يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل خلايا سيرتولي وPeritubular الخلايا من الفئران الخصية

22.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53389

⸱

فبراير 8, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Anatomie und Zellbiologie, Justus-Liebig-Universität Gießen, 2Institut für Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps-Universität Marburg

في هذه المقالة

ملخص

يرجى ملء الخلايا الأولية لدراسة سيرتولي-الخصية المناعة امتياز، نقل الإشارة أثناء التهاب أو عدوى، والاستفادة من خصائصها immunoprotective. نحن هنا وصف بروتوكول القائم على انزيم لعزل خلايا سيرتولي الأساسي العالية النقاء والخلايا peritubular من الخصيتين الفئران.

الملخص

الخصية، وبخاصة في الأمشاج الذكور، يتحدى نظام المناعة في طريقة فريدة من نوعها لالحيوانات المنوية متباينة تظهر لأول مرة في مرحلة البلوغ - بعد أكثر من عشر سنوات على إنشاء التسامح المناعي النظامية. الخلايا المنوية تعبر عن عدد من البروتينات التي يمكن أن ينظر إليها على أنها غير المتمتعة بالحكم الذاتي من قبل النظام المناعي. يجب أن تكون الخصية ثم قادرا على إنشاء التسامح لهذه المستضدات الجدد من جهة ولكن لا يزال قادرا على حماية نفسه من العدوى والتنمية الورم من جهة أخرى. لذلك الخصية هي واحدة من عدد قليل من المواقع المتميزة المناعة في الجسم التي تحمل مستضدات أجنبية دون إثارة استجابة مناعية التهابات ضارة. خلايا سيرتولي تلعب دورا أساسيا في المحافظة على هذه البيئة المتميزة المناعة الخصية وأيضا تطيل بقاء الخلايا cotransplanted في بيئة أجنبية. لذلك خلايا سيرتولي الأساسية هي أداة هامة لدراسة الامتياز المناعة الخصية التي لا يمكن أن تكون هاستبدال asily من خطوط الخلايا أنشئت أو نماذج الخلوية الأخرى. هنا نقدم بروتوكول مفصل وشامل لعزل الخلايا سيرتولي - والخلايا peritubular إذا رغبت في ذلك - من الخصيتين الفئران في غضون يوم واحد.

المقدمة

الخصيتين تنتج الأمشاج الذكرية والهرمونات الجنسية، أي الأندروجين. ويتكون الجهاز من قسمين. في حجرة الخلالي، التي تمثل حوالي 10-12٪ من إجمالي حجم الخصية 1، توليد الستيرويد يحدث داخل الخلايا ايديغ. تمثل مقصورة أنبوبي حول 60-80٪ من حجم الخصية (1) ويحتوي على خلايا الجرثومية ونوعين من الخلايا الجسدية - خلايا peritubular وخلايا سيرتولي. وينقسم الخصية بواسطة حواجز النسيج الضام إلى 250-300 الفصيصات، كل منها يحتوي على 1-3 الأنابيب المنوية الملتوية للغاية. ووضع هذه الأنابيب عن طريق الغشاء القاعدي، ورقة من الكولاجين، وطبقة كفافي الخلايا peritubular (الشكل 1A).

يقع ظهارة جرثومي على الجانب اللمعية من الغشاء القاعدي. خلايا سيرتولي هي الخلايا ممدود الكبيرة التي تمتد ظهارة جرثومي كاملة من الغشاء القاعدي إلى التجويف. هم بقوة توريآلم إلى الغشاء القاعدي وتشكيل ورقة الخلوية المستمر من خلال منعطفات ضيقة تنظيم basolateral حتى تسبب انسداد ظهارة جرثومي من الخلالي، ويمثل حاجز الدم في الخصية. خلايا سيرتولي لها إسقاطات وتداعيات التي تمكنهم من الحصول على اتصال المورفولوجية والوظيفية ضيق مع عدد أنواع محددة لكن المستمر للخلايا الجرثومية هيولي بارزة. مضاعفا الخلايا الجذعية جرثومي تتكاثر وتفرق في المني.

خلال الانقسام المنصف أنا باختصار عاش المنوية رباعي الصيغة الصبغية يتم إنشاؤها التي تنمي إلى أربع نطفة أرومية فرداني أثناء الانقسام الاختزالي الثاني. مترابطة جميع الخلايا الجرثومية التي كتبها الجسور هيولي بحيث تشكل شبكة الخلوي. الحدث الرئيسي خلال نضوج نطفة أرومية هو قذف أجزاء كبيرة من السيتوبلازم، وتشكيل الهيئات المتبقية، في عملية تسمى النطاف. والمبتلعة الهيئات المتبقية من الخلايا سيرتولي. ثم يتم الافراج نطفة أرومية في وقت متأخر إلىتجويف أنبوبي ونقلها إلى البربخ لمزيد من النضج. تظهر خلايا سيرتولي والخلايا الجرثومية لتنسيق الحيوانات المنوية متبادل الطوبوغرافي وظيفيا.

