توضح هذه المخطوطة طريقة بسيطة والإنتاجية العالية لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور التي تقوم على مستحلبات الماء في الزيت. علينا أن نبرهن فعالية الأسلوب في تجميع الكلوروفيل الأم مع أربعة أنواع من المؤتلف للذوبان في الماء، الكلوروفيل ملزم البروتينات (WSCPs) من النباتات الكرنب وأعرب في E. القولونية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الماء في مستحلب النفط: نظام جديد لتجميع البروتينات ملزم الكلوروفيل المياه القابلة للذوبان مع أصباغ مسعور
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الكلوروفيل (CHLS) ويخضور جرثومي (BChls) هي العوامل المساعدة الأولية التي تنفذ حصاد ضوء الضوئي ونقل الإلكترون. وظائفها يعتمد بشكل كبير على منظمة معينة في إطار مجمعات البروتين multisubunit الغشاء كبيرة ومعقدة. من أجل فهم على المستوى الجزيئي كيف تسهل هذه المجمعات تحويل الطاقة الشمسية، فمن الضروري أن نفهم البروتين الصباغ، والتفاعلات الصباغ الصباغ، وتأثيرها على ديناميات متحمس. طريقة واحدة لكسب هذا الفهم هو من خلال بناء ودراسة المجمعات من CHLS مع البروتينات المؤتلف بسيطة للذوبان في الماء. ومع ذلك، والذي يتضمن CHLS دهون وBChls إلى بروتينات قابلة للذوبان في الماء أمر صعب. وعلاوة على ذلك، ليس هناك طريقة عامة، والتي يمكن أن تستخدم لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور. هنا، علينا أن نظهر نظام الإنتاجية بسيط وارتفاع على أساس مستحلبات الماء في الزيت، والتي تمكن الحمارembly من البروتينات للذوبان في الماء مع CHLS مسعور. تم التحقق من صحة الطريقة الجديدة عن طريق تجميع الإصدارات المؤتلف من الكلوروفيل البروتين للذوبان في الماء ملزما من كرنبية النباتات (WSCP) مع كلوروفيل أ. ونحن لشرح التجمع الناجح لكلوروفيل لاستخدام لست] الخام من WSCP معربا عن E. خلية كولاي، والتي يمكن استخدامها لتطوير نظام شاشة الجيني للبروتينات ملزمة كلوروفيل جديدة للذوبان في الماء، وللدراسات التفاعلات كلوروفيل البروتين وعمليات التجميع.
المقدمة
أصباغ مسعور مثل الكلوروفيل (CHLS)، يخضور جرثومي (BChls) والكاروتينات هي العوامل المساعدة الأولية في مراكز رد فعل الضوئي والبروتينات حصاد الخفيفة التي تنفذ نقل الإلكترون، والتقاط الطاقة الضوئية ونقلها. مراكز التفاعل ومعظم المجمعات حصاد ضوء ملزم كلوروفيل هي بروتينات الغشاء. البروتين Fenna-ماثيوز أولسون (FMO) من بكتيريا التمثيل الضوئي الأخضر الكبريت غير الاوكسجينية 1،2، والبروتين peridinin-كلوروفيل (PCP) من دينوفلاجيليت 3 أمثلة استثنائية من المياه القابلة للذوبان البروتينات حصاد الضوء. الكلوروفيل ملزم البروتينات للذوبان في الماء (WSCPs) من كرنبية، بطباطية، سرمقية والنباتات قطيفي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد كلوروفيل والحلول المالية
- خطوة حاسمة: تنفيذ جميع خطوات إعداد الكلوروفيل في غطاء الكيميائية، تحت الضوء الأخضر (520 نانومتر) أو في الظلام من أجل تقليل photodamage. دائما إضافة النيتروجين أو الأرجون قبل تجميد أصباغ للتخزين. التأكد من أن جميع المذيبات هي درجة التحليلي.
- تزن حوالي 5 ملغ من خلايا سبيرولينا الفطور مجفف بالتجميد أو خلايا cyanobacterium أخرى تحتوي على كلوروفيل الوحيد لفي الأغشية الثايلاكويد وسحقها باستخدام هاون ومدقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تجميعها apoproteins WSCP المؤتلف مع كلوروفيل لفي W المستحلبات / O وفقا للبروتوكول وصفها في القسم السابق. تم تنفيذ بروتوكول باستخدام المراحل المائية التي تحتوي إما WSCPs نقية، أو لست] خلايا القولونية overexpressing WSCP (الشكل 1). بروتوكول بسيط وسريع ولا يتطلب أي معدات خاصة باستثناء الخالط الأنسجة.
الامتصا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هدفنا هو تطوير نظام عام جديد لتجميع البروتينات للذوبان في الماء ملزم الكلوروفيل مع أصباغ مسعور. ومن هنا يظهر أن نظام إعادة جديد يقوم على W / O مستحلب هو النهج العام ثبت للعمل لتجميع apoproteins WSCP من براعم بروكسل والقنبيط والفجل الياباني وفرجينيا pepperweed أعرب recombinantly في E. القولونية. هنا يتم عرض النتائج من إعادة من 1 ملغ من WSCP مع زيادة الرحى 10 أضعاف من كلوروفيل أ. ومع ذلك فإنه من الممكن أيضا استخدام تركيزات أقل من WSCP لreconstitutions ومختلفة كلورو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
يعترف DN بدعم من الاتحاد الأوروبي FP7 مشاريع PEPDIODE (GA 256672) وREGPOT-2012-2013-1 (GA 316157)، ومنحة بحثية شخصية (رقم 268/10) من مؤسسة العلوم اسرائيل. نشكر البروفيسور شموئيل روبنشتاين، كلية الهندسة والعلوم التطبيقية، جامعة هارفارد، كامبردج، الولايات المتحدة الأمريكية لأخذ الصور المجهري متحد البؤر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الزيوت المعدنية | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity Chromatography لتنقية WSCP بالتسلسل الأصلي. |
| عمود Trap HF | الخاص به GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | كروماتوغرافيا التقارب لتنقية WSCP مع علامته |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | وسط كروماتوغرافيا لتنقية الكلوروفيل |
المراجع
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorba....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
