مقالة منهجية

بروتوكول عزل فعال للاللمفاوية البائية والتائية من بلاطي اللوزتين الإنسان

DOI:

10.3791/53374

⸱

نوفمبر 16, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala Biomedical Center, Uppsala University, 2Department of Surgical Sciences, Otolaryngology and Head & Neck Surgery, Akademiska sjukhuset

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تعتبر اللوزتين الحزنية < p class = 'jove_content'> مصدرا غنيا للخلايا الليمفاوية B و T. نقدم هنا بروتوكولا سهلا وفعالا وسريعا لعزل الخلايا الليمفاوية B و T من اللوزتين الحنكية البشرية. تم تكييف الطريقة الموصوفة خصيصا لدراسات المسببات الفيروسية لالتهاب اللوزتين المعروف باسم التهاب اللوزتين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تشكل اللوزتان

جزءا من جهاز المناعة مما يوفر خط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض المستنشقة. عادة ما يشير مصطلح "اللوزتين" إلى اللوزتين الحنكية الموجودة في الجدران الجانبية للجزء الفموي من البلعوم. توفر اللوزتين الحنكية التي تمت إزالتها جراحيا مصدرا مناسبا يمكن الوصول إليه للخلايا الليمفاوية B و T لدراسة التفاعل بين مسببات الأمراض الأجنبية والجهاز المناعي المضيف. يصف بروتوكول الفيديو هذا تشريح ومعالجة اللوزتين الحنكية البشرية التي تمت إزالتها جراحيا ، متبوعا بعزل مجموعات الخلايا البائية والتائية الفردية من نفس عينة الأنسجة. نقدم طريقة تفصل بكفاءة بين الخلايا الليمفاوية B و T اللوزتين باستخدام بروتوكول تقارب يعتمد على الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، نستخدم الطريقة لإثبات أن الفيروس الغدي البشري يصيب على وجه التحديد جزء الخلايا التائية للوزتين. ينطبق البروتوكول المعمول به بشكل عام على عزل مجموعات الخلايا التائية للوزتين بكفاءة وسرعة لدراسة دور أنواع مختلفة من مسببات الأمراض في الاستجابات المناعية للوزتين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اللوزتين عبارة عن مجموعات من الأنسجة اللمفاوية غير المغلفة بشكل كامل والتي تقع تحت الظهارة في الجهاز الهضمي العلوي وتلامس معها. عادة ما يشير مصطلح "اللوزتين" إلى اللوزتين الحنكية الموجودة في الجدران الجانبية للجزء الفموي من البلعوم. تشكل اللوزتان الحنكيان المزدوجتان مع اللوزتين البلعومية الأنفية (اللحمية ) واللوزتين البوقيتين المزدوجة واللوزتين اللسانية ما يسمى ب "حلقة والديير". هذا الأخير مسؤول عن الاتصال الأولي بين مسببات الأمراض المستنشقة أو المبتلعة والأنسجة اللمفاوية في الجهاز الهضميالهوائي 1،2. في الواقع ، أظهرت العديد من التقارير أنه يمكن اكتشاف كل من المستضدات البكتيرية والفيروسية في عينات أنسجة اللوزتين الحنكية2-6.

تتكون اللوزتان الحنكية من أنسجة ليمفاوية كثيفة مغطاة بظهارة حرشفية طبقية غير متقرنة. تحتوي اللوزتان على العديد من الخبايا ، والغزوات الظهارية ، التي تخترق الحمة مما يزيد من مساحة السطح. من الناحية النسيجية ، تحتوي اللوزتان الحنكية على العديد من البصيلات اللمفاوية ذات المراكز الجرثومية ، وهي مواقع نضوج الخلايا البائية وتمايزها (مناطق الخلايا البائية). وبالمثل ، تشمل اللوزتين الحنكية الخلايا التائية ، والتي تقع بشكل أساسي في المناطق خارج الجريبات (مناطق الخلايا التائية). بالإضافة إلى الخلايا B و T ، يمكن أيضا اكتشاف العديد من الخلايا المتغصنة المسامية في اللوزتين الحنكية1،2.

