عالية الدقة الكمي للسلوك رائحة الموجهة في ذبابة الفاكهة السوداء البطن استخدام Flywalk بارادايم

Summary

يتم استخدام الآلية Flywalk نظام تتبع عالية الدقة الكمي للسلوك موجهة رائحة ذبابة الفاكهة في البطن.

Abstract

في بيئتها الطبيعية، والحشرات مثل الخل تطير ذبابة الفاكهة السوداء البطن مع قصف على كمية كبيرة من عطور متميزة كيميائيا. إلى تعقيد الأمور أكثر من ذلك، والروائح الكشف عنها من قبل الجهاز العصبي للحشرات هي عادة ليست واحدة بل خليط من المركبات تركيبتها ونسب تركيز تختلف. وهذا يؤدي إلى مبلغ لا نهائي تقريبا من المحفزات الشمية المختلفة التي يجب تقييمها من قبل الجهاز العصبي.

لفهم الجوانب التي من حافز رائحة تحدد تقييمها من قبل الطيران، ولذلك فمن المستحسن النظر بكفاءة السلوك الموجهة نحو رائحة العديد من عطور وخلطات رائحة. لربط السلوك إلى نشاط الخلايا العصبية مباشرة، يجب أن يكون كميا السلوك في إطار زمني للمقارنة وتحت ظروف التحفيز متطابقة كما في التجارب العصبية. ومع ذلك، فإن العديد من اختبارات بيولوجية حاسة الشم المستخدمة حاليا في ذبابة الفاكهة neuroethology هي بالأحرى specialized إما نحو الكفاءة أو نحو القرار.

Flywalk، تسليم رائحة وتتبع النظام الآلي، ويسد الفجوة بين الكفاءة والقرار. لأنها تتيح تحديد متى بالضبط حفزت حزمة رائحة ذبابة المشي بحرية، وتحديد animal's رد الفعل السلوكي الحيوي.

Introduction

الهدف الرئيسي من أي بحث neuroethological هو وجود علاقة سببية بين الدول نشاط الخلايا العصبية واحدة أو الدوائر العصبية وسلوك الكائن الحي. لتحقيق هذا الهدف نشاط الخلايا العصبية وينبغي رصد السلوك في ظل ظروف التحفيز متطابقة ويجب أن تكون هذه الشروط التحفيز مثالي مماثلة لتلك التي في الجهاز العصبي تحت المجهر تطورت لفهم. لا سيما عندما يتعلق الأمر اختبارات بيولوجية السلوكية، وهذه الشروط قد ثبت تاريخيا تطلبا جدا في الدروسوفيلاميلانوجاستر neuroethology حاسة الشم.

بعد إطلاق سراحه من المصدر، وأعمدة رائحة كسر بسرعة تصل إلى خيوط رقيقة مع نشر المضطرب الناجمة عن حركة الهواء كونها العامل الرئيسي الذي يحدد توزيع رائحة ^1. ونتيجة لذلك، حشرة تبحر نحو مصدر الرائحة الخبرات التحفيز متقطعة مع حزم رائحة تتخللها فترات متفاوتة من الهواء النقي. على حد سواءوقد ثبت لاستغلال هذا النظام التحفيز متقطعة للملاحة ارتفاع عكس الريح على لقاء بلوم والغالب تتحرك عبر الرياح في غياب الروائح ^{2 - -} المشي والحشرات الطائرة - بما في ذلك ذبابة الفاكهة ^5. في حين أن إجراءات التحفيز في التجارب الفسيولوجية تحاكي إلى حد كبير تلك التي قد تواجه حشرة في بيئتها الطبيعية إما عن طريق توفير نفث واحدة من الروائح تتخللها فترات طويلة من الهواء النقي أو متواليات التحفيز ديناميكية ^6-11، العديد من اختبارات بيولوجية السلوكية المستخدمة في ذبابة الفاكهة neuroethology مثل فخ فحص ، الساحات حقل مفتوح أو T-متاهة تعتمد على رائحة التدرجات ^12-15. ومع ذلك، لأن التدرجات رائحة بالتعريف هي متغيرة في تركيز اعتمادا على مسافة واحدة من مصدر الرائحة، لا يمكن أن يعزى سلوك معين إلى تركيز رائحة الدقيق باستخدام هذه النماذج. بالإضافة إلى ذلك، المنحدر منالتدرج رائحة يعتمد بشكل كبير على الخصائص الفيزيائية للالرائحة. وهناك تدرج من مركب شديدة التقلب يكون أقل عمقا من تلك التي سببها مركب أقل تقلبا، وبالتالي أيضا من الصعب تتبع لكائن حي الاعتماد على قياس الاختلافات التركيز في الفضاء باعتبارها الوسيلة الوحيدة الملاحة ^16-20، مما قد يؤدي إلى سوء فهم الأفضليات حاسة الشم ولا سيما في المقايسات الاختيار. وهذا التأثير هو أيضا ضار للغاية عند التحقيق في سلوك تجاه خليط من رائحة لأنه يؤدي إلى نسب مختلفة المكون مزيج عند كل نقطة في الفضاء، وبالتالي مرة أخرى يحول دون ارتباط واضح بين وظائف الأعضاء والسلوك.

