يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1

11.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53417

⸱

فبراير 25, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نوضح كيفية دراسة توطين الميتوكوندريا لكيناز (دورة الخلية) ، وكيفية تحديد موقعه في الميتوكوندريا بالإضافة إلى ركائز / أهداف الميتوكوندريا المحتملة. يوفر التعبير القسري للبروتينات في الميتوكوندريا أداة مفيدة لدراسة العواقب الوظيفية لتوطين الميتوكوندريا للبروتين ذي الأهمية.

الملخص

< p class = 'jove_content'> على الرغم من أن الميتوكوندريا تمتلك آلية النسخ الخاصة بها ، إلا أن 1٪ فقط من بروتينات الميتوكوندريا يتم تصنيعها داخل العضية. يتم نقل البروتينات المشفرة نوويا إلى الميتوكوندريا مسترشدة بتسلسلات استهداف الميتوكوندريا (MTS). ومع ذلك ، فإن غالبية البروتينات الموضعية في الميتوكوندريا تفتقر إلى MTS يمكن تحديده. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن MTS يمكن أن يوجه البروتينات للدخول إلى الميتوكوندريا توفر أداة قيمة لدراسة وظائف الميتوكوندريا للبروتينات النووية و / أو السيتوبلازمية عادة. لقد حددنا مؤخرا دورة الخلية كيناز مركب CyclinB1 / Cdk1 في الميتوكوندريا. لدراسة وظائف الميتوكوندريا لهذا المركب على وجه التحديد ، كان من الضروري الإفراط في التعبير عن الميتوكوندريا وهدمه دون التدخل في وظائفه النووية أو السيتوبلازمية. من خلال وضع علامة على CyclinB1 / Cdk1 باستخدام MTS ، تمكنا من تحقيق الإفراط في التعبير عن الميتوكوندريا لهذا المركب لدراسة أهدافه ووظائفه في الميتوكوندريا. من خلال وضع علامات على Cdk1 السلبي المهيمن باستخدام MTS ، تم تحقيق تثبيط نشاط Cdk1 خاصة في الميتوكوندريا. تم تحديد أهداف الميتوكوندريا المحتملة لمركب CyclinB1 / Cdk1 باستخدام نهج البروتينات القائمة على الهلام. على عكس تحليل الهلام التقليدي ثنائي الأبعاد ، استخدمنا تقنية الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد (2D-DIGE) متبوعة بتلوين البروتين الفوسفوري لتسمية البروتينات الفسفرية بشكل فلوري في الخلايا التي تعبر عن الميتوكوندريا Cdk1. كشف تحديد بقع البروتين الفوسفوري التي تم تغييرها في النوع البري مقابل الميتوكوندريا السلبية السائدة Cdk1 الحاملة لهوية أهداف الميتوكوندريا ل Cdk1. أخيرا ، لتحديد تأثير توطين الميتوكوندريا CyclinB1 / Cdk1 في تقدم دورة الخلية ، تم استخدام مقايسة تكاثر الخلايا باستخدام نظير الثايميدين الاصطناعي EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) لمراقبة الخلايا أثناء مرورها بدورة الخلية وتكرار الحمض النووي الخاص بها. إجمالا ، أظهرنا مجموعة متنوعة من الأساليب المتاحة لدراسة توطين الميتوكوندريا ونشاط كيناز دورة الخلية. هذه طرق متقدمة ، ولكن من السهل اتباعها والتي ستكون مفيدة للعديد من الباحثين في بيولوجيا الخلية.

المقدمة

في الثدييات، تقدم دورة الخلية يعتمد على الأحداث أمر غاية التي تسيطر عليها الحلقيات وتحركات تعتمد على السيكلين (Cdks) 1. من خلال حشوية لها، والطاقة النووية، وتوطين centrosomal، CyclinB1 / Cdk1 قادر على مزامنة الأحداث المختلفة في الانقسام مثل انهيار الغلاف النووي والانفصال الجسيم المركزي 2. CyclinB1 / Cdk1 يحمي الخلايا الإنقسامية ضد الخلايا 3 ويعزز الانشطار الميتوكوندريا، خطوة حاسمة لتوزيع متساو للالميتوكوندريا في الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا 4.

في تكاثر خلايا الثدييات، يتم إنشاء الميتوكوندريا ATP عن طريق الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) الأجهزة (الإلكترون سلسلة النقل)، الذي يتكون من 5 مجمعات متعددة فرعية. أنا معقدة - V معقدة (CI-CV). ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الأدينين (NADH): مؤكسدة مختزلة يوبيكوينون أو معقدة الأول (CI) هو الأكبر والأقل يفهم من المجمعات الخمسة 5. ج معقدةonsists من 45 وحدات فرعية، منها 14 تشكل جوهر الحفاز. تجميعها مرة واحدة، يفترض مجمع هيكل على شكل حرف L مع ذراع واحدة بارزة في مصفوفة والذراع الأخرى جزءا لا يتجزأ من 6،7 الغشاء الداخلي. الطفرات في مفارز CI هي السبب في مجموعة متنوعة من اضطرابات الميتوكوندريا 8. مطلوب CI فعال وظيفيا في OXPHOS ليس فقط للتنفس الميتوكوندريا العام 9، ولكن أيضا لخلية الناجحة دورة التقدم 10. يمكن التكشف الآليات الكامنة وراء عمل هذا المجمع انزيم بغشاء في الصحة والمرض تمكن من وضع إجراءات تشخيصية جديدة والاستراتيجيات العلاجية المتقدمة. في دراسة أجريت مؤخرا، وجدنا أن CyclinB1 / Cdk1 مجمع translocates في الميتوكوندريا في (الفجوة 2) G2 / (الانقسام) المرحلة M وphosphorylates مفارز CI إلى تعزيز إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا، يحتمل أن تكون لتعويض زيادة احتياجاتها من الطاقة من الخلايا خلال خلية دورة 11. نحن هنا SHOwcase الإجراءات التجريبية والاستراتيجيات التي يمكن استخدامها لدراسة النبات الميتوكوندريا من تحركات خلاف النووية / هيولي، ركائز من الميتوكوندريا وكذلك العواقب الوظيفية للتوطين الميتوكوندريا الخاصة بهم باستخدام CyclinB1 / Cdk1 كمثال على ذلك.