إعداد أنواع الخلايا الخصية الفردية بدأ منذ قرن تقريبا عندما تم الانتهاء من زراعة قطع الخصية الصغيرة وأنواع الخلايا التعرف بواسطة المجهر 2. عن طريق تشريح دقيق للالأنابيب بعد فتح الغلالة البيضاء الغلالة باستخدام ملقط غرامة الرؤوس كان من الممكن في وقت لاحق لفصل أنبوبي ومقصورات الخلالي 3. في عام 1975 قدم ويلز وWiebe العلاج كولاجيناز من أجل تحرير الأنابيب من الانضمام النسيج الخلالي والعلاج البنكرياتين لإزالة الخارجية خلية طبقة peritubular 4. في وقت مبكر من على الفئران غير ناضجة الشباب (حوالي 20 يوما) استخدمت في والتي تتكون من خلايا سيرتولي جزء كبير من السكان خلية أنبوبي لأن الحيوانات المنوية لم تبدأ بعد. في هذا العصر الفئران سرتتتوقف خلايا اولى لتقسيم، وتشكل منعطفات ضيقة بين الخلايا المجاورة بحيث يتم إنشاء حاجز الدم في الخصية 5.

المستقلة الويلزية وWiebe Dorrington وآخرون. وعرض مجموعة من التربسين وديوكسي ريبونيوكلياز تليها المانع soybeen التربسين والعلاج كولاجيناز التي نشرت في نفس العام 6. يستخدم كلا الفريقين أيضا قوة ميكانيكية (رسم شظايا أنبوبي هضمها مرارا وتكرارا من خلال إبرة حقنة أو ماصة باستور على التوالي) من أجل إنتاج تعليق خلية متجانسة لطلاء يحتوي على ما يقرب من 70٪ خلايا سيرتولي. بعد 3 أيام في الثقافة، وذلك باستخدام وسيلة التي هي خالية من الدم، والنسبة المئوية للخلايا سيرتولي تزيد إلى ما يقرب من 90٪. ويمكن أن يعزى ذلك إلى حد كبير إلى وفاة تلويث الخلايا الجرثومية. خلايا peritubular المتبقية (PTCs)، ومع ذلك، يبقى بإحكام عبر مصفوفة من خارج الخلية. PTCs، ولكن ليس على الخلايا سيرتولي، ومن المعروف أن إنتاجفبرونيكتين التي يمكن أن تكون بمثابة البروتين علامة لتقدير التلوث مع PTCs. لذلك، تونغ وآخرون. معللا بأن العلاج هيالورونيداز إضافية قد تؤدي إلى تحسين نقاء الخلية جزء سيرتولي 7. في الواقع أنها يمكن أن تظهر أن علاج إضافي تمكنت من الحد من التلوث PTCs ما يقرب من 20 أضعاف، الذي يصبح واضحا بشكل خاص عند مقارنة يستخدم المتوسطة المحتوية على مصل لزراعة خلايا سيرتولي تنقيته. ومنذ ذلك الحين على إجراء تحسين تونغ وآخرون. أصبح بروتوكول السائد، وكان يستخدم على نطاق واسع من قبل المجموعات الرئيسية الأخرى في مجال 8 (الشكل 1B).

خلال فترة العلاج كولاجيناز يتم الافراج عن غالبية PTCs، ويمكن أن تكون معزولة بالتوازي مع خلايا سيرتولي. في حين أن PTCs تتكاثر بقوة ولا تستجيب لمنبه الجريب هرمون (FSH)، وخلايا سيرتولي لا تخضع الانقسام بعد الآن، ويستجيب لهرمون FSH من تغيرات شكلية مميزةوزيادة في أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم) تركيز 9. تشبه بروتوكولات الهضم الأنزيمية يمكن أن تستخدم لعزل الخلايا سيرتولي الأولية من الحيوانات الأخرى مثل الرجل 10، والماوس 11،12، سيبيريا الهامستر 13 أو الياك 14. لإزالة كميات كبيرة من تلويث الخلايا الجرثومية صدمة ناقص التوتر يمكن استخدامها في نهاية إجراء العزل 15. وهذا يسمح أيضا عزل كفاءة الخلايا سيرتولي من الفئران الكبار الخصيتين 16. ويمكن أيضا تعليق خلية سيرتولي المخصب يمكن فصلها عن الخلايا الجرثومية التي طلي تعليق على أطباق كتين المغلفة مع جوز ماثل راصة 17. فقط خلايا سيرتولي وعدد قليل من PTCs المتبقية تلتزم لوحات كتين.