نظرا لموقعها التشريحي ، يمكن الوصول بسهولة إلى اللوزتين الحنكية عن طريق التدخلات الجراحية. على سبيل المثال ، يتم إجراء الاستئصال الجراحي للوزتين ، المعروف باسم استئصال اللوزتين ، بشكل روتيني في جميع أنحاءالعالم 7. في الأطفال المصابين بتضخم اللوزتين ، يتم أحيانا استخدام الاستئصال الجراحي الجزئي للوزتين (بضع اللوزتين) ، مما يسبب ألما أقل بعد الجراحة للمرضى. بالنظر إلى تراكم مسببات الأمراض المختلفة في اللوزتين ، توفر اللوزتان التي تمت إزالتها جراحيا فرصة فريدة لدراسة تأثير العوامل الفيروسية والبكتيرية على وظائف الخلايا الليمفاوية للوزتين2،8. علاوة على ذلك ، من الممكن دراسة ما إذا كانت بعض مسببات الأمراض تفضل الإقامة في مجموعات سكانية فرعية معينةللخلايا 9. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن اللوزتين مصدر غني للخلايا الليمفاوية البائية ، يمكن استخدام الخلايا الليمفاوية البائية المعزولة للوزتين بكفاءة لدراسة نشاط مجموعات سكانية فرعية مختلفة للخلاياالبائية 10. ومع ذلك ، نظرا لأن اللوزتين الحنكية تحتوي على مزيج من أنواع الخلايا ، فهناك حاجة إلى طريقة فعالة لفصل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة للخلايا.

هنا ، نصف طريقة بسيطة للعزل الفعال والسريع لمجموعات الخلايا B و T اللوزتين من اللوزتين البشريتين باستخدام تقنية فصل الخلايا المنشطة مغناطيسيا (الشكل 1). الطريقة الموضحة هنا مفيدة للعلماء الذين يرغبون في تقييم دور العوامل المعدية المختلفة في الأعضاء اللمفاوية البشرية مثل اللوزتين الحنكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف بروتوكول عزل الخلايا اللمفاوية من المواد البشرية المريض، وبالتالي يتطلب موافقة الأخلاقية. منحت الأعمال المنجزة في هذه الدراسة من قبل أوبسالا مجلس المراجعة الأخلاقية (DNR. 2013/387).

1. عزل الخلايا وحيدة النواة (الشركات المتعددة الجنسيات) من بلاطي اللوزتين الإنسان

وينبغي اعتبار جميع المواد غير المفروزة المنشأ البشري مثل الدم أو الأنسجة أو سوائل الجسم كمادة يحتمل أن تكون مصابة: تنبيه. لذا، ينبغي اتباع ممارسات السلامة الأحيائية الموصى بها لمعالجة الأنسجة البشرية.

ملاحظة: لتجنب التلوث، يجب على جميع الحلول ومعدات زراعة الخلايا تكون عقيمة. جميع مخازن والحلول يجب أن يكون قبل تبريده وأبقى على الجليد. يجب أن تبقى الأنسجة لوزة الحلق والخلايا المعزولة والتعامل معها على الجليد.