بينما الذباب الخل تميل إلى تجميع على تخمر الفواكه، فهي الانفرادي في التنقل نحو مصادر الغذاء ومواقع وضع البيض. ومع ذلك، بدلا من اختبار الحيوانات الفردية العديد من النماذج السلوكية المستخدمة في ذبابة الفاكهة neuroetholoغراي دراسة السلوك الموجهة رائحة أفواج من الذباب وسجل جاذبية وجزء من الذباب اختيار رائحة أكثر من التحفيز السيطرة. وقد ساهمت هذه التجارب الفوج إلى حد كبير في فهم ذبابة neuroethology والعديد من الملاحظات التي أبداها استخدامها يمكن أن تؤكد التجارب واحد الطاير. ومع ذلك، فقد لوحظ أن الذباب يمكن أن تؤثر على كل قرار other's ^{21 و} في الحالات القصوى تقييم رائحة يمكن ان تتحول من اللامبالاة إلى إبطال اعتمادا على الكثافة السكانية ^22. بالإضافة إلى ذلك، النتائج من هذه الأنواع من التجارب في كثير من الأحيان لا توفر سوى نقطة نهاية سلسلة من القرارات السلوكية بدلا من مراقبة ما الطاير يقوم به بينما هو يفعل ذلك، وهو ما سيكون من المرغوب فيه عند محاولة ربط السلوك مع نشاط الخلايا العصبية. ويتناقض هذه التجارب فوج بدلا منخفضة الدقة التي كتبها عالية الدقة أساليب واحد يطير مثل الساحات رحلة المربوطة والمطاحن والتي تسمحلالملاحظة المباشرة من الاستجابات السلوكية في وقت تقديم الحوافز ^20،23،24. ومع ذلك، والتجارب فوج لا تزال تحظى بشعبية، لأنها فعالة جدا وتعطي نتائج قوية حتى في نسبيا أحجام العينات منخفضة بسبب التباين بين الأفراد وبين المحاكمة وبلغ متوسط ​​جزئيا خارج نظرا للمراقبة السكان على مدى فترات طويلة من الزمن. بينما رحلة المربوطة ومفرغة ربما توفر معيار الذهب بشأن عرض الحوافز والقرار الزماني، فقد تم تصميم الساحات تستخدم للحيوانات واحدة ولذلك فمن للحصول على أحجام العينات اللازمة لإجراء تحليل إحصائي تستغرق وقتا طويلا. وقد تم مؤخرا تطوير العديد من الطرق الأخرى التي تسمح للاكتساب البيانات بشكل أكثر كفاءة سلوكية عالية الدقة في توليفة مع نظام التحفيز واضحة المعالم. وتشمل هذه غير خاضعة للرقابة 3D تتبع من الذباب الخل متعددة في windtunnel في تركيبة مع دقيق 3D نموذج من عمود رائحة ⁵ ، تتبع من الذباب الفردية المتعددة في غرف اختيار إمداده airstreams من الجانبين ²⁵ ونموذج Flywalk ^26.