مزارع الخلايا الأولية سيرتولي، ومعظمهم من الفئران، وقد استخدمت في البداية عن التحقيق في الاستجابة للهرمونات أو إنشاء خطوط الخلايا مثل الخلايا لى الماوس سيرتوليشمال شرق TM4 18. وقد تم التحقيق هذا الخط خلية في أكثر من مائة الدراسات حتى اليوم. في نهج متعدية استخدمت خلايا سيرتولي لالمناعية حماية الخلايا والأنسجة كما في المشترك زرع الجزر البنكرياسية xeno- أو خيفي للبقاء الكسب غير المشروع على المدى الطويل المشترك مثقف دون كبت المناعة النظامية 19. وقد استخدمت خلايا سيرتولي معزولة أيضا في التجارب ثقافة مشتركة لدراسة الظهارية-الوسيطة (خلايا سيرتولي - PTCC) وخلية جسدية من الجراثيم (خلايا سيرتولي - خلايا الجرثومية) التفاعلات 20 و 21. وقد استخدمت خلايا سيرتولي الابتدائية مؤخرا للتحقيق في التعبير عن مستقبلات تول مثل وإفراز السيتوكينات proinflammatory فضلا عن شلالات نقل الإشارة مما يؤدي إلى خلوى التعبير بعد الإصابة ببكتريا غير ممرض وuropathogenic القولونية 22. تحقيقات أخرى الأخيرة كانوا يستخدمون خلايا سيرتولي لدراسة ص المناعة الخصيةrivilege 23 وأظهرت أن هرمون التستوستيرون ما قبل المعالجة يقمع استجابة الناجمة عن LPS التهابات 24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان 1. أخلاقيات الحيوان

وقد أجريت تجارب الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية للRegierungspräsidium جيسن، ألمانيا، بوصفها السلطة المحلية وتأكيد على قانون الألماني من الممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات لأغراض التجريبية (إذن لا: GI 20/23 العدد و31 / 2012).

2. إعداد وسائل الإعلام، حلول أنزيم والحيوانات

  1. إعداد 1٪ اليود الكحول عن طريق إذابة 1 غرام من اليود في 100 مل ايثانول.
  2. إعداد 2X 500 مل Dulbecco's الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ تستكمل كل مع 7.5 مل مد الجلوكوز (100 غرام / لتر) و 5 مل 100X البنسلين / الستربتوميسين حل سهم (15 ملغ / مل D -glucose، 50 U / مل البنسلين و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين النهائي).
  3. الملحق 1X 500 مل روزويل معهد حديقة النصب التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة مع 5 مل 100X البنسلين / الستربتوميسين حل سهم (50 U / مل البنسلين و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين زعنفةآل).
  4. إعداد وأنا حل التربسين الدناز (2.5 ملغ / مل التربسين و 10 ميكروغرام / مل الدناز الأول) وذلك بإضافة 25 ملغ التربسين و 0.1 مل الدناز الأول (1 ملغ / مل الدناز الأول) إلى 9.9 مل برنامج تلفزيوني.
  5. حل 50 ملغ التربسين المانع في 5 مل برنامج تلفزيوني لمدة التربسين المانع حلا (10 ملغ / مل). حل 25 ملغ التربسين المانع في 10 مل برنامج تلفزيوني لمدة التربسين حل المانع ب (2.5 ملغ / مل).
  6. للحصول على حل كولاجيناز-هيالورونيداز-ديوكسي ريبونيوكلياز الأول (الدناز الأول) حل 10 ملغ كولاجيناز ألف (النهائي 1 ملغ / مل)، و 10 ملغ هيالورونيداز (1 ملغ / نهائي مل) و 0.1 مل الدناز الأول (1 ملغ / مل الدناز I) ( 10 ميكروغرام / مل النهائي) في 10 مل برنامج تلفزيوني.
  7. إعداد هيالورونيداز الدناز أنا حل عن طريق إضافة 10 ملغم هيالورونيداز (1 ملغ / مل النهائي) و 0.1 مل الدناز الحل الأول (1 ملغ / مل) (10 ميكروغرام / مل النهائي) إلى 9.9 مل برنامج تلفزيوني.
  8. طلب الفئران ويستار في الوقت المحدد بحيث تكون 19 يوما من العمر في يوم من العزلة خلية سيرتولي.
    ملاحظة: تم تصميم بروتوكول الموصوفة لمدة 10 الفئران ولكن يمكن تعديل مدة لا تقل عن 5 وبحد أقصى 20 الفئران.كميات من جميع الحلول لا بد من تعديلها وفقا لذلك.
  9. إعداد النفط الأحمر يا حل الأسهم عن طريق إذابة 0.35 ز النفط الأحمر O في 100 مل الأيزوبروبانول. ضجة O / N، تصفية من خلال 0.2 ميكرون وتخزينها في RT لمدة تصل إلى واحد.
  10. إعداد النفط الأحمر يا حل تلطيخ عن طريق خلط 6 مل زيت الأحمر يا حل الأسهم مع 4 مل من الماء (3: 2). بعد 10-20 دقيقة مرشح من خلال 0.2 ميكرون. استخدام داخل ساعة القادمة 2.
  11. إعداد 4٪ (ث / ت) حل الفورمالديهايد في غطاء التهوية بإضافة 4 غرام من مسحوق امتصاص العرق (PFA) إلى 80 مل من برنامج تلفزيوني 1X مع التحريك بلطف. الحرارة إلى ~ 60 درجة مئوية، إضافة 1 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم ويستمر التحريك حتى يذوب امتصاص العرق. اسمحوا الحل يبرد إلى RT، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك وحجم 100 مل مع برنامج تلفزيوني 1X. تصفية حل (0.45 ميكرون)، واستخدام طازجة أو مخزن في aliquots في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
    ملاحظة: مبلمر الفورمالديهايد (PFA) depolymerizes إلى الفورمالديهايد أحادى في الماء. هذه العمليةيحفزه التدفئة المعتدلة ودرجة الحموضة القلوية. إعداد جميع الحلول انزيم الطازج وتصفية تعقيم (0.2 ميكرومتر) منهم في يوم من الاستخدام. إذا كان الصانع مختلفة لانزيم (انظر المواد / المعدات الجدول) يستخدم، وضبط بعناية في تركيز / النشاط.
    في البروتوكول التالي ل"ماصة" لتقف على ماصة المصلية.