  1. الحصول على اللوزتين جديدة من المرضى الذين يخضعون لاستئصال اللوزتين أو بضع اللوزة (الشكل 2). يغرق clum الأنسجةملاحظة في أنبوب 50 مل الطرد المركزي مليئة العقيمة هانكس محلول ملحي متوازن المثلج (HBSS) تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 10 ملي الجلوتامين، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين و 1٪ مزيج مضادات الحيوية مضاد فطري (البنسلين، الستربتومايسين والامفوتريسين B).
  2. إبقاء الأنابيب مع عينات الأنسجة لوزة دفينة في جميع الأوقات على الجليد. محاولة معالجة اللوزتين في أقرب وقت ممكن، وفي موعد لا يتجاوز 3 ساعات بعد الاستئصال الجراحي.
  3. وضع لوزة على 60 ملم خلية من البلاستيك لوحة الثقافة على الجليد والحفاظ على نسيج مبلل مع HBSS. إزالة جلطات الدم مرئية، الدهنية والأنسجة الضامة مع ملقط نظيفة من سطح وزة.
  4. استخدام جديدة 60 ملم لوحة خلية ثقافة تحتوي على 5 مل HBSS. قطع الأنسجة أجمة وزة إلى 3-10 ملم شظايا باستخدام زوج من مقص معقم و / أو مشرط.
  5. إعداد الجديدة 60 ملم لوحة الثقافة خلية تحتوي على 10 مل من HBSS ووضع 100 ميكرون البلاستيكية مصفاة خلية في حل HBSS.
  6. نقل ديسشظايا وزة ECTED في مصفاة الخلية مع ملقط معقم. باستخدام نهاية المكبس من حقنة بلاستيكية، ضغط بسلاسة شظايا الأنسجة من خلال مصفاة الخلية. تأكد من أن شظايا وزة مغمورة تماما في HBSS.
  7. تجاهل مصفاة الخلية التي تحتوي على بقايا الأنسجة ونقل تعليق الخلية الناتجة عن 60 ملم لوحة خلية ثقافة إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي البلاستيك. ترك الأنبوب على الجليد، مع مواصلة العمل خطوات 1.8 و 1.9.
  8. في حالة اللوزتين كبيرة، أكبر من 2 سم في حجم (الشكل 2)، ضغط على شظايا وزة في اثنين من مصافى الخلية لتجنب انسداد شبكة في مصفاة.
  9. الحصول على الحجم النهائي من 35 مل من تعليق الخلية.
    ملاحظة: في هذه الخطوة فمن الممكن لإعداد تعليق خلية لحفظ البرودة (انظر القسم 2).
  10. إضافة 10 مل من كثافة التدرج حل مثل Ficoll إلى الجديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي. تراكب بلطف suspens الخليةأيون (الخطوة 1.9) على رأس من الحل التدرج الكثافة. تجنب خلط تعليق خلية والحل التدرج الكثافة.
    ملاحظة: الحل التدرج الكثافة أن تكون درجة حرارة تصل إلى RT.
  11. الطرد المركزي تعليق خلية في الدوار سوينغ بها في 700 x ج لمدة 20 دقيقة في RT. لا تنشيط وظيفة الفرامل على أجهزة الطرد المركزي كما الكبح سريع قد يؤدي التدرج. أيضا، استخدام أقل وظيفة تسريع المتاحة في أجهزة الطرد المركزي.
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة الطرد المركزي، ومراقبة الشركات المتعددة الجنسيات باعتبارها طبقة رقيق أبيض في واجهة، وخلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)، الخلايا الليفية والحطام الخلية كما الرواسب في قاع الأنبوب.
  12. جمع بعناية طبقة الشركات المتعددة الجنسيات باستخدام 10 مل الماصة. ضع تعليق خلية في 50 مل جديد أنبوب الطرد المركزي.
  13. إضافة 25 مل من PBS الجليد الباردة إلى تعليق خلية وتدور الأنبوب في 300 x ج لمدة 5 دقائق في الدوار سوينغ بها في 4 درجات مئوية.
  14. إزالة طاف باستخدام الماصة 25 ملوكرر بيليه خلية خطوة الغسيل مرتين أخريين. أخيرا resuspend الكرية خلية في 15 مل من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: بعد الخطوة غسل النهائي، فمن الممكن أن cryopreserve تعليق الخلية (انظر القسم 2).
  15. تطبيق 10 ميكرولتر من تعليق خلية في الخلية عدادة الكريات غرفة عد وحساب عدد الخلايا تحت المجهر. الاستغناء عن كمية مناسبة من الخلايا (على سبيل المثال، 2-3 × 10 7) في أنبوب 15 مل الطرد المركزي لفصل لاحق حبة المغناطيسي. إبقاء هذه قسامة على الجليد حتى الخطوة 3.2.