في Flywalk، تقع 15 الذباب الفردية في أنابيب زجاجية صغيرة ومراقبتها باستمرار من قبل الكاميرا العامة في ظل ظروف الضوء الأحمر. تضاف الروائح إلى تيار الهواء المستمر من 20 سم / ثانية والسفر من خلال أنابيب زجاجية بسرعة ثابتة. وترطيب تيار الهواء بتمريرها من خلال 250 مل الزجاجات التي تحتوي على الماء المقطر (الرطوبة) قبل الدخول إلى نظام التسليم رائحة. يتم تسجيل مواقف flies' داخل منطقة مربع من الفائدة (ROI) تشمل أكثر من طول الأنابيب رائحة (باستثناء الحواف الخارجية للأنابيب (حوالي 5 ملم في كل جانب) حيث الذباب لا يمكن أن تتحرك أبعد السهم العلوي أو اتجاه الريح) في وقت قريب من العرض رائحة (الشكل 1A، B). يتم الاحتفاظ يطير الهويات المستمر من قبل ر نظام التتبعالاحجار الكريمه التجربة على أساس من Y-وظائف (أي حدود أنبوب زجاجي بهم). ويتحقق التحفيز رائحة باستخدام جهاز التحفيز متعدد المكون الذي يسمح بعرض ما يصل إلى 8 الروائح واحدة وجميع الخلطات الممكنة منها ^26،29 (الشكل 1B). يتم التحكم في مسار التجربة من قبل الكمبيوتر الذي ينظم نظام التسليم رائحة وجمع درجات الحرارة والرطوبة المعلومات (الكمبيوتر 1، الشكل 1C). يتحكم هذا الكمبيوتر أيضا datalogger (بدء / إيقاف التسجيل) على جهاز كمبيوتر الثاني الذي يتابع باستمرار مواقف ذبابة في 20 لقطة في الثانية (الكمبيوتر 2). يطير المواقف، وضع صمام رائحة (أي نقطة في الوقت فتح صمام)، ID رائحة، درجة الحرارة والرطوبة حول دورات التحفيز رائحة يتم تسجيل على جهاز الكمبيوتر 2. وبهذه الطريقة معلومات عن رائحة ويطير متزامنة المواقف وتصديرها كملف .csv الملفات التي يمكن أن تزيد من معالجتها وتحليلها باستخدام إجراءات تحليل العرف مكتوب. بسببالنظام برمته هو الكمبيوتر التي تسيطر عليها، دون تدخل بشري ضروري خلال جلسة تجريبية.

Protocol

وقد وصفت تفاصيل البناء والتقنية من Flywalk أماكن أخرى ²⁶ (في حال وجود أي مشاكل إنشاء إعداد هذا، مزيد من المعلومات يمكن الحصول عليها من MK). نحن هنا نركز على تعليمات مفصلة عن طريقة التعامل مع نموذج من شأنها أن تساعد في الحصول على نتائج موثوقة.

1. يطير المناولة

1. الخلفية الذباب في البلدان المنخفضة الدخل على الثقافات متوسطة الكثافة المتوسطة على الغذاء ²⁷ ساعة تحت 12: 12 ساعة ضوء: نظام الظلام في 23-25 ​​درجة مئوية والرطوبة النسبية 70٪. تحقيقا لهذه الغاية، والسماح الذباب 20-30 الكبار ظهرت حديثا لإنتاج الغذاء في قارورة كبيرة ل1 أسبوع، ثم تجاهل الذباب الكبار وانتظر ذرية في الظهور.
2. جمع 30-40 ظهرت حديثا (عمر <24 ساعة) الذباب الكبار في السن ولهم في الجديدة قارورة تحتوي على المتوسط ​​الغذائية ²⁷ لمدة 3-5 أيام.
3. أربع وعشرين ساعة قبل بدء التجربة السلوكية: نقل عن 30-40 تم جمعها سابقا 3-5 د من العمر (انظر 2.2) يطير إلى السادس الجديدآل تحتوي على الرطب المكونات رغوة المطاط أو ورقة الأنسجة رطبة باستخدام الشافطة.
   ملاحظة: لا تخدير الذباب باستخدام CO _2.