3. إعداد المنوية الأنابيب الصغيرة

  1. تخدير 10 فئران ويستار الذكور واحدا تلو الآخر في مجفف باستخدام ثاني أكسيد الكربون (2) ومعدل التدفق الذي يزيح لا يقل عن 20٪ من حجم الغرفة في الدقيقة الواحدة. الانتظار حتى يتوقف التنفس، واختبار التخدير عن طريق الضغط على وسادة القدم، وإذا لم يكن هناك رد فعل الموت ببطء كل ​​فأر خلع عنق الرحم. استنزاف الدم عن طريق باجتزاء حبل الوريد والشريان السباتي (السباتي المهبل) تحت المياه المتدفقة. تطهير البطن من قبل القضاء مع 70٪ من الإيثانول.
  2. باستخدام ملقط رفع الجلد من المصحف في البطنجسيمات وقطع بيضاوي الشكل الفص الجلد التي تمتد من الارتفاق العانة إلى القص (الشكل 2A) ورفرف لأعلى على صدره. التالي، والاستيلاء على عضلات البطن وجعل شق وسطي من الارتفاق العانة إلى القص.
    1. الضغط على البطن مع الابهام من الحوض إلى الأعلى من أجل دفع الخصيتين خارج الحوض السفلي. اختيار لوحة بربخي الدهون (الشكل 2B) مع ملقط لسحب ما يصل الخصية أبعد من ذلك. قطع الحبل المنوي (الشكل 2B)، وترك الغلالة البيضاء الغلالة سليمة، وجمع كل الخصيتين في 20 مل برنامج تلفزيوني في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل (الشكل 2C).
  3. بعد جمع كل الخصيتين، وتطهير لهم بإضافة حجم مساو (20 مل) من 1٪ (ث / ت) اليود في الإيثانول. عكس الأنبوب مرتين وصب طاف على الفور. يغسل بسرعة الخصيتين مرتين مع 25 مل PBS كل (الشكل 2D).
  4. نقل الخصيتين إلى طبق بتري يحتوي علىجي 15 مل برنامج تلفزيوني (الشكل 2E). فهم كل الخصية بحزم بواسطة ملقط في نهاية واحدة، وجعل شق صغير في الغلالة البيضاء الغلالة في الطرف المقابل، واخراج الأنابيب باستخدام شفرات مقص مغلقة كأداة تجريف.
    ملاحظة: يجب أن الأنابيب لا تزال تشكل المدمجة حزمة على شكل الخصية مع وجود عدد قليل من الأنابيب تمتد إلى حل من أجل تمكين الهضم الأنزيمي متجانسة (الشكل 2F).
  5. نقل الخصيتين-كبسولات دي لزجاجة 100 مل المسمار الحد الأقصى تحتوي على 10 مل التربسين الدناز أنا حل. أداء عملية الهضم في حمام مائي تهتز عند 32 درجة مئوية (120 التذبذبات / دقيقة). بعد 4 دقائق تقييم الأنابيب بالعين المجردة لتشتت من الأنابيب. وبمجرد أن تبدأ الأنابيب لتفريق في الحل، ووقف عملية الهضم على الفور. إذا لزم الأمر، ومواصلة حضانة لمدة تصل إلى 2 دقيقة.
  6. وقف الهضم التربسين بإضافة 5 مل من مثبط التربسين حل A. مزيج دقيق الحل بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرةق باستخدام ماصة 10 مل وتحويلها إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  7. بعد 5 دقائق من الحضانة مراقبة الأنابيب تسوية عن طريق وحدة الجاذبية، وإزالة بعناية طاف باستخدام ماصة 10 مل من الخطوة 3.6 وإضافة 10 مل من مثبط التربسين حل B من أجل وقف تماما التربسين الهضم. Resuspend والأنابيب التي pipetting صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
  8. من أجل إزالة تلويث الخلايا الخلالية غسل الأنابيب 9 ​​مرات مع 25 مل PBS لكل منهما. و resuspend الأنابيب في كل غسل باستخدام ماصة 25 مل، وتمكينهم من الاستقرار من قبل وحدة الجاذبية لمدة 10 دقيقة. دائما استخدام نفس 25 مل ماصة للpipetting لبرنامج تلفزيوني، إعادة تعليق وإزالة طاف.

