النقل غشاء عمليات تحليلها بواسطة النظام ثقب النانو رقاقة الموازي عالية في قرار بروتين واحد

ملخص

يصف البروتوكول المقدم تحليل النقل بوساطة البروتين الغشائي على مستوى الناقل الفردي باستخدام طبقات ثنائية دهنية خالية من المذيبات الممتدة عبر المسام. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء رقائق مصفوفة نانوية منتجة بكميات كبيرة ، جنبا إلى جنب مع الحصول على البيانات وتحليلها متوازية للغاية ، مما يتيح الإنشاء المستقبلي لفحوصات مستجيب البروتين الغشائي

الملخص

نقل البروتين غشاء على مستوى بروتين واحد لا يزال يتهرب تحليل مفصل، إذا الركيزة translocated غير قابلة للكهربي. وقد بذلت جهود كبيرة في هذا المجال، ولكن تقنيات تمكين تحليل النقل عالية الإنتاجية الآلي في تركيبة مع تقنيات طبقة ثنائية المادة الدهنية الخالية من المذيبات المطلوبة للتحليل النقل غشاء نادرة. هذا النوع من النقل ولكن هو الحاسم في توازن الخلايا وبالتالي هدفا رئيسيا في تطوير العقاقير ومنهجيات للحصول على أفكار جديدة بحاجة ماسة.

يصف المخطوطة هنا قدمت إنشاء والتعامل معها من بيوشيب رواية لتحليل البروتين بوساطة عمليات النقل غشاء على قرار نقل احد. يتكون بيوشيب من microcavities محاطة nanopores التي هي موازية للغاية في التصميم ويمكن أن تنتج في الصف الصناعي وكمية. ويمكن مباشرة الجسيمات الشحمية البروتين إيواء تطبيقها علىسطح رقاقة تشكيل طبقات ثنائية للدهون، والتي تمتد المسام الذاتي تجميعها باستخدام SSM-تقنيات (بدعم الصلبة الأغشية الدهنية). المسام التي تغطي أجزاء من الغشاء وقائما بذاته، وتوفير واجهة للالنبات الركيزة داخل أو خارج الفضاء تجويف، والتي يمكن أن تتبعها قراءات الفلورسنت متعددة الأطياف في الوقت الحقيقي. وضع إجراءات التشغيل القياسية (الأورام) يسمح بإنشاء واضحة من طبقات ثنائية الدهون-إيواء البروتين على سطح رقاقة من تقريبا كل بروتين الغشاء الذي يمكن تشكيلها وظيفيا. الشرط الوحيد هو إنشاء نظام تلا الفلورسنت لركائز النقل غير كهربي.

تطبيقات فحص عالية المحتوى هي محقق عن طريق استخدام آلية المجهر الفلورسنت المقلوب تسجيل رقائق متعددة في نفس الوقت. ويمكن تحليل مجموعات البيانات الكبيرة باستخدام متاحة بحرية برامج التحليل مصمم خصيصا. ثلاثة ألوان متعددة الطيفية الفلوريةقراءة من علاوة على ذلك يسمح للتمييز البيانات غير منحازة إلى فئات الأحداث المختلفة، والقضاء على نتائج إيجابية كاذبة.

وتعتمد هذه التقنية رقاقة حاليا على شافي ₂ السطوح، ولكن المزيد من functionalization باستخدام أسطح رقاقة الذهب المطلي ممكن أيضا.

المقدمة

أصبح تحليل بروتينات الغشاء من الاهتمام المتزايد للبحوث الأساسية والأدوية في السنوات ال 20 الماضية. تطوير عقاقير جديدة تعتمد على تحديد وتوصيف مفصل للأهداف جديدة، ويجري حاليا واحدة من العوامل التي تحد. حقيقة أن حوالي 60٪ من جميع الأهداف المخدرات هي بروتينات غشاء ^1، يجعل من تطوير تقنيات لتوضيح وظيفتها الأهم.

في الماضي، وقد تم تطوير تقنيات لدراسة قنوات كهربي والنقل في العديد ^2-4. ركائز غير كهربي في العكس تمثل مهمة أكثر صعوبة. ومع ذلك فهي تحظى باهتمام خاص كأهداف المخدرات الرئيسية، كما أنها تتحكم في تدفق المواد المذابة وال....

البروتوكول

1. إعداد كبيرة Unilamellar الحويصلات (LUVs)

1. تنظيف قارورة أسفل جولة (حجم 10 مل) مع غاز النيتروجين لإزالة أي جزيئات الغبار. شطف قارورة أسفل مستديرة مع الايثانول.
   ملاحظة: الإيثانول المتبقية يمكن السكوت ولا تخل الخطوات اللاحقة.
2. غسل 1 مل 4X حقنة زجاجية مع الكلوروفورم، لإزالة أي تلوث. إضافة 4 مل SoyPC20 (25 ملغ / مل في الكلوروفورم) إلى قارورة القاع المستديرة ومخدر الحل الدهون مع مخدر ^ATTO إضافي ³⁹⁰ لتركيز النهائي من 0.1 مول٪.
   ملاحظة: بدلا من مخدر ^ATTO

النتائج

يمكن بسهولة الأغشية التي تغطي المسام المراد إنشاؤها على سطح رقاقة ذات البنية النانومترية بطريقة الذاتي تجميعها. لكن العملية الأساسية لا تزال حساسة وتتأثر العديد من المعلمات مثل حجم الجسيمات الشحمية، monodispersity من السكان الحويصلية، lamellarity، lipid- والملح التركيز وسطح الكيميائية الخصائص. وقد اتسمت معظم هذه المعايير بدقة وموحدة في البروتوكول أعلاه. غيرها من المعالم ولكن يجب أن يتم التحقق خلال كل إعداد جديد، لضمان تجربة ناجحة. هذه هي توزيع حجم .......