2. إعداد إعداد Flywalk

1. استخدام 250 مل الزجاجات كما الرطوبة. ملء الرطوبة مع 100 مل من الماء المقطر.
2. إعداد قارورة رائحة.
   1. إعداد 500 ميكرولتر 10 ^-3 التخفيفات من الروائح نقية خلات الإيثيل، الإيثيل الزبدات، خلات isopentyl و2،3-butanedione في الزيوت المعدنية المذيبات.
   2. نعلق اثنين فحص الصمامات الكرة في رائحة القارورة. لاحظ أن الاختيار صمامات تسمح بتدفق الهواء أحادي الاتجاه فقط. ولذلك، ربط فحص الصمامات في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن يدخل الهواء القارورة على جانب واحد وترك الأمر على الجانب الآخر.
   3. إزالة الغطاء من 200 ميكرولتر PCR أنبوب رد فعل. ماصة 100 ميكرولتر من كل تخفيف الرائحة في أنبوب رد فعل منفصل ووضع الأنابيب في قارورة رائحة منفصلة. كما تعد واحدة القارورة التي تحتوي على رائحة سوى منظمة اوكسفام الدولية المعدنية المذيباتل.
   4. بإحكام ختم القنينات رائحة من قبل إغلاقها باستخدام سدادات الفولاذ المقاوم للصدأ ومقاطع المطاط.
   5. ربط قارورة 5 رائحة (4 الروائح التي تحتوي على و1 تحتوي على الزيوت المعدنية) إلى نظام التسليم رائحة. تأكد من ربطها في اتجاه تدفق الصحيح. وهناك اتصال خاطئ لا يضر فقط التجربة المخطط لها، ولكنها يمكن أيضا تلوث نظام التسليم.
3. تحقق من وجود تسرب بإغلاق منفذ للغرفة الخلط للجهاز التحفيز. تأكد من أن جميع تدفقات الهواء قبل جهاز التحفيز الآن تنخفض تدريجيا إلى الصفر. إن لم يكن، والتحقق من وجود تسرب والتي يمكن الآن التعرف على صوت الهسهسة الهواء ترك النظام.
4. نقل بعناية 15 الذباب الفردية إلى 15 أنابيب زجاجية الفردية باستخدام الشافطة وأنابيب الزجاج وثيقة على كلا الجانبين باستخدام محولات المقابلة.
   ملاحظة: نظرا لأن النظام يجب أن تكون مختومة بإحكام للتجارب الناجحة، تأكد من أن محولات تناسب أنابيب زجاجية بإحكامولاحظ أن أنابيب الزجاج قد كسر خلال هذه الخطوة. الحرص على تجنب وقوع اصابات خلال ارتداء قفازات واقية ونظارات واقية.
5. توصيل أنابيب الزجاج لإعداد Flywalk و، من هنا على، انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل بدء التجربة للسماح الذباب إلى روض مع البيئة الجديدة.
6. بعد ربط أنابيب الزجاج: التحقق من قراءات من المصب وتدفق متر الرقمية على جهاز الكمبيوتر 1 إذا كان 16 تدفقات الهواء بعد أنابيب زجاجية تضيف ما يصل الى تدفق الهواء دخول النظام. أيضا اطمئنان على الكمبيوتر 1، إذا الرطوبة بين 60٪ و 80٪.
7. تصميم بروتوكول التحفيز السيطرة على تسلسل وتوقيت المحفزات رائحة عرضت على الذباب. للحصول على سبيل المثال البيانات وصفها، الحالية 4 الروائح والسيطرة (زيوت معدنية) منفردة وكل الثلاثي ممكن ومخاليط الرباعي من الروائح في وقت واحد لكل 40 مرة. تعيين مدة النبضة إلى 500 مللي ثانية في الفترة الفاصلة interstimulus من 90 ثانية وبطريقة عشوائية تسلسل التحفيز.
8. التبديل على لىمصدر GHT (LED-العنقودية؛ λ = 630). تأكد من أن توفر ما يكفي من الضوء لكفاءة تتبع دون زيادة درجة الحرارة داخل أنابيب زجاجية.
9. اقامة المنطقة من اهتمام من نظام التتبع عن طريق سحب إطار عبر المنطقة المراد رصدها في مثل هذه الطريقة التي يتم تضمين كافة أنابيب زجاجية 15 ويتم استبعاد ما يقرب من 5 ملم من حواف الأنابيب.
10. انشاء 14 خطوط متوازية الفصل بين أنابيب الفردية في نظام التتبع عن طريق تغيير Y-مواقعهم في البرنامج النصي المقابل للحفاظ على الفرد الذباب التعرف في كافة مراحل التجربة. تأكد من وضع لهم في مثل هذه الطريقة أن هناك دائما واحد أنبوب زجاجي بين اثنين من هذه الخطوط الفاصل، لأنه سيتم تعقب ذبابة واحدة فقط بين أي مجموعة من سطرين.
11. تأكد من تعيين المعلمات الكاميرا في مثل هذه الطريقة التي تطير يتم تعقب موثوق في جميع أنحاء أنابيب زجاجية. إذا فقدت الذباب على حواف المنطقة من الفائدة، وزيادة السطوع أو كسب تتبع الصورةoftware. تجنب الاهتزازات الميكانيكية للنظام تتبع. تتبع باستخدام البرمجيات التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
12. بدء التجربة قبل بدء تشغيل بروتوكول التحفيز. سجل flies' XY-الإحداثيات في 20 إطارا في الثانية (لقطة في الثانية) وسجل في تركيبة مع وضع صمام رائحة في ملفات نصية.