4. إزالة / عزل الخلايا Peritubular (PTCs)

  1. نقل جميع الأنابيب إلى 100 ​​مل زجاجة المسمار الغطاء وإضافة لي حل كولاجيناز-هيالورونيداز الدناز (الشكل 3A). أداء الهضم لمدة 10 دقيقة في حمام مائي تهتز عند 32 درجة مئوية (120 التذبذبات / دقيقة).
  2. الماصة قطرة من تعليق على شريحة زجاجية وسرعان ما تحقق من الأنابيب تحت المجهر الضوئي مقلوب لزراعة الخلايا الروتينية في التكبير 100X. إذا الهضم ليس متطورا بما فيه الكفاية مواصلة حضانة إضافي 2 دقيقة (لا تعول على الوقت اللازم للفحص المجهري).
    ملاحظة: خلال هذه الخطوة الحصول على تقصير جميع الأنابيب في طول وأنبوب صغير حواف ينبغي أن تصبح خشنة (الشكل 3B و C). حواف خشنة تدل من أجل الإفراج عن خلايا peritubular.
  3. نقل تعليق مع الأنابيب هضمها إلى 50 مل أنبوب مخروطي باستخدام ماصة 25 مل من الخطوة 3.8. غسل زجاجة 100 مل مع 10 مل برنامج تلفزيوني وإضافته إلى الأنابيب في أنبوب مخروطي الشكل. تسمح الأنابيب هضمها ليستقر قبل وحدة الجاذبية لمدة 10 دقيقة، وبعناية نضح طاف، التي تحتوي على PTCs، وذلك باستخدام ماصة 25 مل مرة أخرى، وتحويلها إلى أنبوب مخروطي الشكل الجديد. لتطلع ملليلتر القليلة الماضية استخدام ماصة 5 مل في أورديr لمنع أي المرحل من الأنابيب.
  4. إضافة 20 مل المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) إلى supernatants أنبوب صغير جمع وخلط وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT دون استخدام نهاية الشوط الاول.
  5. بعناية صب طاف و resuspend PTCs مكعبات في 20 مل المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع FBS الحرارة المعطل 10٪ والبذور 4 مل لكل منهما على خمس قوارير T75 التي تحتوي على 16 مل المتوسطة لكل منهما. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي (الشكل 4A).
  6. في يوم 3 الثالثة والثقافة يعرض للتريبسين PTCs وتقسيمها 1: 2 على قوارير T75 التي تحتوي على 16 مل المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع FBS الحرارة المعطل 10٪ لكل منهما (غلة 10 قوارير تماما) (الشكل 4B). تستمر الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  7. في يوم 5 تشرين الثقافة يعرض للتريبسين PTCs مرة أخرى ولوحة منها على 6 جيدا أو 24 جيدا لوحات اعتمادا على التجربة(واحد قارورة T75 في لوحة). لا يمكن أن يؤديها التجارب في يوم 6.

