تقدم هذه المقالة بروتوكولين: أحدهما لقياس البكتيريا اللاهوائية التي يمكنها غزو المضيف والبقاء على قيد الحياة بنجاح، والآخر لتصور البكتيريا اللاهوائية التي تتفاعل مع الخلايا المضيفة. يمكن تطبيق هذه الدراسة على أي لاهوائي قابل للزراعة وأي نوع من الخلايا حقيقية النواة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اللثوية Porphyromonas كما كائن نموذج لتقييم تفاعل البكتيريا اللاهوائية مع خلايا المضيف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البكتيريا اللاهوائية يفوق بكثير الجرام aerobes في العديد من منافذ الإنسان مثل القناة الهضمية والفم والمهبل. وعلاوة على ذلك، والتهابات اللاهوائية شائعة وكثيرا من السكان الأصليين. قدرة بعض الكائنات الممرضة اللاهوائية لغزو الخلايا البشرية يعطيها تدابير التكيف للهروب المناعة الفطرية وكذلك لتعديل سلوك الخلية المضيفة. ومع ذلك، وضمان أن البكتيريا اللاهوائية هي حية أثناء التحقيق التجريبي للأحداث قد تشكل تحديات. اللثوية Porphyromonas، واللاهوائية سلبية الغرام، غير قادرة على غزو مجموعة متنوعة من الخلايا غير البلعمية حقيقية النواة. توضح هذه المقالة كيفية بنجاح الثقافة وتقييم قدرة P. اللثوية لغزو الخلايا البشرية الوريد السري البطانية (HUVECs). وقد وضعت بروتوكولين: واحدة لقياس البكتيريا التي يمكن أن تغزو بنجاح والبقاء على قيد الحياة داخل المضيف، والآخر لتصور البكتيريا تتفاعل مع الخلايا المضيفة. هذه التقنيات تتطلب استخدام وسيلة anaerobic غرفة لتزويد P. اللثوية مع بيئة اللاهوائية للنمو الأمثل.
ويستند البروتوكول الأول على فحص حماية المضادات الحيوية، التي تستخدم إلى حد كبير لدراسة غزو الخلايا المضيفة عن طريق البكتيريا. ومع ذلك، وفحص حماية مضاد حيوي غير محدود؛ تقاس فقط البكتيريا داخل الخلايا التي هي زروع بعد العلاج بالمضادات الحيوية وتحلل الخلية المضيفة. لتقييم جميع البكتيريا تتفاعل مع الخلايا المضيفة، سواء الحية والميتة، وضعنا البروتوكول الذي يستخدم المجهر الفلورسنت لدراسة التفاعل المضيف الممرض. وصفت البكتيريا fluorescently مع 2 "، 7'-التسويات الدولية (2-carboxyethyl) -5- (و6) -carboxyfluorescein acetoxymethyl استر (BCECF-AM) واستخدامها لتصيب الخلايا حقيقية النواة تحت الظروف اللاهوائية. بعد تثبيت مع امتصاص العرق وpermeabilization مع 0.2٪ تريتون X-100، وصفت الخلايا المضيفة مع TRITC phalloidin ودابي لتسمية الهيكل الخلوي الخلية والنواة، على التوالي. متعددة معهد العالم العربيويتم الحصول على غيس التي اتخذت في نقاط الاتصال المختلفة (Z-كومة) لتصور الزمانية المكانية من البكتيريا. الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة يمكن تطبيقها على أي اللاهوائية الصالحة وأي نوع من الخلايا حقيقية النواة.