المناقشة

تقنية المعروضة هنا يسمح للتحليل مواز للغاية من النقل بروتين الغشاء. ويمكن مباشرة أنظمة بروتين الغشاء أعيد تطبيقها على بيوشيب، مما يجعل التكيف من الناحية النظرية كل نقل غشاء أو توجيه ممكن. تحليل النقل يقتصر فقط عن طريق إنشاء نظام تلا الفلورسنت، إما عن طريق تغيير مباشر مضان (النبات من fluorophores أو ركائز fluorescently المسمى) أو التغيير غير المباشرة مضان (الأصباغ الحساسة للدرجة الحموضة، والتفاعلات الأنزيمية الثانوية). هذا الأخير، ولكن لم يتم بعد تأسيسها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي >كاشف < / قوي >
[2- (ثلاثي ميثيل أمونيوم) إيثيل] < br / > ميثانيثيوسلفونات	شركة تورونتو للأبحاث للكيماويات	T792900	MTSET ؛ مائية بالماء. يحفظ كبودرة جافة عند -80 درجة مئوية. يستخدم مباشرة (30 دقيقة) بعد الذوبان في المخزن المؤقت.
1 مل حقنة محكمة الغلق للغاز	هاميلتون	# 1001
10 مل قارورة مستديرة	شوت دوران
2.7 ملم خرز زجاجي	روث	N032.1
2-بروبانول	روث	9866.5
30 سم أنبوب تمديد لور لوك	سارستيدت	744304
الأسيتون	روث	5025.5
بيو بيودس SM-2 يجب تنشيط الممتزات	Bio-Rad	152-3920	قبل الاستخدام الأول
CaCl2 < / sub>Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	تخزين داكن عند -20 درجة ؛ C
كاشف الكلوروفورم الصف	VWR المواد الكيميائية	22711324
DOPEATTO390< / sup>	ATTO-TEC	AD 390-165	تخزين الظلام عند -20 درجة ؛ C
الإيثانول المطلق	سيجما ألدريتش	32205
Injekt حقنة ذات استخدام واحد	براون	460 60 51 فولت
حقنة Injekt-F أحادية الاستخدام	براون	91 66 017 فولت
مقاطع كيك	شوت	KC29
L- & alpha ؛ فوسفاتيديل كولين ، 20٪ (فول الصويا)	أفانتي القطبية	5416016	تخزين الدهون تحت غاز خامل عند -20 درجة ؛ ج
كلوريد الصوديوم 99.5٪ سنويا	Roth	3957.2
رقاقة / رقائق Nanopore E100	Micromotive (ماينز / ألمانيا)		متوفرة عند الطلب
غشاء Nucleopore Track-Etch 0.4 & micro ؛ م	Whatman	800282
Oregon Green Dextern 488 (70 kDa)	متجر Life Technologies	D-7173	مظلم عند -20 درجة ؛ C
Oy647	Luminartis (M & uuml ؛ nster / ألمانيا)	OY-647-T-1mg	تخزين الظلام عند -20 درجة ؛ ترشيح حقنة
Rotilabo C ، غير معقم ، حجم المسام 0.22 ومايكرو ؛ م	روث	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	مادة العمود لحجم استبعاد الكروماتوغرافيا
Silastic MDX4-4210	عامل معالجة داو كورنينج		لتثبيت الرقاقة على غطاء زجاجي دعم
لزج الشريحة 8 جيدا	ibidi	80828	غرفة متعددة الآبار للتركيب على الشرائح الزجاجية (حامل رقاقة)
محبس ثلاثي الاتجاهات أزرق	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9٪ Ultra Quality	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 & micro ؛ م مرشح غشاء نترات السليلوز	روث	NH69.1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bü تشي 461 حمام مائي	ب ü تشي
ب & uuml; تشي روتابخار RE 111	Bü مقياس
كاري كسوف	أفيستين
ليبوسوفاست
	Vaccubrand	15430
Nanosight نانو الجسيمات تتبع المجهر	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE مجهر	Synentec		متاح عند الطلب
التحكم في المضخة	Vaccubrand	CVC 2II
Sonicator حمام Sonorex RK100H	Brandelin الإلكتروني	31200001107477
مضخة فراغ RC5	حمام مائي Vaccubrand	1805400204
W13	Haake	002-9910
منظف البلازما PDC-37G	هاريك بلازما	PDC-37G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ImageJ	مفتوح المصدر	http://imagej.nih.gov/ij/	برنامج معالجة الصور العلمي
NanoCalcFX	مجاني	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	برنامج تحليل / تقييم البيانات لمجموعات البيانات الحركية للنقل الضخم
NTA 2.3 البرامج التحليلية	برنامج		الحصول على البيانات وتحليلها لتتبع الجسيمات النانوية المجهر
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		برنامج التحكم في درجة الحرارة لمجهر تتبع الجسيمات النانوية

الطيف الفلوري تشي مضخة غشاء الطارد الصغير فاريان