتوكول لدينا لقياس الحجز واستيعاب IAV يمكن بسهولة أن يتم تكييفها للفيروسات أخرى. بالإضافة إلى ذلك، كما يتم استخدام التدفق الخلوي للقراءات، وشارك في stainings يمكن بسهولة إضافة إلى بروتوكول على سبيل المثال لاختبار مستويات التعبير التالي ضربة قاضية أو overexpression.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_135278) لطائرة أسرع من الصوت. MOP هو المستفيد من منحة الدكتوراه من صندوق البحوث AXA. نشكر باتريشيا Nigg للمساعدة في تصميم الشكل 1.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN KIT | فيشر Scientific | W9971E < / a> | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| أنابيب ديب ويل (1.2 مل أنابيب دقيقة) | ميليان | 82 00 001 | |
| PFA | & nbsp ؛ Lucerna chem علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | |
| أنابيب الطرد المركزي الفائق | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| أزيد الصوديوم | Fluka | 71290 | |
| النيورامينيداز البكتيري / سياليداز | سيجما ألدريتش | N6514-1UN |
المراجع
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