ورأت أن CyclinB1 / Cdk1 مجمع translocates في الميتوكوندريا عند الحاجة دفعت دراسات overexpression-الميتوكوندريا محددة وضربة قاضية لهذا المجمع. لتحقيق التعبير عن الميتوكوندريا محدد من البروتينات، يمكن للمرء أن إضافة تسلسل الميتوكوندريا التي تستهدف (MTS) في N-محطة من البروتين من الفائدة. الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل تسمح للفرز بروتينات الميتوكوندريا في الميتوكوندريا التي يقيمون فيها عادة 12. لقد استخدمت 87 الميتوكوندريا قاعدة تستهدف تسلسل المستمدة من السلائف السيتوكروم البشري ج أوكسيديز فرعية 8A (COX8) والمستنسخة ذلك إلى البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -tagged CyclinB1 أو الأحمر نيونبروتين (RFP) -tagged Cdk1 تحتوي على البلازميدات في الإطار. يسمح هذا الأسلوب لنا لاستهداف CyclinB1 وCdk1 في الميتوكوندريا، وتغيير وجه التحديد التعبير الميتوكوندريا من هذه البروتينات دون أن يؤثر ذلك تجمع النووي. عن طريق وضع علامات fluorescently هذه البروتينات، كنا قادرين على مراقبة التعريب في الوقت الحقيقي. وبالمثل، أدخلنا MTS إلى البلازميد التي تحتوي على الموسومة طلب تقديم العروض المهيمنة سلبية Cdk1، الذي سمح لنا أن يطرق على وجه التحديد أسفل التعبير وظائف الميتوكوندريا من Cdk1. لا بد من التمييز بين وظائف الميتوكوندريا والنووية للتحركات التي لديها تعريب المزدوجة مثل Cdk1. هندسة MTS إلى N-محطة من هذه تحركات الوظيفية المزدوجة يقدم استراتيجية كبيرة أن من السهل استخدامها وفعالة.

منذ Cdk1 هو كيناز دورة الخلية، وهو أساسي لتحديد تقدم دورة الخلية عندما يكون موضعيا Cdk1 إلى الميتوكوندريا. ولتحقيق ذلك، فإننا قد تستخدم لmetho جديدد لمراقبة محتوى الحمض النووي في الخلايا. وتشمل الأساليب التقليدية باستخدام BrdU (bromodeoxyuridine)، والثيميدين التماثلية الاصطناعية، والتي تضم في الحمض النووي مركبة جديدة خلال مرحلة من مراحل دورة الخلية إلى استبدال الثيميدين. ثم الخلايا التي يتم تكرار بنشاط عينات من الحمض النووي يمكن أن يتم الكشف باستخدام الأجسام المضادة ضد BrdU. ومن عيوب هذا الأسلوب هو أنه يتطلب تمسخ من الحمض النووي لتوفير وصول الأجسام المضادة BrdU بواسطة أساليب قاسية مثل العلاج حامض أو الحرارة، مما قد يؤدي إلى عدم تناسق بين النتائج 13،14. بدلا من ذلك، نحن تستخدم نهجا مماثلا لمراقبة تقسيم الخلايا بنشاط مع التناظرية ثيميدين مختلفة، EDU. لا يتطلب الكشف ايدو قاسية تمسخ الحمض النووي كما تمكن العلاج المنظفات معتدل الكاشف الكشف للوصول إلى ايدو في الحمض النووي توليفها حديثا. وقد ثبت أن طريقة ايدو لتكون أكثر موثوقية، بما يتفق ومع إمكانية تحليل الإنتاجية العالية (15).

وأخيرا، رس تحديد ركائز الميتوكوندريا من Cdk1، استخدمنا أداة البروتينات تسمى 2D-DIGE، وهو نسخة مطورة من الكلاسيكية الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. اثنين الكهربائي الأبعاد يفصل البروتينات وفقا لنقطة تساوي الكهربائية في البعد الأول والوزن الجزيئي في الثانية. منذ مرحلة ما بعد التعديلات متعدية مثل الفسفرة تؤثر على نقطة تساوي الكهربائية والوزن الجزيئي للبروتينات، يمكن أن المواد الهلامية 2D كشف عن الاختلافات بين الحالات الفسفرة من البروتينات داخل عينات مختلفة. حجم (المساحة وكثافة) من البروتين البقع التغييرات مع مستوى التعبير من البروتينات، مما يتيح المقارنة الكمية بين عينات متعددة. باستخدام هذا الأسلوب، كنا قادرين على التفريق بين البروتينات فسفرته في النوع البري مقابل Cdk1 الخلايا معربا عن متحولة استهداف الميتوكوندريا. تم عزل البقع البروتين المحددة التي أظهرت في النوع البري ولكن في عداد المفقودين في متحولة إعداد Cdk1 استهداف الميتوكوندريا وحددت عن طريق قياس الطيف الكتلي.

في المواد الهلامية 2D التقليدية، وتستخدم الأصباغ ثلاثي فينيل ميثان لتصور البروتينات على هلام. يستخدم 2D-DIGE تسميات بروتين فلوري مع تأثير ضئيل على البروتين التنقل الكهربي. عينات البروتين مختلفة يمكن أن توصف مع الأصباغ الفلورية مختلفة، مختلطة مع بعضها البعض وتفصل بينها المواد الهلامية متطابقة، والسماح للزملاء الكهربائي من عينات متعددة على هلام واحد 16. هذا يقلل من الاختلافات جل إلى جيل، وهي مشكلة خطيرة في دراسات البروتينات القائم على هلام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. عزل الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة

  1. إعداد عزل العازلة للخلايا (IBC) العازلة
    1. تحضير 0.1 M تريس / اجتماعات الأطراف (تريس (hydroxymethyl) aminomethane / 3- (N -morpholino) حمض propanesulfonic): ذوب 12.1 غرام من تريس في 800 مل من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام مسحوق اجتماعات الأطراف، إضافة الماء المقطر إلى ما مجموعه حجم 1 لتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    2. تحضير 0.1 M EGTA (الايثيلين جلايكول مكرر (2-aminoethyl الأثير) حمض tetraacetic) / تريس: ذوب 38.1 غرام من EGTA في 800 مل من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام مسحوق تريس، إضافة الماء المقطر إلى إجمالي حجم 1 لتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    3. إعداد 1 M السكروز: ذوب 34.23 غرام من السكروز في 100 مل من الماء المقطر، وجعل 20 مل قسامات، ومخزن في -20 درجة مئوية.
    4. إعداد العازلة ج IB: إعداد 100 مل من IB ج العازلة بإضافة 10 مل من 0.1 M تريس / اجتماعات الأطراف و1 مل من 0.1 M EGTA / تريس إلى 20 مل، من 1 M السكروز. إضافة الماء المقطر إلى إجمالي حجم 100 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
  2. إعداد خلية الاحتياطي تحلل
    1. إعداد العازلة تحلل تحتوي على 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA (الإثيلين diamino حمض tetraacetic)، 1 ملي EGTA، 1٪ تريتون-X-100، 2.5 ملم الصوديوم بيروفوسفات، 1 ملم β- سكرولي، 1 ملم الصوديوم orthovanadate. إضافة مثبطات بروتين 1 ميكروغرام / مل Leupeptin و1 ملم PMSF (phenylmethylsulfonyl الفلورايد) الحق قبل الاستخدام.
  3. عزل الميتوكوندريا
    1. حصاد 3 × 10 7 الخلايا مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة)، ودرجة الحموضة 7.4 وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 5 مل العازلة IB ج الجليد الباردة.
    2. تجانس الخلايا باستخدام طاحونة الأنسجة الزجاجية / زجاج لمدة 10 دقيقة. نقل جناسة لأنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 ميلن في 4 درجة مئوية. لالميتوكوندريا وظيفية، واستخدام اقتران الزجاج / تفلون كما أنه أقل ضررا على الميتوكوندريا من طاحونة الأنسجة الزجاجية / زجاج.
    3. جمع طاف في أنابيب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. طاف لنقل أنبوب 1.5 مل، وباستثناء ما بروتين العصارة الخلوية.
    4. يغسل بيليه (الميتوكوندريا) مرتين مع 200 ميكرولتر الجليد الباردة عازلة IB ج وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    5. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت خلية تحلل واستخدامها على الفور أو تخزين في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. إذا كانت هناك حاجة الميتوكوندريا وظيفية، وإعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت المتبقية بعد التخلص من طاف. تمييع جزء الميتوكوندريا الأخرى التي قد تؤدي إلى فقدان وظيفة الميتوكوندريا. تخزين على الجليد واستخدام إعداد في 1-3 ساعة حصول على أفضل النتائج.
    6. يصوتن بيليه معلق لمدة ثلاثين 3 انفجارات ثانية فيحمام الثلج، الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق، وحفظ طاف باعتبارها جزء الميتوكوندريا.

2. المشارك المناعية من Cdk1، CyclinB1 وCOXIV، وهو البروتين الميتوكوندريا المقيم

  1. تنمو 5 × 10 4 خلايا coverslips على في 24-جيدا لوحات O / N أو ما يصل إلى 70٪ التقاء. نضح المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 500 ميكرولتر الجليد الباردة 1 × برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4.
  2. إصلاح الخلايا مع 500 ميكرولتر الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في RT لمدة 10 دقيقة. نضح الحل تحديد وغسل الخلايا مع 500 ميكرولتر 1 × PBS 3 مرات، مع كل طيف اهتزاز في RT مدة 5 دقائق.
  3. Permeabilize الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على RT. نضح الحل وغسل الخلايا 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة عرقلة الحل (500 ميكرولتر، 1٪ BSA (الأبقار مصل الزلال) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين 20) لمدة 30 دقيقة في RT.
  4. تمييع الأجسام المضادة الأولية 1: 250 (ت: ت) في 5001؛ لتر من عرقلة الحل واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المطلوبة التي أثيرت في الأنواع المختلفة لتجنب الإشارات عبر (CyclinB1 (الماوس) وCOXIV (أرنب) أو Cdk1 (الماوس) وCOXIV (الأرنب) في RT ل30 - 60 دقيقة أو O / N عند 4 درجة مئوية.
  5. غسل لل coverslips مع 500 ميكرولتر من 1 × PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما ثم احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1: 1000 في 500 ميكرولتر عرقلة الحل في RT لمدة 1 ساعة تليها الغسيل مع 500 ميكرولتر PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما.
  6. جبل لل coverslips مع 20 ميكرولتر من محلول تصاعد مكافحة تتلاشى وختم الشرائح مع طلاء الأظافر. صورة الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت على الفور أو تبقى في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.

3. كربونات الصوديوم استخراج الميتوكوندريا سليمة

  1. ينمو حوالي 20 × 10 7 خلايا، والحصاد، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وعزل الميتوكوندريا كما هو موضح في القسم 1. تقسيم الميتوكوندريا يعزل إلى قسمين قدم المساواةنهاية الخبر قبل الطرد المركزي الماضي لبيليه الميتوكوندريا (قبل الخطوة 1.3.4)؛ انقاذ نصف لاستخدامها إجمالي الميتوكوندريا (الخطوة 3.2)، استخدم النصف الآخر لاستخراج كربونات الصوديوم (بعد خطوات 3،3-3،6) لفصل البروتينات القابلة للذوبان وغشاء ملزمة.
  2. ليز مجموع الميتوكوندريا بيليه مع 30 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلايا وتخزين المحللة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها في immunoblotting.
  3. إضافة 250 ميكرولتر من 0.1 M نا 2 CO 3 (كربونات الصوديوم)، ودرجة الحموضة 11.0، إلى النصف الآخر من بيليه الميتوكوندريا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 100000 x ج لمدة 20 دقيقة. جمع طاف وانتقل إلى الخطوة 3.5. ليز بيليه باستخدام 30 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل ويصوتن كما في الخطوة 1.3.6. تخزين في -80 درجة مئوية حتى استخدامها في immunoblotting.
  5. إضافة حجم مساو من 20٪ حمض الخليك ثلاثي الكلور تقدم طازجة (TCA) لطاف لترسيب البروتينات والحفاظ على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  6. Centrifأويغه في 15000 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف، حل بيليه في 80 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل ومخزن في -80 درجة مئوية حتى استخدامها في immunoblotting.

4. فصل الداخلية والخارجي الأغشية من الميتوكوندريا (عزل Mitoplasts)

  1. ينمو حوالي 20 × 10 7 خلايا، والحصاد، يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وعزل الميتوكوندريا كما هو موضح في القسم 1. فصل الكسور الميتوكوندريا إلى 10 أجزاء متساوية قبل الطرد المركزي الماضي لبيليه الميتوكوندريا (قبل الخطوة 1.3.4).
  2. حل كل بيليه في 30 ميكرولتر من تركيز المشار إليه من عازلة السكروز منخفض التوتر (1 ملم EDTA، 10 ملي اجتماعات الأطراف / KOH (هيدروكسيد البوتاسيوم)، ودرجة الحموضة 7.2، تركيز السكروز تتراوح 25-200 ملم) مع أو بدون 50 ميكروغرام / مل التربسين ( انظر الجدول 1)، واحتضان 30 دقيقة على الجليد.
  3. إضافة 3 ميكرولتر من 10 ملي PMSF (للوصول إلى تركيز النهائي من 1 ملم PMSF) إلى التربسين التي تحتوي على قوارير لوقف رانه التربسين الهضم واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نقل طاف في أنبوب جديد، ليز بيليه في 30 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل، يصوتن كما في الخطوة 1.3.6، ومخزن في -80 درجة مئوية.