5. عزل الخلايا سيرتولي (المنبوذة)

  1. Resuspend والأنابيب استقر من الخطوة 4.3 بدقة في 25 مل من برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة 25 مل، وتمكينهم من الاستقرار من قبل وحدة الجاذبية لمدة 12 دقيقة. استخدام نفس ماصة 25 مل لpipetting لبرنامج تلفزيوني، إعادة تعليق من الأنابيب وإزالة supernatants. تكرار غسل 3 مرات (4 يغسل في المجموع).
  2. بعد نقل غسل الماضي الأنابيب هضمها إلى 100 مل آخر المسمار غطاء زجاجة تحتوي على حل هيالورونيداز الدناز أنا. أداء عملية الهضم في حمام مائي تهتز عند 32 درجة مئوية (120 التذبذبات / دقيقة).
  3. بعد 5 دقائق فحص الأنابيب مرة أخرى عن طريق التفتيش المجهري الضوء في التكبير 100X كما هو موضح في الخطوة 4.2.
    ملاحظة: الأنابيب القصيرة، وحدات أنبوبي وخلايا صدر يجب أن يكون مرئيا (الشكل 3D).
    1. السماح للمجاميع أنبوبي تستقر لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف بناجي ماصة 25 مل. غسل تبلغ 4 مرات باستخدام 25 مل برنامج تلفزيوني ووقت الترسيب من 10 دقيقة لكل خطوة الغسيل (الشكل 3E).
  4. إضافة 20 مل من RPMI 1640 المتوسطة وتمرير تعليق 10 مرات من خلال إبرة 18 G التي شنت على حقنة 20 مل. تجنب فقاعات الهواء.
    ملاحظة: سحب تعليق الدخول والخروج من خلال يعتبر الإبرة كما تمريرة واحدة. تعطل وتجانس الخلايا عن طريق القص الهيدروديناميكية هو أسلوب قياسي في إعداد الخلايا التي تتجه للتجمع. وفاة الخلايا من خلال إبرة تحت الجلد من داخل القطر الصغير من غير المرجح أن يكون لها تأثير على الخصائص الوظيفية 25. ويبين الشكل 5C وD التركيب الدقيق الطبيعي للخلايا سيرتولي تنقيته في يوم 4 من الثقافة.
    1. الماصة قطرة من تعليق على شريحة زجاجية والتحقق من الأنابيب تحت المجهر ضوء مقلوب لزراعة الخلايا الروتينية في 10X التكبير إذا كان AGG بسرعةوفرقت regates عن (الشكل 3F). تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر من أجل الحصول على تعليق خلية واحدة النقي في الترشيح.
  5. أجهزة الطرد المركزي الراشح من الخطوة 5.4 في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في RT دون استخدام نهاية الشوط الاول. نضح بعناية طاف باستخدام ماصة 25 مل، و resuspend الخلايا سيرتولي في 40 مل المتوسط ​​1640 RPMI (المصل خالية).
  6. مزيج 100 تعليق خلية ميكرولتر مع 100 ميكرولتر من التريبان الأزرق وصمة عار وعدد الخلايا مع غرفة تحسين نويباور. ضبط تركيز الخلية إلى 3 × 10 6 خلية / مل وفقا لنتيجة الفرز. البذور 1 مل لكل بئر على طبق من 6 جيدا (= يوم 1). إذا تم التخطيط لنفط الأحمر يا تلطيخ (الخطوة 6) وضع انزلاق الغطاء في واحد أو عدد قليل من الآبار قبل بذر خلايا سيرتولي.
    ملاحظة: خلايا سيرتولي في تعليق تستقر بسرعة بحيث الأنبوب يجب أن تهتز لفترة وجيزة في كل مرة قبل اتخاذ قسامة الخلايا مع ماصة. حتى يوم 4 أنها بحزم توريمنظمة العمل ضد الجوع إلى التحتية.
  7. من أجل إزالة العائمة أو ملتصقة الخلايا الجرثومية في يوم 4 (الشكل 4C) غسل كل بئر من 6 لوحات جيدا تستخدم لطلاء الخلايا سيرتولي معزولة (الخطوة 5.6) مع برنامج تلفزيوني (الشكل 4D). نضح المتوسطة، إضافة 1-2 مل من برنامج تلفزيوني على كل بئر ويهز 6 لوحات جيدا أفقيا على طاولة بقوة ولكن من دون إراقة برنامج تلفزيوني. تكرار غسل 3 مرات وتنفيذ الإجراء غسل نفسه في يوم 5 و 6 (الشكل 4E).
    ملاحظة: في يوم 4 خلايا سيرتولي قد ترتبط بقوة وتظهر الحصوه مثل نمط تحت ضوء مجهر مقلوب (الشكل 4C). تجارب لا يمكن أن يؤديها من يوم 7 فصاعدا.
    1. (البديل لخطوة 5.7) لإزالة العائمة والخلايا الجرثومية ملتصقة أداء صدمة ناقص التوتر بعد البذر على 6 لوحات جيدة 3 أيام. إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 مأخوذة مباشرة من الثلاجة. نضح العازلة تريس بعد 90-120 ثانية ولكن ليسفي وقت لاحق. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل من المتوسط ​​1640 RPMI (المصل خالية). اختياريا، إجراء تجارب في اليوم التالي.
      ملاحظة: أطول مدة من الصدمة ناقص التوتر هي الخلايا الجرثومية أكثر يمكن إزالتها إلا أن خلايا سيرتولي المزيد تضيع أيضا. يجب أن يتم تنفيذ أول برنامج تلفزيوني يغسل بسرعة ولكن بعناية لكي لا تحل أي خلايا سيرتولي. مباشرة بعد العلاج ناقص التوتر العديد من الفجوات من أحجام مختلفة ويمكن ملاحظة في السيتوبلازم بواسطة المجهر النقيض من المرحلة. فجوات تختفي في غضون ساعات قليلة بعد العلاج ناقص التوتر.