2. الحفظ بالتبريد من الخلايا لوزي

  1. إعداد تجميد المتوسطة (90٪ FBS و 10٪ DMSO) ويبقيه على الجليد. للتخزين على المدى الطويل حفاظ على وسائل الإعلام تجميد في -20 ° C.
  2. تحديد العدد الكلي للخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا عدادة الكريات (الخطوة 1.15). حساب الكمية المطلوبة من المتوسط ​​تجميد وفقا لكثافة الخلايا المجمدة المطلوب (على سبيل المثال، 10 7 الخليةق / مل من تجميد المتوسطة).
  3. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق. صب طاف دون الإخلال بيليه الخلية و resuspend بيليه خلية في الجليد الباردة المتوسطة تجميد (من الخطوة 2.1).
  4. الاستغناء 1 مل aliquots من تعليق خلية في قارورة معقمة مصممة للتخزين على المدى الطويل في النيتروجين السائل. تجميد قارورة في غرفة الأيسوبروبانول وتخزينها في -80 درجة CO / N. للحفاظ على المدى الطويل نقل قوارير في النيتروجين السائل التي تحتوي على خزان أو -140 ° C الفريزر الخلية.
  5. لذوبان الجليد قارورة مع الخلايا المجمدة، تدفئة لهم بسرعة في 37 ° C حمام الماء. على الفور عند إذابة، تفريق تعليق خلية في 10 مل من قبل تحسنت HBSS (مع ملاحق، خطوة 1.1) في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تدور الأنبوب في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة HBSS و resuspend بيليه الخلية في كثافة الخلايا المطلوبة في HBSS (مع ملاحق، خطوة 1.1).
    ملاحظة: صلاحية AF الشركات المتعددة الجنسياتثالثا الذوبان هو من أهمية، حيث إن وجود الخلايا الميتة ويقلل من العائد النهائي من B تنقيته والخلايا اللمفية تي.
    ملاحظة: وفقا لتجربتنا في بقاء الخلية أقل من 80٪ ويقلل من كفاءة العزل الخلية.

3. إيجابي اختيار T الليمفاوية السكان من الشركات المتعددة الجنسيات لوزي

ملاحظة 1: يعتمد هذا البروتوكول على اختيار الإيجابية للالإنسان الخلايا الليمفاوية CD3 + T من الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية باستخدام الخرز المغناطيسي بالإضافة إلى الأجسام المضادة CD3. فمن الممكن أن يبدأ هذا القسم من جديد (القسم 1) أو المجمدة (القسم 2) الشركات المتعددة الجنسيات.

ملاحظة 2: ابدأ مع 3 × 10 7 الشركات المتعددة الجنسيات. لا تتجاوز هذا الرقم الخليوي، منذ الأعمدة الانفصال قد تسد وهذا سوف يقلل من كفاءة العزل. استخدام الأعمدة أكبر إذا كان سيتم التعامل مع أكثر من الخلايا. وحدات التخزين المستخدمة في هذا البروتوكول تم الأمثل تجريبيا لعدد من الخلايا لناإد في الإعداد التجريبية لدينا.

  1. إعداد المخزن المؤقت فصل [PBS (درجة الحموضة 7.2)، و 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 2 ملي EDTA]. تصفية المخزن المؤقت الانفصال من خلال 0.45 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. تدور تعليق الشركات المتعددة الجنسيات (الخطوة 1.14) في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. resuspend الكرية الناتجة الخلية في 240 ميكرولتر (80 ميكرولتر في 10 7 خلايا) من العازلة فصل الجليد الباردة. نقل تعليق الخلية في أنبوب معقم 2 مل.
  3. إضافة 20 ميكرولتر من CD3 الأجسام المضادة المغناطيسي لحل الخلية. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع الخلط المستمر لطيف للحفاظ على الخلايا في التعليق.
  4. نقل عن لتعليق الخلية في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل الجليد الباردة عازلة فصل لغسل الخلايا.
  5. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار سوينغ بها.
  6. وفي الوقت نفسه تعيين ما يصل الفاصل المغناطيسي والعمود. إرفاق فاصل المغناطيسي لموقف ووضع عمود في separator. غسل العمود من خلال تطبيق 500 ميكرولتر من العازلة فصل الجليد الباردة. تجاهل التدفق من خلال.
  7. وضع جديد أنبوب جمع 15 مل تحت العمود. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد.
  8. تجاهل طاف (الخطوة 3.5) من خلال الماصة و resuspend بلطف بيليه الخلية في 500 ميكرولتر العازلة الفصل. تطبيق تعليق خلية على رأس العمود قبل غسلها والسماح لها من خلال تشغيل.
    ملاحظة: كتل الخلية قد يعوق العمود، وبالتالي يقلل من معدل التدفق. لمنع حدوث هذه المشكلة، ضع مصفاة الخلية البلاستيكية 40 ميكرون على رأس العمود. سوف تمر الخلايا من خلال هذه الشبكة تحسن كبير في كفاءة هذا الأسلوب.
  9. غسل العمود 4 مرات مع 1.5 مل من العازلة الفصل (500 ميكرولتر لمدة 10 7 الخلايا). انتظر الخزان العمود ليكون فارغا (يجب أن يلاحظ أي السائل في العمود) قبل تطبيق الخطوة غسل المقبلة.
    ملاحظة: الحصول على الخلايا غير المسماة CD3، تعتبر اللمفاويات B جزء، كما هيمزال في أنبوب جمع.
  10. إزالة عمود من الفاصل والمكان إلى الجديد 15 مل أنبوب جمع. ماصة 2 مل من العازلة الفصل على العمود. باستخدام المكبس إمداده العمود أزل الخلايا الليمفاوية T اختيارها بشكل إيجابي، والتي تعتبر T اللمفاويات الكسر.
  11. تحديد عدد الخلايا تنقيته (الخطوة 1.15) إذا لزم الأمر. تعليق خلية جاهزة الآن للتجارب المصب.