5. بناء الميتوكوندريا استهداف GFP / الموسومة طلب تقديم العروض CyclinB1 / Cdk1 المتجهات وتأكيد تلك التعريب الميتوكوندريا

  1. استنساخ الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل (MTS، المستمدة من السلائف السيتوكروم البشري ج أوكسيديز فرعية 8A (COX8) بين النيوكليوتيدات 76-161) في إطار في N-محطة من GFP أو طلب تقديم العروض في مواقع NheI وBamHI من pEGFP-N1 أو pERFP ناقلات -N1 باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية.
  2. عند تصميم الاشعال PCR لجينات CyclinB1 وCdk1، إضافة مواقع BamHI انزيم التقييد الاعتراف (جريئة) ل5 'من الاشعال PCR.
    إلى الأمام Cdk1 BamH15 'CAG تي GG ATC C AA TGG مجموعة الاهلي ATT ATA التقييم القطري المشترك AAA T
    عكس Cdk1 BamH1 5 "CTG تي GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    إلى الأمام CyclinB1 BamH1 5 "ATA TGG ATC الجهاز المركزي للمحاسبات TGG CGC TCC GAG TCA
    عكس CyclinB1 BamH1 5 "ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. تضخيم الجينات Cdk1 وCyclinB1 استخدام هذه البادئات التالية الأساليب القياسية. هضم منتجات PCR مع 1 ميكرولتر من انزيم تقييد BamHI عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تشغيل المنتجات الهضم على هلام الاغاروز 1٪. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع الصحيحة شظايا الحمض النووي -sized بها وتنقية الحمض النووي من الجل باستخدام مجموعة استخراج الهلام.
  4. هضم 1 ميكروغرام من MTS-pEGFP-N1 والبلازميدات MTS-pERFP-N1 مع 1 ميكرولتر من انزيم BamHI عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. إضافة 1 ميكرولتر من العجل-INTEStinal الفوسفاتاز القلوية (CIP) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تشغيل المنتجات الهضم على هلام الاغاروز 1٪ وتنقية البلازميدات الخطية من هلام كما في الخطوة 5.3.
  5. إعداد رد فعل الربط عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من البلازميد من الخطوة 5.4 و 5 ميكرولتر من Cdk1 أو CyclinB1 من الخطوة 5،3-3 ميكرولتر من العازلة يغاز، 0.5 ميكرولتر من T4 يغاز، و 20.5 ميكرولتر من درهم 2 O. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
  6. تحويل كولاي DH5α الخلايا المختصة مع 10 ميكرولتر من خليط ربط التالية التقنيات القياسية وتنمو البكتيريا على 10 ملغ / مل الكانامايسين التي تحتوي على LB لوحات أجار O / N عند 37 درجة مئوية للحصول على المستعمرات.
  7. اقتطاف مستعمرة من O / N نمت لوحات باستخدام طرف ماصة معقمة، إدراج معلومات سرية إلى 5 مل من كانامايسين-LB التي تحتوي على أنبوب واحتضان O / N. عزل البلازميد باستخدام مجموعات miniprep وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وتسلسل البلازميد باستخدام التقنيات القياسية.
  8. Transfect MCF1 تنمو باطرادخلايا 0A (1.5 × 10 4 خلايا المصنفة على لوحات 96-جيدا) مع MTS-Cdk1-طلب تقديم العروض أو MTS-CyclinB1-GFP البلازميدات من الخطوة 5.7 من خلال إعداد البلازميد / ترنسفكأيشن نسبة كاشف 1: 2 (ث: ت، 100 نانوغرام : 0.2 ميكرولتر) في serum- 100 ميكرولتر والمتوسطة خالية من المضادات الحيوية.
  9. احتضان الخلايا في البلازميد مزيج / كاشف لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 مع مراقبة الرطوبة (5٪ CO 2، الرطوبة النسبية 95٪).
  10. إعداد 1 ملم حل سهم الأصباغ الحمراء والخضراء الفلورسنت الميتوكوندريا عن طريق تذويب 50 ميكروغرام من مسحوق في 100 ميكرولتر من DMSO. تمييع الحلول الأوراق المالية 1: 400 في برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 2.5 ميكرومتر حلول العمل. يمكن تخزين حلول السهم عند -20 درجة مئوية لمدة عام.
  11. خلط 2 ميكرولتر من 2.5 ميكرومتر من صبغة حمراء مع 98 ميكرولتر من مستنبت لإعداد تركيز النهائي 50 نانومتر.
  12. استبدال خلية ثقافة المتوسط ​​من CyclinB1-GFP تحمل خلايا MCF10A (ولدت في الخطوة 5.8) مع صبغة حمراء تحتوي متوسطة لمدة 2 دقيقة. تكرارنفس الإجراء مع صبغة خضراء لCdk1-طلب تقديم العروض خلايا تحمل MCF10A.
  13. يغسل مرتين مع 100 ميكرولتر 1 × برنامج تلفزيوني للتخلص من الحل تلطيخ الزائد، إضافة 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X لوحة 96-جيدا.
  14. تصور الميتوكوندريا وCyclinB1-GFP (الإثارة من 488 نانومتر، والانبعاثات في 494-536 نانومتر) وCdk1-طلب تقديم العروض (الإثارة من 560 نانومتر، والانبعاثات في 565-620 نانومتر) على لوحات 96-جيدا تحت المجهر الفلورسنت في 40X التكبير.