6. النفط الأحمر يا تلطيخ

  1. تنفيذ جميع الخطوات في RT. في يوم 7 غسل خلايا سيرتولي نمت على زلة غطاء (الخطوة 5.6) مع برنامج تلفزيوني مرتين واصلاحها مع 10٪ من الفورمالين في برنامج تلفزيوني. بعد 10 دقيقة استبدال الفورمالين مع حل جديد، ومواصلة التثبيت لمدة 60 دقيقة أخرى.
    ملاحظة: تضاف جميع الحلول إلى البئر (s) مع زلة غطاء ويستنشق قبل الخطوة التالية.
  2. نضح الفورمالين، وغسل الخلايا مع الماء مرتين وإضافة 60٪ الأيزوبروبانول. بعد 5 دقائق تسمح للخلايا في الهواء الجاف لبضع دقائق.
  3. إضافة 1 مل زيت الأحمر يا حل تلطيخ لكل بئر واحتضان لمدة 10 دقيقة. نضح الحل، وغسل خلايا فورا 4 مرات بالماء وجبل غطاء ينزلق في الجلسرين-برنامج تلفزيوني (9: 1). التقاط صور الحقل مشرقة مع مجهر الضوء الروتيني (الشكل 4F).

7. المناعي تلطيخ

  1. غسل PTCs (من الخطوة 4.5) أو خلايا سيرتولي (من الخطوة 5.5) نمت على زلة غطاء مع برنامج تلفزيوني مرتين واصلاحها مع PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في RT.
  2. احتضان مع 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT. تجاهل الحل BSA-برنامج تلفزيوني وإضافة جديدة حل جيش صرب البوسنة PBS تحتوي على الأكتين (العضلات الملساء) (للPTCs) أو فيمنتين (للخلايا سيرتولي) الأجسام المضادة الأولية (التخفيف 1: 100 لكل من الأجسام المضادة)، واحتضان عند 4 درجة CO / N.
    ملاحظة: الحضانة مع كتل BSA غير محددة ملزمة من الأجسام المضادة الأولية.
  3. غسل غطاء ينزلق 3 مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 0.1٪ توين 20 واحتضان مع صبغة اللون الأخضر فلوري مترافق الماعز المضادة للماوس الضد الثانوية (تخفيف 1: 1000) في RT لمدة 1 ساعة في الظلام.
  4. غسل غطاء ينزلق 3 مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 0.1٪ توين 20 و جبل لهم في دابي المتوسطة المتزايدة.