4. تحليل التدفق الخلوي من سكان المناطق المعزولة لوزي B والخلايا اللمفاوية T

تنبيه: الحل لامتصاص العرق هو مهيج ويشتبه مسرطنة. ارتداء ملابس واقية مناسبة، والقفازات، وحماية العين / الوجه.

ملاحظة 1: يصف هذا البروتوكول طريقة لتلطيخ المباشر للمعزولة B والخلايا T بواسطة الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS) التحليل. والغرض الرئيسي من هذه الخطوة هو تقييم نقاء زنزانة انفرادية السكان AFثالثا CD3 فصل الأجسام المضادة المغناطيسي. لهذا الغرض B ثابتة وعلامات خلية T،-fluorophore مترافق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة CD20-FITC وCD2-APC، وتستخدم. كما ينصح بشدة إدراج الأجسام المضادة isotype السيطرة على التمييز بين "الخلفية" غير محددة ملزمة لCD2 وCD20 الأجسام المضادة (راجع الخطوة 4.8).

ملاحظة 2: من الممكن للحفاظ على الكسور خلية النقاء في امتصاص العرق 1٪ (PFA) حل في الظلام في 4 درجات مئوية حتى وقت تلطيخ (على سبيل المثال، في اليوم التالي). أيضا نفس الإجراء ينطبق إذا كان هناك فجوة زمنية بين تلطيخ وتحليل FACS. تذكر أنه في كلتا الحالتين يجب غسل الخلايا بشكل صحيح مع PBSA (PBS تحتوي على 0.2٪ BSA) العازلة، قبل تلطيخ أو تحليل FACS.