6. تحديد تفاضلي فسفرته البروتينات عبر 2D-DIGE

  1. إعداد عينة
    1. عزل الميتوكوندريا وليز الكسور الميتوكوندريا كما في الخطوة 1.3. إضافة حجم مساو من 20٪ TCA (حمض التريكلوروسيتيك في الماء) لكل عينة ودوامة لمدة 15 ثانية. احتضان عينات على الجليد لمدة 30 دقيقة كما تترسب البروتينات من الحل.
    2. عينات الطرد المركزي في 9300 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، وإضافة 60 ميكرولتر الأسيتون البارد (100٪)، يليهالطرد المركزي في 9300 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. كرر الخطوة غسل الأسيتون (الخطوة 6.1.2) واحد مزيد من الوقت، إزالة طاف واعادة تعليق العينات في 50 ميكرولتر DIGE وضع العلامات عازلة (7 M اليوريا و 2 M ثيوريا، 4٪ CHAPS، 30 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.5).
  2. إعداد الأصباغ الفلورية
    1. إعداد محلول المخزون: ذوب الأصباغ (5 نانومول) في 5 ميكرولتر من الفورماميد ثنائي ميثيل جديدة (DMF) إلى تركيز النهائي من 1 نانومول / ميكرولتر. تخزين محلول المخزون صبغ في -20 درجة مئوية حتى استخدامها لبضعة أشهر.
    2. يعد حل العمل: السماح الأصباغ لتعيين في RT لمدة 5 دقائق. تمييع 1 ميكرولتر من صبغ مع 4 ميكرولتر من DMF إلى التركيز النهائي من 200 بمول / ميكرولتر. الحفاظ على الجليد أثناء الاستخدام. ملاحظة: الحل العمل يمكن أن تبقى عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع.
  3. البروتينات التسمية
    1. مزيج 1 ميكرولتر من محلول الصبغة العمل في 12.5 ميكروغرام من البروتين. تصعيد حسب الحاجة. لمعايير المجمعة، إضافة 61؛ لتر من Cy2 حل العاملة إلى 300 ميكروغرام تجميع البروتين.
    2. دوامة لمدة 30 ثانية وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية في 12000 ز س. احتضان على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. وقف الوسم بإضافة 1 ميكرولتر من 10 ملي يسين في 1 ميكرولتر من محلول العمل المستخدمة. تخلط جيدا واحتضان على الجليد في الظلام لمدة 10 دقيقة.
    3. تجمع صفت بشكل فردي عينات وتخلط مع العازلة الإماهة (7 M اليوريا و 2 M ثيوريا، 4٪ CHAPS، 1.2٪ destreak، 1٪ pharmalytes، برموفينول الأزرق). وسيبلغ اجمالي حجم يكون 125 ميكرولتر.
    4. عينات دوامة لمدة 30 ثانية، وتسمح عينات لتعيين في RT لمدة 30 دقيقة. تحميل 125 ميكرولتر من العينات على 7 سم درجة الحموضة 4-9، ISOELECTRIC التركيز (منتدى الطاقة الدولي) شرائط.
  4. أولا البعد الكهربائي
    1. وضع أصحاب الشريط (توابيت) على لوحة إلكترود، والتأكد من أصحاب قطاع نظيفة تماما وجاف. ماصة 125 عينات ميكرولتر في تابوت، ونشر بالتساوي على نعش بأكمله.
    2. استخدام ينتفالتمرير، والتقاط قطاع منتدى الطاقة الدولي، بعناية إزالة الغطاء الواقي البلاستيك، ووضعه (الجانب جل أسفل) في المخزن نعش / الإماهة. تجنب احتباس فقاعات الهواء. ببطء ملء نعش (1-1،5 مل) مع الزيوت المعدنية ووضع التابوت يغطي على التوابيت.
    3. تبدأ ISOELECTRIC التركيز بعد بروتوكول في الجدول 2:
      ملاحظة: بمجرد تشغيل كاملة، قد يتم تخزين الشرائط في أنابيب بلاستيكية في -80 درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى موازنة والبعد الثاني.
  5. البعد الثاني - الصوديوم دوديسيل كبريتات-إس دي إس بايج (SDS-PAGE)
    1. موازنة
      1. ذوبان الجليد SDS عازلة موازنة (8 مل لكل قطاع، 6 M اليوريا، و 30٪ الجلسرين، 2٪ SDS). تزن خارج dithiothreitol (DTT و 10 ملغ DTT لكل 1 مل من العازلة موازنة SDS). حل DTT إلى 4 مل SDS عازلة موازنة.
      2. تزن خارج IAA (iodoacetamide، 25 ملغ IAA لكل 1 مل من العازلة موازنة SDS).حل IAA إلى 4 مل SDS عازلة موازنة.
      3. تذوب 1 مل ختم الحل الاغاروز في حمام مائي لاستخدامها لاحقا.
      4. إذا تم تجميد شرائح، تسمح لهم ذوبان الجليد تماما. مكان شرائط الجانب جل ما يصل إلى علبة reswelling. إضافة 4 مل من العازلة موازنة SDS مع DTT إلى كل قطاع واحتضان لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
      5. تخلصي من كل المخزن المؤقت موازنة SDS مع التلفزيون الرقمي الأرضي. إضافة 4 مل من العازلة موازنة SDS مع IAA إلى كل قطاع واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى مع اهتزاز لطيف. بعد موازنة مع العازلة IAA، صب المخزن المؤقت موازنة SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. بسط الهلام صغيرة، وإزالة المشط وشطف جل والآبار مع DDH 2 O. إزالة الشريط الأبيض في الجزء السفلي من هلام قبل تشغيل. توجيه قطاع على هلام بشكل صحيح، والتوجه هلام هو أمر حاسم لقطع الفور.
      2. ضع شقة الجل على مواجهة مع لوحة صغيرة صعودا وهلام أعلى تواجه هxperimenter. وضع الشريط على لوحة طويل القامة مع نهاية انوديك (++ تنتهي مع الباركود) التي تواجه الجانب الأيسر من هلام. وباستخدام مسطرة، ودفع ببطء الشريط أسفل على سطح هلام. تجنب احتباس فقاعات الهواء بين القطاع وهلام. الوقوف على جل ما يصل في موقف لوحة من الزجاج.
      3. إضافة 1 مل من الملفات الساخنة حل ختم الاغاروز افتتاح الكاسيت. تأكد من الضغط على جميع فقاعات الهواء خارج باستخدام مسطرة شقة. تجميع الجهاز وتشغيل هلام في ثابت 125 فولت لمدة 90 دقيقة.
      4. عند انتهاء هلام التشغيل، وضع الجل على جهاز تصوير الجزيئية البيولوجية مع 2 مل ده 2 O ومسح هلام في وضع الاستحواذ مضان مع 635 نانومتر ليزر الإثارة و 665 مرشح الانبعاثات نانومتر.
    3. بروتين فسفوري؛ فسوبروتين تلطيخ
      1. إصلاح هلام مع 50٪ الميثانول و 10٪ خليط حامض الخليك (10 مل) لمدة 30 دقيقة مرتين. يغسل مع 10 مل من الماء لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات وصمة عار مع 10 مل بروتين فسفوري؛ فسوبروتين وصمة عار ل60-90 دقيقة، تليهاdestaining مع 10 مل يزيل اللون الحل لمدة 30 دقيقة ثلاث مرات.
      2. يغسل مع 10 مل من الماء 5 دقائق مرتين وصورة هلام مع ماسح ضوئي هلام الليزر في 532 نانومتر / 560 نانومتر الإثارة / الانبعاث.
    4. البروتين الهضم وتحديد
      1. المكوس جميع تفاضلي أعرب البقع البروتين من هلام في الآبار صفيحة باستخدام الروبوت بقعة منقار وفقا لمواصفات الشركة الصانعة، وإضافة 100 ملي بيكربونات الأمونيوم (2 مل) لمدة 1 ساعة على RT ليزيل اللون القطع هلام. يذوى مع 2 مل 100٪ الأسيتونتريل يغسل مرتين والجافة في المكثف فراغ لمدة 30 دقيقة.
      2. ترطيب القطع هلام مع 100 ميكرولتر من 13 نانوغرام / التربسين الخنازير المعدلة ميكرولتر في بيكربونات الأمونيوم 50 ملم لمدة 16 ساعة على 37 درجة مئوية. جمع supernatants وزيادة استخراج البروتينات مع 100 ميكرولتر من حمض trifluoroacetic 5٪ في 50٪ الأسيتونتريل لمدة 30 دقيقة.
      3. التركيز على الببتيدات وصولا الى 5 ميكرولتر من فراغ الطرد المركزي تناسقRATOR وتحليل مع مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين - وقت الطيران - جنبا إلى جنب تحليل الطيف الكتلي (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. في المختبر كيناز الفحص