المقدمة
البكتيريا اللاهوائية استعمار تقريبا جميع أسطح جسم الإنسان. على الرغم من أن السائد في النباتات في مساحات المعوية والبولي التناسلي حيث تركيزات الأكسجين منخفضة، كانت موجودة أيضا عند مستويات مرتفعة على الجلد والفم والأنف، والحلق 1. البكتيريا اللاهوائية هي سبب شائع للالتهابات الداخلية وكثيرا ما معزولة عن المواقع المصابة. ومع ذلك، بسبب طبيعتها الحساسية، يمكن اللاهوائية يكون من الصعب عزل والثقافة. الدراسات التي تنطوي على البكتيريا اللاهوائية ويجب أن يتم في ظل ظروف مقيدة. تقنيات اللاهوائية الثقافة الحديثة تسمح للباحثين لتقليد إعدادات اللاهوائية اللازمة لدراسة العديد من السلالات المختبر اللاهوائي أو حتى العزلات السريرية ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
سوف البروتوكولات التالية تصف طرق زراعة ودراسة غزو الأنواع اللاهوائية، P. اللثوية. ومع ذلك، يمكن استخدام هذه البروتوكولات لعدد من مسببات الأمراض اللاهوائية. على الرغم من أن تستخدم HUVECs، يمكن استخدام هذا البروتوكول للخلايا حقيقية النواة الأخرى على حد سواء المناعية وغير المناعية.
1. اللاهوائية غرفة استخدام وصيانة
ملاحظة: P. اللثوية هو اللاهوائية حساسية لمستويات طبيعية من الأكسجين واجه في الهواء المحيط. A البيئة اللاهوائية التي تسيطر عليها أمر حيوي لزراعة P. اللثوية....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم استخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه في دراسة التفاعل المضيف الممرض بين P. اللثوية والخلايا البطانية. P. اللثوية W83 وP. استخدمت اللثوية V3150 يحمل حذف PG0228 في الدراسة. ومن المتوقع أن PG0228 لترميز البروتين الذي قد يغير مستويات RNA والبروتينات، والتي قد تؤثر في نهاية المطاف تفاعل P. اللثوية مع الخلايا المضيفة. للتحقيق في تأثير PG0228 على P. ، وتمت مقارنة قدرة السلالات الأبوية ومتحولة للتفاعل مع HUVECs اللثوية الصور.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كل الطرق المذكورة أعلاه يمكن استخدامها لتصميم فحوصات محددة لتقييم تفاعل البكتيريا اللاهوائية مع الخلايا حقيقية النواة. ومع ذلك، هناك العديد من الاعتبارات اللازمة لإجراء التجارب بنجاح. هي أول السلالات الجرثومية لاستخدامها في الدراسة.
ومن الأهمية بمكان في المقارنة بين سلالتين مع كل من فحص البقاء على قيد الحياة وكذلك عن طريق التحليل المجهري أنهم في مراحل نمو مماثلة وتحقيق تركيزات خلية مماثلة لأية اختلافات في ما سبق .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر الدكتور هيروشي ميازاكي ، والدكتور سكوت هندرسون ، والدكتور تود كيتن ، والدكتور جاستن هوتشرسون ، والدكتورة كاثرين جوريغي ، وكولين آر بيري. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01DE016124 و R01DE018039 و R01DE023304 إلى جي بي لويس.
تم إجراء الفحص المجهري < p class = 'jove_content'> في قسم التشريح والبيولوجيا العصبية في معهد فرجينيا كومنولث للتشريح وعلم الأعصاب ، بدعم جزئي من المنحة الأساسية لمركز NIH-NINDS (5P30NS047463).....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الفينيل الغرفة اللاهوائية من النوع B | Coy منتجات | نموذج 2000 حاضنة | |
| TSA II Trypticase Soy Agar مع 5٪ دم الأغنام | BBL | 221261 | |
| الخلايا البطانية للوريد السري البشري 10 متبرعين | تقنية LifeLine | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF مجموعة كاملة | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| كبريتات الجنتاميسين | سيجما ألدريتش | G-1264 | |
| ميترونيدازول | سيجما ألدريتش | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin ؛ | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 مم أغطية دائرية | علوم المجهر الإلكتروني | 72222-01 | |
| VectaShield Mounting Medium مع | مختبرات | H-1200 |
المراجع
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