تحليل 3. البيانات

ملاحظة: الخطوات التالية في تحليل البيانات والمؤتمتة باستخدام إجراءات العرف مكتوب المبرمجة في R. لأن هذه الخطوات هي الحاسمة للحصول على نتائج ذات مغزى ورغم ذلك قدم تحليل بطريقة خطوة بخطوة. البيانات الأولية لتحليل ملفات CSV. المحتوية على المعلومات متزامنة على وضع صمام رائحة، عدد النبض في التجربة و15 الطيران X-وظائف في سم على محور الزمن المشترك للدورة التحفيز رائحة واحدة. ويمكن تقديم التعليمات البرمجية المخصصة لتحليل البيانات عند الطلب.

1. مفتوحة. CSV ملف، تجد الوقت نقطة من فتح صمام تدل عليه وتشانجى في العمود يمثل حالة صمام.
2. حساب دالة خطية من موقف رائحة النموذج
   و (ر) = ق ر * + ط
   حيث t هو الوقت في دورة التحفيز، والصورة هي سرعة الرياح (هنا 20 سم / ثانية) واعتراض ط يمكن حسابها باستخدام نقطة في الوقت رائحة تدخل الأنابيب في موقف 0 (فتح صمام بالإضافة إلى التأخير).
3. العثور على نقطة الوقت الذي رائحة وتطير X-موقف تتقاطع لكل الطيران وتعيين هذه نقطة في الوقت إلى 0. ملاحظة: هذه الطريقة تتماشى مواقف سافر إلى كل individual's لقاء مع رائحة.
4. استبعاد الذباب يجلس على حواف جدا من منطقة الفائدة.
5. حساب سرعة من X-مواقف بقسمة النزوح على طول محور x بواسطة الفاصل الزمني (100 مللي ثانية) وإجراء تكرار لكل دورة التحفيز.
6. للحصول على سرعة الوقت دورات كما هو مبين في الشكل 2E حساب متوسط ​​السرعة وقتا بالطبع لكل ذبابة ورائحة وعن تلك في الوقت نفسه بالطبع لرائحة معينة.
7. للحصول على النزوح الصافي كما هو مبين في الشكل 3C حساب تشريد صافي داخل 4 ثانية بعد نبض رائحة لكل حدث تتبع وبعد ذلك تشريد صافي متوسط ​​في الطيران ورائحة.