  1. إعداد ركائز
    1. استنساخ الفرعي مجمع الأول (CI) مفارز (NDUFV1، NDUFV3، NDUFS2، NDUFB6، وNDUFA12)، التي يتم تحديدها كأهداف Cdk1 فسفرته تفاضلي، إلى pGEX-5X-1 ناقلات لتوليد الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST) -tagged التعبير البكتيرية البلازميدات 11. تنقية مفارز CI باستخدام أعمدة الجلوتاثيون عالية تقارب بعد بروتوكول أدناه.
      1. ثقافة GST-الموسومة CI فرعية تحتوي على كولاي سلالة BL-21 في مرق مع 50 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين في شاكر عند 37 درجة مئوية لوريا، Bertani (LB) حتى الكثافة البصرية (OD) من تم التوصل 0.6. إضافة الآيزوبروبيل BD-ثيو-galactopyranoside (IPTG) إلى عبادةلدى عودتهم إلى تركيز النهائي من 0.1 ملم، واحتضان ل3 ساعة إضافية.
      2. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة لجمع البكتيريا وإعادة تعليق في 5 مل من 1 العازلة في برنامج تلفزيوني س تحتوي على 5 ملم من DTT، 1 × بروتين مثبط كوكتيل، و 0.1٪ الليزوزيم. ليز الخلايا عن طريق صوتنة لمدة عشرين 5 ثوان رشقات نارية، وإزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة.
      3. جمع طاف واحتضان مع حبات 4B-الجلوتاثيون الاغاروز في نسبة حجم 4: 1 (طاف: حبة) لمدة 1 ساعة على RT.
      4. أزل البروتينات GST الانصهار من الخرز مع 3 مل من العازلة الجلوتاثيون شطف (10 ملي الجلوتاثيون المختزل في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0) وإخضاع البروتينات مزال لغسيل الكلى في الجزيئي أنابيب غشاء مسامي (الوزن الجزيئي الحد الفاصل لل12 -14 kiloDaltons) مع 1 × PBS / 1 ملم EDTA. تخزين تنقية البروتينات في - 80 درجة مئوية.
  2. Cdk1 كيناز الفحص
    1. قبل البدء في الحمار كينازعبد المنعم يوسف، تعيين كتل التدفئة إلى 30 درجة مئوية و 100 درجة مئوية. ذوبان التجاري CyclinB1 / Cdk1 مجمع انزيم وركائز على الجليد.
    2. تحضير مزيج رد فعل على الجليد. منذ تشارك 32 ف ATP النظير، وإعداد جميع مخاليط رد فعل في 1.5 مل أنابيب العينات مع قبعات المسمار تحتوي على حلقة O لمنع انتشار النشاط الإشعاعي.
      تحذير: اتبع قواعد حماية المواد المشعة. استخدام 8 مم زجاجي سميك يحمي والعمل على الأقل تجارية بحتة. مسح أسفل أي المنطقة الملوثة بالماء.
    3. إعداد عازلة رد فعل 30 ميكرولتر تحتوي على 1 × عازلة Cdk1 (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 10 ملي MgCl2، 2 ملي DTT، 1 ملي EGTA، 0.01٪ بريج 35، ودرجة الحموضة 7.5)، 0.6 ملي اعبي التنس المحترفين البارد، 0.1 μCi 32 ف ATP، 2 وحدة من CyclinB1 / Cdk1 و 6 ميكروغرام من البروتين الركيزة. ضبط مستوى الصوت إلى 30 ميكرولتر مع ده 2 O. رد فعل إيجابي السيطرة، استبدال الركيزة مع 0.01 ملي هيستون H1، وهي معروفة جيدا CyclinB1 / Cdk1 الركيزة.
      1. لكنترول السلبيةردود الفعل ل، (1) محل الركيزة مع بروتين ضريبة السلع والخدمات فقط و (2) استبدال الركيزة مع 0.01 ملي هيستون H1 + 0.5 ميكرومتر RO-3306، وهو Cdk1 مثبط انتقائي.
    4. تخلط جيدا مع ماصة وأجهزة الطرد المركزي لجلب كل السائل إلى أسفل الأنبوب، والتقليل من مخاطر التلوث. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    5. إضافة 6 ميكرولتر من عينة العازلة 5X SDS لوقف التفاعل وتفسد على 100 ​​درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تشغيل العينات على 10٪ هلام SDS-PAGE 160 V لمدة 2 ساعة، أو حتى أمام الصبغة قد وصل إلى نهاية هلام. نقل الجل على ورقة اللوني والتفاف مع غلاف بلاستيكي.
      تحذير: جميع السائل في اتصال مع النظائر المشعة يجب أن تعامل على أنها النفايات المشعة والتخلص منها في الدامجانة زجاجة بولي 5 غالون التي تقدمها خدمات الصحة والسلامة البيئية وفقا لتوجيهات المؤسسية.
    6. فضح هلام إلى فيلم الأشعة السينية لمدة 1 يوم أو ما يصل إلى 1 في الاسبوع في -20 درجة مئوية تبعا لنشاط محدد من النظائر المشعة المستخدمةوالانزيم.