  1. اخراج 6 × 10 6 خلايا من الشركات المتعددة الجنسيات من الخطوة 1.15 (قبل تطبيق إلى العمود)، B اللمفاوية جزء من الخطوة 3.9 وT اللمفاويات جزء من الخطوة 3.10.
  2. تدور الخليةتعليق في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار سوينغ بها.
  3. إزالة طاف مع الماصة وغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 1 مل من الجليد الباردة PBSA. تدور تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف مع الماصة و resuspend الخلايا في 600 ميكرولتر من الجليد الباردة PBSA العازلة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أسفل أنبوب FACS.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10٪ الحرارة المصل البشري المعطل لكل أنبوب، وتخلط جيدا واحتضان ل~ 1 دقيقة في RT أو 20 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: الخلايا الليمفاوية B تحمل مستقبلات لكرة القدم. من أجل منع التيسير مستقبلات يتم تحضين الكسور خلية النقاء مع 10٪ الحرارة المصل البشري المعطل. المصل البشري الحرارة المعطل من قبل الحضانة عند 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تقسيم المعطل المصل الحرارة إلى قسامات الصغيرة ومخزن المجمدة في -20 ° C.
  6. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في جنوب غربالتدريجي جي الدوار.
  7. إزالة طاف مع الماصة وغسل الخلية بيليه مع 1 مل PBSA. كرر الطرد المركزي (300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية).
  8. إضافة 100 ميكرولتر PBSA في كل أنبوب على الجليد. إضافة كمية مناسبة من-fluorophore مترافق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، وفقا لتوصية الشركة الصانعة (على سبيل المثال، 20 ميكرولتر من مكافحة CD20 و / أو 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD2 في 100 ميكرولتر من PBSA). ملاحظة: لا تنس أن تعيين أنابيب سيطرة كافية لتحليل FACS. في هذا البروتوكول ينبغي أن تدرج الضوابط التالية: 1) الخلايا ملطخة مكافحة CD2 ومعاداة CD20 الأجسام المضادة بشكل فردي، 2) خلايا ملطخة مكافحة CD2 ومعاداة CD20 isotype السيطرة الأجسام المضادة بشكل فردي، و3) خلايا دون إضافة من الأجسام المضادة.
  9. لفترة وجيزة دوامة أنبوب واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  10. غسل 2 مرات مع PBSA. إضافة 2 مل من 1٪ PFA حل للعينات. دعونا لا تزال الخلايا في حل PFA في 476؛ C في الظلام حتى ذلك الوقت من تحليل FACS.
  11. مباشرة قبل تشغيل عينات في الجهاز FACS، وغسل الخلايا 2 مرات مع PBSA (300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية). عينات resuspend في 1 مل من برنامج تلفزيوني والحفاظ على 4 درجات مئوية (أو على الجليد)، محمية من الضوء، وذلك قبل فصل على قياس التدفق الخلوي.
  12. هل الفرز FACS بعد بروتوكول من تدفق الكريات الشركة المصنعة.

5. كشف PCR من اتش DNA في عزل وزي B والخلايا اللمفاوية T

ملاحظة 1: اتش الاشعال الجينات hexon هي AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') وAdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. هذه البادئات تخلق amplicon من 139 سنة مضت. ويمكن الكشف عن المضيف 18S الريباسي الجينات مع الاشعال tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') وtp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3). حجم amplicon المتوقع هو 300 سنة مضت.

ملاحظة 2: كل PCRيشمل المدى لمراقبة سلبية (المقطر H 2 O) والتحكم DNA الإيجابية التي تم الحصول عليها من خط الخلية B البشري (BJAB) مصاب نوع اتش البشري 5 12.