4. تنظيف الداخلي

1. نظيف أنابيب الزجاج
   1. إزالة الذباب ومحولات من أنابيب الزجاج ونقع أنابيب الزجاج في صناعة المنظفات.
   2. شطف أنابيب زجاجية تحت الماء الجاري المقطر وتجفيفها باستخدام الهواء المضغوط.
   3. أنابيب زجاجية الحرارة على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
2. رائحة نظيفة نظام التسليم
   1. إزالة كل قارورة رائحة وأنابيب من غرفة الخلط المركزية.
   2. إزالة محولات أنابيب من غرفة الخلط.
   3. غرفة الخلط نظيفة من قبل الشطف مع محلول التنظيف المختبر والمذيبات (مثل الإيثانول والأسيتون). تنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء محرك السيارة المختبر.
   4. غرفة خلط الجافة باستخدام الهواء المضغوط وتسخينها على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
3. نظيفة رائحة قوارير وفحص الصمامات
   1. إزالة المكونات الصلب (فضلات المطاط طوقا) وفحص الصمامات من قارورة رائحة ونقع جميع المكونات في محلول التنظيف المختبر.
   2. مكونات يصوتن في حمام بالموجات فوق الصوتية وشطف لهم بالماء المقطر.
   3. تنظيف جميع المكونات ما عدا فحص الصمامات مع الإيثانول والأسيتون. تنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء محرك السيارة المختبر.
   4. المكونات الجافة باستخدام الهواء المضغوط والحرارة لهم على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
   5. فحص الصمامات نظيفة من الداخل عن طريق تنظيف لهم الإيثانول والأسيتون باستخدام حقنة (تنظر في اتجاه التدفق). تنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء محرك السيارة مختبر يرتدي نظارات المختبر. لأن الأسيتون يهاجم أجزاء من المطاط، وعلى الفور فحص الصمامات الجافة عن طريق تنظيف لهم مع الهواء المضغوط.
   6. إزالة الروائح المتبقية التي كتبها النبض الهواء من خلال فحص الصمامات لعدة أيام. استخدام حاضنة عند 60 ° C والهواء 1 ثانية على / 1 ثانية الهواء خارج النظام لهذه الخطوة التنظيف.

Results

لأن يسمح الذباب لتوزيع بحرية داخل أنابيب زجاجية ما بين النبضات رائحة ويسافر نبض رائحة من خلال أنابيب زجاجية بسرعة ثابتة الذباب تواجه الرائحة في أوقات مختلفة تبعا لها موقف العاشر في وقت التحفيز. ونتيجة لذلك، يتم تأخير onsets من مسارات عكس الريح التي حركها 500 نبضة مللي ثانية من مغري 10 ^-3 التخفيف من خلات الإيثيل بنحو 1 ثانية عن الذباب في نهاية اتجاه الريح من أنابيب الزجاج وذلك مقارنة مع تلك الذباب يجلس أقرب إلى نهاية عكس الريح في سرعة الرياح من 20 سم / ثانية و 20 سم طول ...

Discussion

على الرغم من أن نظام Flywalk يبدو متطورة بدلا للوهلة الأولى، بعد تشكيلها وتشغيله سهلة الاستخدام وتعطي نتائج قوية للغاية. التشديد على اتساق النتائج المنتجة مع الأحيائي يمكن القول أن نتائج تمثيلية هو موضح هنا تم الحصول عليها بعد ما يقرب من 2 سنوات بعض النتائج هو مبين في دراسة سابقة ²⁹ مع إعداد تعديلها باستخدام برنامج التتبع الجديدة ومصدر الضوء. ومع ذلك، فإن ردود جاذبة هي - على الرغم من سعة استجابة أعلى قليلا - مشابهة جدا لتلك التي نشرت سابقا بشأن ديناميتها.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
إعداد Flywalk	تفاصيل مخصصة		متاحة عند الطلب
جهاز التحفيز	مخصصة		متوفرة عند الطلب
مجموعة LED	مخصصة		متاحة عند الطلب
HD Pro Webcam C920	Logitech ، لوزان ، سويسرا
2 أجهزة كمبيوتر
Flywalk معاد تحميل v1.0 البرمجيات	Electricidade Em P ó (electricidadeempo.net)
برنامج Labview 11.0	National Instruments ، أوستن ، تكساس
قياسي ذبابة طباب	طعام مخصص
قوارير ذبابة قياسية	Greiner bio-one GmbH ، Frickenhausen ، ألمانيا
قوارير ذبابة قياسية	Greiner bio-one GmbH ، Frickenhausen ، ألمانيا
شفاط	مخصص
الزيوت المعدنية	سيجما ألدريتش (www.sigmaaldrich.com) الروائح
	سيجما ألدريتش (www.sigmaaldrich.com)200
& مايكرو; ل أنابيب تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل	Biozym Scientific GmbH ، أولدندورف ، ألمانيا