8. الموقع الموجه الطفرات لتوليد Cdk1 سلبي المهيمن (D146N)

  1. الاشعال تصميم الطفرات. اثنين الاشعال، مكملة لبعضها البعض، يحتوي على موقع متحولة (سيتم استبدال G التي كتبها A النوكليوتيدات إلى رمز ل N بدلا من مد الأحماض الأمينية) يحيط بها 20 قاعدة على كل جانب (11).
  2. إعداد 50 ميكرولتر تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) مزيج يحتوي على رد فعل العازلة 1X، 2.5 ملي dNTPs، 10 ميكرومتر الاشعال (على حد سواء إلى الأمام والخلف)، 40 نانوغرام من القالب، وده 2 O. إضافة 2.5 U من البلمرة الحمض النووي في رد الفعل.
  3. تشغيل البرنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية 3 دقائق و 95 درجة مئوية و 30 ثانية و 55 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، 68 ° C 6 دقائق. 16 دورات (ملاحظة: يتم تحديد 68 ° C فترة حضانة حسب حجم الحمض النووي مطلوب 1 دقيقة / كيلو بايت الحمض النووي ≤ 10 كيلوبايت لالحمض النووي أكبر، 2 دقيقة / كيلو بايت بالإضافة إلى 10 ثانية لكل دورة.). متابعة من قبل 68 ° C 7 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  4. إضافة2 ميكرولتر من DPN أنا انزيم التقييد (10 U / ميكرولتر) و 5.7 ميكرولتر DPN أنا العازلة، تخلط جيدا مع الصنبور لطيف مع إصبع واحتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. نقل 10 ميكرولتر DPN I-معاملة المنتجات PCR إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة DH5α للتحول. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، تليها 45 ثانية الحرارة صدمة في 42 درجة مئوية و 5 دقائق على الجليد. إضافة 500 ميكرولتر من LB ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل الطلاء على لوحات LB-أجار. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  6. اختيار مستعمرة من O / N نمت لوحات أجار باستخدام معقم الأصفر طرف ماصة، وانخفاض طرف في أنبوب يحتوي على 5 مل من LB، وتنمو O / N في 37 درجة مئوية شاكر. عزل البلازميد باستخدام طقم miniprep وتسلسل البلازميد لتأكيد طفرة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

9. تحديد دورة الخلية المرحلة أطوال مع ايدو التأسيس الفحص

  1. الفرز الخلية
    1. آرansfect 2 × 10 5 الخلايا مع ناقلات المشار إليها (MTS-GFP / RFP، MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-WT-طلب تقديم العروض أو MTS-Cdk1-DN-RFP) في لوحة 6 جيدا باستخدام 1: 2 (ث: • 2.5 ميكروغرام: 5 ميكرولتر) نسبة الحمض النووي: ترنسفكأيشن الكاشف خليط أعد في 2.5 مل serum- والمضادات الحيوية وسائل الاعلام ثقافة خالية لمدة 48 ساعة. خلايا النوع الحية يعبرون عن مستقر البروتينات CyclinB1 GFP الموسومة Cdk1 والموسومة طلب تقديم العروض عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      1. غسل الخلايا مع 1 × برنامج تلفزيوني، إضافة 100 ميكرولتر من التربسين في صحن واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة لجمع الخلايا وتمريرها من خلال 70 ميكرون فلتر لتوليد تعليق خلية واحدة. غسل تعليق خلية واحدة مع 500 ميكرولتر من 1٪ الجنين العجل المصل في برنامج تلفزيوني (FCS / PBS) قبل تحميلها على قياس التدفق الخلوي.
      2. إعداد معلمات فرز التالية البروتوكولات المعمول 18 النابضة للخلايا إيجابية مزدوجة ملطخة كلا GFP وطلب تقديم العروض. جمع الخلايا مرتبة الخروج من الكريات إلى contai أنبوبنينغ زراعة الخلايا المتوسطة واستخدام هذه الخلايا لتحليل تقدم دورة الخلية مع وضع العلامات ايدو نبض مطاردة كما هو الحال في بروتوكول 9.2.
  2. قياس طول دورة الخلية باستخدام الفحص ايدو وصفها التدفق الخلوي
    1. البذور فرز الخلايا في 6 لوحات بشكل جيد في مناطق ذات كثافة من 2.5 × 10 5 خلايا لكل بئر والثقافة O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2. إضافة EDU إلى مستنبت بتركيز نهائي من 25 ميكرومتر. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 1 ساعة.
    2. غسل الخلايا مع 1٪ BSA في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وجمعها في أنبوب 1.5 مل على فترات ساعة 2 ليصبح المجموع من 10 - 12 ساعة.
    3. خلايا الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل طاف. طرد بيليه وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من محلول التثبيت (المقدمة من قبل الشركة المصنعة داخل EDU الوسم عدة) لمدة 15 دقيقة في RT وتخلط جيدا.
    4. غسل الخلايا مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إصلاحالخلايا مرة أخرى مع 0.5 مل من الايثانول 70٪ O / N عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تحديد الإيثانول أمر بالغ الأهمية لإرواء مضان GFP / RFP الداخلي نظرا لتعبير البروتين المؤتلف الموسومة.
    5. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 350 x ج لمدة 5 دقائق ويغسل بيليه مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من العازلة permeabilization (0.1٪ تريتون-X-100، 1٪ BSA، 0.2 ملغ / مل ريبونوكلياز ألف في برنامج تلفزيوني) لمدة 20 دقيقة في RT.
    6. غسل الخلايا مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إضافة 0.5 مل من الكوكتيل رد فعل في كل أنبوب وتخلط جيدا. احتضان خليط التفاعل على RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    7. تغسل مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني مرة واحدة والحمض النووي وصمة عار مع 50 ميكروغرام / مل يوديد propidium (PI) في 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني.
    8. تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي لمتابعة السكان EDU إيجابية. الحالية مبعثر مؤامرة نقطة من الخلايا المسمى EDU الملطخة عن محتوى الحمض النووي (تلطيخ PI، المحور السيني) وايدو (اليكسا 647 تلطيخ، العمودي).
      1. استخدام قناة APC لأليكسa647-EDU استخدام عصابة تمرير الترشيح 670/30 مع جميع الحاضرين خفيفة أقل من 685 نانومتر ضرب هذا المرشح. وفيكوإيريترين قناة (PE) لPI مع عصابة تمرير الترشيح 581/15 أمامه مع جميع الحاضرين خفيفة أقل من 600 نانومتر ضرب هذا المرشح.
      2. إدراج أول أنبوب يحتوي على الخلايا في التدفق الخلوي واستخدام استراتيجية النابضة القياسية لاقتناء: قطعة FSC المساحة X SSC-منطقة لالتشكل تليها PI (قناة PE) X Alexa647-EDU (قناة APC) عن تلطيخ الخلايا. تسجيل البيانات لجميع الأنابيب واحدا تلو الآخر الحصول على 10،000 الأحداث في العينة.
      3. تحديد توزيع مرحلة دورة الخلية من الخلايا وأطوال المرحلة باستخدام التدفق الخلوي برامج تحليل البيانات التالية البروتوكولات المعمول 11،30.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التعريب شبه الميتوكوندريا من CyclinB1 وCdk1