  1. استخراج الحمض النووي (من لا يقل عن 1 × 10 6 خلايا، خطوة 3.11) باستخدام غشاء السيليكا طريقة تنقية عمود أساس. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الفينول وغوانيدين ثيوسيانات حل 13.
  2. إضافة 100 نانوغرام DNA من B والخلايا اللمفية تي إلى خليط التفاعل التي تحتوي على 1X HF العازلة، 0.2 ملم من مزيج ثلاثي الفوسفات deoxynucleotide (dNTP)، 0.25 ميكرومتر لكل التمهيدي و1 U من عالية الدقة DNA البلمرة في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر.
  3. أداء PCR التضخيم في ظل الظروف الدراجات التالية: 30 ثانية تمسخ في 98 ° C، تليها 30 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 67 ° C (hexon) أو 58 ° C (18S الريباسي) لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. انتهت تفاعل PCR مع خطوة التمديد النهائي من 7 دقيقة عند 72 ° C.
  4. فصل الناتجة PCR amplifمنتجات ication على هلام الاغاروز 1.5٪ في 1X TBE العازلة وتصور العصابات التي يتوقعها تلطيخ مع وصمة عار الحمض النووي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في فصل فعال من نتائج الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية فى فئة العالية النقاء من الخلايا الليمفاوية B و T. هذا ما أكده تحليل FACS باستخدام مكافحة CD20 ومكافحة CD2 الأجسام المضادة للكشف B والخلايا اللمفاوية T السكان، على التوالي (الشكل 3A). في المقابل، وفصل غير الفعال للنتائج الشركات المتعددة الجنسيات في الكسور الخلية التي هي مزيج من الخلايا من كل من المجموعات السكانية الفرعية اللمفاويات B و T (الشكل 3B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من أهم العوامل التي تؤثر على نتائج هذا البروتوكول هو استخدام المواد اللوز الطازج كمادة البداية. ولذلك، ينبغي معالجة عينات وزة ضمن 3 ساعات بعد الجراحة. يمكن الحصول على اللوزتين من كل من البالغين والأطفال. المواد اللوزية من الأطفال هي عادة ما تكون أصغر بسبب الاستئصال الجراحي جزئية في اللوزتين (بضع اللوزة). ولذلك، فإن عددا من الشركات المتعددة الجنسيات الحصول عليها من عينات بضع اللوزة (1 × 10 7 -1 × 10 8) هو أقل مقارنة عينات استئصال اللوزتين (1 × 10 8<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل جمعية السرطان السويدية (11 0253 ، 13 0469) ، ومجلس البحوث السويدي (K2012-99X-21959-01-3) ، ومؤسسة ماركوس بورغستروم ومجلس البحوث السويدي من خلال منحة لمركز أبحاث الحمض النووي الريبي في أوبسالا (2006-5038-36531-16). نحن مدينون لمنشأة BioVis الأساسية في جامعة أوبسالا للحصول على الكثير من المساعدة في تحليل FACS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) جيبكو14175-053يحتوي على 5٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، 10 ملي مولار الجلوتامين ،     ؛ 0.05 مجم / مل جنتاميسين و 1٪ مزيج مضاد حيوي مضاد للفطريات
وسط تجميد90٪ FBS و 10٪ DMSO
MACS عازلةPBS (درجة الحموضة 7.2) ، 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA
PBSA & nbsp ؛تحتوي PBS على 0.2٪ BSA
PFAPBS تحتوي على 1٪ بارافورمالدهيد (PFA). اصنع طازجا. يشتبه في أن PFA مادة مسرطنة. ارتد القفازات والنظارات الواقية.
مزيج المضادات الحيوية ومضادات الفطرياتGibco15240-062
60 مم PetridishNunc150326
تشريح forecepsFisher Scientific1381241
مقص القزحية المستقيمة   ؛فيشر العلمية12912055
التي تستخدم لمرة واحدةSwann-MortonREF 0501
100 & م مصفاة الخلايا البلاستيكيةCorning Life Sciences352360
40 & mu ؛ م مصافي الخلايا البلاستيكية Corning Life Sciences352340
2 مل حقنة بلاستيكيةBD Biosciences 300185
15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةSARSTEDT62554502
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةSARSTEDT62547254
أجهزة طرد مركزي منخفضة السرعة مع دوار بزاوية ثابتة أو دلو متأرجحThermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll & ndash ؛ HypaqueSigma-AldrichF5415-50MLFicoll solution
مصل ربلة الساق الجنينيةالصناعات البيولوجية040071A
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)SIGMAD2650-5X5ML
MACS MS columns Miltenyi Biotec130-042-201
MACS البشرية CD3 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-092-881
فاصل MACS (Octo MACS)Miltenyi Biotec130-042-109
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Merck Millipore1120180100
EDTAAnalaR NORMAPUR20302.293
CD2 مترافق مع allophycocyanin ( CD2-APC) BD Biosciences 560642
CD20 مترافقا مع إيزوثيوسيانات الفلورسين (CD20-FITC)   ؛BD Biosciences 556632
مصل بشري روكلاند للكيماويات المناعيةD119-0100
فوسيون عالي الدقة DNA PolymeraseThermo ScientificF-530L
أنابيب FACSBD Falcon352003
CryotubeSARSTEDT72379
BD LSRII مقياس تدفق الخلاياBD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 softwareBD Biosciences 
Nucleospin Blood Macherey-Nagel740951.50طقم عزل الحمض النووي
TRIzol  كاشفتقنيات الحياة15596كاشف عزل الحمض النووي
مقياس الدممقياس الدم The Paul Marienfeld GmbH & Co. KGجهاز عداد الخلايا0610030
GelRedBiotium41003صبغة هلام الحمض النووي  
مشارط الريبي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD3 CD20

مقالات ذات صلة