8. تحليل التركيبية

  1. غسل الخلايا سيرتولي (من الخطوة 5.6) نمت على طبق ثقافة الخلية 6 سم مع برنامج تلفزيوني واصلاحها لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية في مزيج من 2.5٪ غلوتارالدهيد، 2.5٪ امتصاص العرق وحمض البكريك 0.05٪ في 67 عازلة كاكوديلات ملي ( ودرجة الحموضة 7.4) وفقا لايتو وKarnovsky 26.
  2. أداء بعد تثبيت في 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم تليها O / N الحضانة في 0.3٪ خلات اليورانيل المذاب في 50 ملي العازلة ماليات (الرقم الهيدروجيني 5). عينات تضمين في دمج وسائل الإعلام وفقا للاجراءات المتبعة. قطع الشرائح الرقيقة، وعلى النقيض منهم مع سترات الرصاص ودراسة باستخدام المجهر الإلكتروني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الإجراء الموضح يسمح عزل حوالي 12 × 10 7 خلايا سيرتولي من 10 الخصيتين الفئران. ومطلي 3 × 10 6 خلايا لكل بئر على طبق من 6 جيدا بحيث تكون ستة إلى سبعة 6 لوحات جيدة متاحة للتجارب في يوم 7. الهضم التربسين الدناز أنا هو الخطوة الأكثر أهمية خلال العزلة خلية سيرتولي. إذا الهضم في هذه المرحلة تتقدم كثيرا، نسبة الخلايا الجرثومية / خلايا سيرتولي سيزيد بشكل غير متناسب حتى النهاية. خلال يوم 06/03 من الثقافة من المهم أن تغسل بعناية بع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تحد الأنابيب المنوية طبقة دائرية من الخلايا المحيطة بالأنبوب وصفيحة قاعدية على الجانب اللمني. تستقر خلايا سيرتولي على الصفيحة القاعدية ، وتؤسس حاجز الخصية الدموية من خلال تكوين وصلات مسدودة بين الخلايا المجاورة وتوفر الإطار الهيكلي لتنظيم الظهارة المنوية. تحافظ خلايا سيرتولي والخلايا المنشأة على المنوية المجاورة على اتصالات حميمة طوال نمو الخلايا الجرثومية مما يوفر الاتصال الجسدي والتواصل على حد سواء. لذلك ، عندما يتم عزل خلايا سيرتولي باستخدام الإجراء الموضح هنا ، فإنها تحرم من اتصالاتها الحميمة بالخلايا المجاورة PTCs و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر غيدو فرهوفن وودو Deboel، لوفين، الذين كانت مفيدة للغاية في إقامة عزل الخلايا سيرتولي الأولية في المختبر مينهاردت في جيسن. مونيكا Fijak، جن، اعترف لمساعدتها مع الرقم 1A والمشورة. تم دعم الدراسات التي الألمانية للبحوث من خلال منحة BH 93 / 1-1 (SB) وتمويل الدولي كلية بحوث الدراسات العليا JLU جيسن (ألمانيا) / جامعة موناش (ملبورن، أستراليا) GRK 1871 (SB). تم الحصول على دعم أيضا من منحة من الدولة هيسن ضمن برنامج "لاندز الهجومي زور ENTWICKLUNG Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) تسمى "Männliche Infertilität باي Infektion وEntzündung" (MIBIE).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
استنساخ الأجسام المضادة للأكتين (العضلات الملساء) 1A4DakoM0851فأر أحادي النسيلة مضاد للجسم المضاد للإنسان.
استخدم تخفيف 1: 100 للتألق المناعي.
جزء الألبومين البقري V
درجة قياسية ،		Serva11930.04المجفف بالتجميد (0.45 & micro ؛ م) محاليل BSA المستخدمة للتألق المناعي.
مصافي خلية كورنينج 70  ومايكرو. مكورنينج431751اللون الأبيض
كولاجيناز أ من المطثية هيستوليتيكوم< / em>Roche10103586001
DAPI mountant ProLong Gold AntifadeLife تقنياتP-36931
D-glucoseSigmaG8644100 جم / لتر
Dulbecco & حاد; s PBS بدون Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup>Gibco14190-094
DNase IRoche10104159001
المجهر الإلكترونيZeissEM 109S
مجهر مضانZeissAxioplan 2
Hyaluronidase من الخصية البقريةSigmaH3506
الضوء المقلوب مجهرأوليمبوسCKX41مجهر ثقافة الخلايا الروتينية
الماوس IgG / IgM (H + L) متعدد النسيلة
الجسم المضاد الثانوي   ؛		Life technologiesA-10684Alexa Fluor 488 Conrupgate
Oil Red OSigmaO0625حلت محل السودان الثالث والسودان الرابع بسبب اللون الأكثر إشراقا.
بارافورمالديهايدسيجماP6148
البنسلين (5,000   U / ml) /
Streptomycin (5,000 & micro; جم / مل)		جيبكو15070-063محلول 100x
RPMI-1640Gibco21875-034يحتوي على 300 مجم / لتر L-glutamine
Trypsin من بنكرياس الخنازيرSigmaT5266
Trypan Blue Stain (0.4٪)Gibco15250-061
مثبط التربسين من فول الصوياSigmaT6522منتج Sigma أرخص بكثير من منتج
BPTI (Aprotinin) المستخدم سابقا من Roche.
الجسم المضاد Vimentin (V9)SigmaV6630الفأر أحادي النسيلة المضاد للخنازير فيمنتين.  استخدم التخفيف 1:100 للتألق المناعي.
أن يكون عمر فئران Wistar WU نهرتشارلز 19 يوما في يوم التجربة.
مرشح يجب

المراجع

  1. Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
  2. Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
  3. Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
  4. Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
  5. Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
  6. Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
  7. Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
  8. Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
  9. Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
  10. Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
  11. Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
  12. Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
  13. Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
  14. Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
  15. Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
  16. Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
  17. Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
  18. Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
  19. Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
  20. Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
  21. Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
  22. Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
  23. Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
  24. Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
  25. Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229(2012).
  26. Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
  27. Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
  28. Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
  29. Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
  30. Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
  31. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
  32. Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
  33. Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عزل الخلاياالهضم الإنزيميتريبسيندي إن إيز 1كولاجينازهيالورونيدازالوسم المناعيزراعة الخلاياصبغ الفيمينتين
عزل خلايا سيرتولي وPeritubular الخلايا من الفئران الخصية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.