يستخدم استخراج كربونات الصوديوم لتحديد ما إذا كان يقع على البروتين داخل الميتوكوندريا أو على السطح الخارجي، وهي الغشاء الخارجي. مرة واحدة يظهر بروتين في توطين داخل الميتوكوندريا، وزيادة عزم التعريب شبه الميتوكوندريا يمكن إجراء عبر mitoplasting جنبا إلى جنب مع عملية الهضم البروتيني. لتحديد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مثل البروتينات الموجهة للعضيات التحت خلوية أخرى، فإن البروتينات الميتوكوندريا المستهدفة تمتلك إشارات تستهدف ضمن الهيكل الأساسي أو الثانوي في أن توجيهها إلى عضية بمساعدة translocating بروتين معقد وآلات للطي 21،22. الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل (MTS) تم الحصول عليها من البروتينات المقيمين الميتوكوندريا حصرا مثل COX8 يمكن أن تضاف إلى N-محطة من أي تسلسل الجيني لاستهداف بروتينات معينة في الميتوكوندريا 11،23،24. هنا، تم استنساخ CyclinB1 وCdk1 الجينات إلى MTS COX8...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة CA133402 و CA152313 ومكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة DE-SC0001271. نشكر مختبر الموارد المشتركة لقياس التدفق الخلوي بجامعة كاليفورنيا ديفيس بتمويل من CA0933730 NCI P30 ، و NIH NCRR C06-RR12088 و S10 RR12964 و S10 RR 026825 والمساعدة الفنية من السيدة بريدجيت ماكلولين والسيد جوناثان فان دايك لمساعدتهم في تجارب قياس التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأرInvitrogen A-11003Alexa-546 مترافق
الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانبInvitrogen   ؛A11029Alexa-488 مترافق
ATPResearch Organics1166Aلمقايسة كيناز في المختبر
تقنية إشارات الخلايا للأجسام المضادة Cdk19112
Cdk1 كيناز عازلةنيو إنجلاند بيولابزP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 مجموعة التصويرLife TechnologiesC10337لتحليل دورة الخلية باستخدام وضع
العلامات على EdUتقنية إشارات الخلايا بالأجسام المضادة COX IV4844Sللتلوين المناعي للميتوكوندريا
الجسم المضاد Cyclin B1 سانتاكروز Biotechsc-752
CyclinB1 / Cdk1 مركب إنزيمنيو إنجلاند BiolabsP6020Sتجنب التجميد / الذوبان
CyDye DIGE Fluor Labeling KitGE Healthcare Life Sciences25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer KitGE علوم الحياة الصحية28-9480-26 AA
ثنائي ميثيل فورماميد سيجما ألدريتش319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004للطفرات الموجهة بالموقع
إنزيم Dpn IStratagene200519-53للطفرات الموجهة للموقع
سائل غطاء الشريط الجافGE Healthcare Life Sciences17-1335-01يستخدم كزيت معدني
EDTAJT Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge ConcentratorFisher Scientific07-748-13يستخدم كمكثف للطرد المركزي الفراغي
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01محلول تركيب مضاد للبهتان
مقياس التدفق الخلوي FortessaBD Biosciences649908لدورة الخلية التحليل باستخدام وضع العلامات على EdU
Histone H1Calbiochem382150لاختبار كيناز في المختبر
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704لتنقية شظايا الحمض النووي من المواد الهلامية
Immobiline DryStripGE Healthcare Life Sciences18-1016-61شرائط IEF (التركيز متساوي الكهرب
الجلوتاثيونالثابت Thermo Scientific15160حبات الجلوتاثيون الاغاروز
يودوأسيتاميدسيجما ألدريتشI1149IAA
IPGphor 3 وحدة التركيز المتساوية الكهربائيةGE Healthcare LifeSciences 11-0033-64IPGphor حاملي الشريط
الأيزوبروبيل-b-D-ثيو-جالاكتوبيرانوسيد RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinSigma AldrichL9783للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027كاشف الإرسال
LysineSigma AldrichL5501لوضع العلامات على CyDye
LysozymeEMD Chemicals5960
Mitoctracker أحمر / أخضرInvitrogen M7512 / M7514أصباغ الفلورسنت الميتوكوندريا
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1ناقلات التعبير
GFP PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 & nbsp;GE Healthcare Life Sciences28-9545-53ناقلات GST المعبرة
عن Phenylmethylsulfonyl فلوريدشيلتون ScientificIB01090PMSF
Phosphate BufferedSaline Life Technologies14040PBS
Spectra / Por 4 أنابيب غسيل الكلىSpectrum Labs132700كأنابيب غشائية مسامية لغسيل الكلى
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel StainLife TechnologiesP-33300لتلوين البروتينات الفوسفورية على المواد الهلامية ثنائية الأبعاد
كوكتيل مثبط البروتينازCalbiochem539134للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
QuikChange طفرات التواجد الموجهة للموقعStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104MiniPrep Plasmid Isolation
Kit RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Cdk1 مثبط
RotenoneMP Biomedicals150154المجمع الأول مثبط
كربونات الصوديومفيشر ScientificS93359
كلوريد الصوديومEMD ChemicalsSX0420-5للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
أورثوفاناديت الصوديومMP Biomedicals159664 لمحلول تحلل الخلايا
بيروفوسفات الصوديوم ديكاهيدراتألفا إيسار33385للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
الصوديوم & بيتا ؛ -جليسيروفوسفاتألفا إيسارL03425لمحلول تحلل الخلايا
SpectraMax M2e & nbsp ؛الأجهزة الجزيئيةM2Eقارئ الصفيحة
السكروزفيشر العلمي57-50-1
مدقة طاحونة الأنسجةKimble Chase885301-0007لعزل الميتوكوندريا
أنبوب طاحونة الأنسجةKimble Chase885303-0007لعزل الميتوكوندريا
محلول حمض ثلاثي كلورو أسيتيكSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TrypsinCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09ماسح ضوئي جل بالليزر ذهابا وإيابا 2D-DIGE
UbiquinoneSigma AldrichC7956
) عن الدقيقة

المراجع

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341(2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إنزيم كيناز Cdk1الإفراط في التعبير الميتوكوندريتحليل 2D-DIGEمقايسة وسم EdUقياس التدفق الخلوياستخلاص كربونات الصوديومتجزئة ما دون الميتوكوندرياتسلسل استهداف الميتوكوندريامقايسة تكاثر الخلايا
المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.