Method Article

المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نوضح كيفية دراسة توطين الميتوكوندريا لكيناز (دورة الخلية) ، وكيفية تحديد موقعه في الميتوكوندريا بالإضافة إلى ركائز / أهداف الميتوكوندريا المحتملة. يوفر التعبير القسري للبروتينات في الميتوكوندريا أداة مفيدة لدراسة العواقب الوظيفية لتوطين الميتوكوندريا للبروتين ذي الأهمية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> على الرغم من أن الميتوكوندريا تمتلك آلية النسخ الخاصة بها ، إلا أن 1٪ فقط من بروتينات الميتوكوندريا يتم تصنيعها داخل العضية. يتم نقل البروتينات المشفرة نوويا إلى الميتوكوندريا مسترشدة بتسلسلات استهداف الميتوكوندريا (MTS). ومع ذلك ، فإن غالبية البروتينات الموضعية في الميتوكوندريا تفتقر إلى MTS يمكن تحديده. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن MTS يمكن أن يوجه البروتينات للدخول إلى الميتوكوندريا توفر أداة قيمة لدراسة وظائف الميتوكوندريا للبروتينات النووية و / أو السيتوبلازمية عادة. لقد حددنا مؤخرا دورة الخلية كيناز مركب CyclinB1 / Cdk1 في الميتوكوندريا. لدراسة وظائف الميتوكوندريا لهذا المركب على وجه التحديد ، كان من الضروري الإفراط في التعبير عن الميتوكوندريا وهدمه دون التدخل في وظائفه النووية أو السيتوبلازمية. من خلال وضع علامة على CyclinB1 / Cdk1 باستخدام MTS ، تمكنا من تحقيق الإفراط في التعبير عن الميتوكوندريا لهذا المركب لدراسة أهدافه ووظائفه في الميتوكوندريا. من خلال وضع علامات على Cdk1 السلبي المهيمن باستخدام MTS ، تم تحقيق تثبيط نشاط Cdk1 خاصة في الميتوكوندريا. تم تحديد أهداف الميتوكوندريا المحتملة لمركب CyclinB1 / Cdk1 باستخدام نهج البروتينات القائمة على الهلام. على عكس تحليل الهلام التقليدي ثنائي الأبعاد ، استخدمنا تقنية الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد (2D-DIGE) متبوعة بتلوين البروتين الفوسفوري لتسمية البروتينات الفسفرية بشكل فلوري في الخلايا التي تعبر عن الميتوكوندريا Cdk1. كشف تحديد بقع البروتين الفوسفوري التي تم تغييرها في النوع البري مقابل الميتوكوندريا السلبية السائدة Cdk1 الحاملة لهوية أهداف الميتوكوندريا ل Cdk1. أخيرا ، لتحديد تأثير توطين الميتوكوندريا CyclinB1 / Cdk1 في تقدم دورة الخلية ، تم استخدام مقايسة تكاثر الخلايا باستخدام نظير الثايميدين الاصطناعي EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) لمراقبة الخلايا أثناء مرورها بدورة الخلية وتكرار الحمض النووي الخاص بها. إجمالا ، أظهرنا مجموعة متنوعة من الأساليب المتاحة لدراسة توطين الميتوكوندريا ونشاط كيناز دورة الخلية. هذه طرق متقدمة ، ولكن من السهل اتباعها والتي ستكون مفيدة للعديد من الباحثين في بيولوجيا الخلية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الثدييات، تقدم دورة الخلية يعتمد على الأحداث أمر غاية التي تسيطر عليها الحلقيات وتحركات تعتمد على السيكلين (Cdks) 1. من خلال حشوية لها، والطاقة النووية، وتوطين centrosomal، CyclinB1 / Cdk1 قادر على مزامنة الأحداث المختلفة في الانقسام مثل انهيار الغلاف النووي والانفصال الجسيم المركزي 2. CyclinB1 / Cdk1 يحمي الخلايا الإنقسامية ضد الخلايا 3 ويعزز الانشطار الميتوكوندريا، خطوة حاسمة لتوزيع متساو للالميتوكوندريا في الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا 4.

في تكاثر خلايا الثدييات، يتم إنشاء الميتوكوندريا ATP عن طريق الفسفرة ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عزل الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة

  1. إعداد عزل العازلة للخلايا (IBC) العازلة
    1. تحضير 0.1 M تريس / اجتماعات الأطراف (تريس (hydroxymethyl) aminomethane / 3- (N -morpholino) حمض propanesulfonic): ذوب 12.1 غرام من تريس في 800 مل من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام مسحوق اجتماعات الأطراف، إضافة الماء المقطر إلى ما مجموعه حجم 1 لتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعريب شبه الميتوكوندريا من CyclinB1 وCdk1

يستخدم استخراج كربونات الصوديوم لتحديد ما إذا كان يقع على البروتين داخل الميتوكوندريا أو على السطح الخارجي، وهي الغشاء الخارجي. مرة واحدة يظهر بروتين في توطين داخل الميتوكوندريا، وزيادة عزم التعريب شبه الميتوكوندريا يمكن إجراء عبر mitoplasting جنبا إلى جنب مع عملية الهضم البروتيني. لتحديد.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مثل البروتينات الموجهة للعضيات التحت خلوية أخرى، فإن البروتينات الميتوكوندريا المستهدفة تمتلك إشارات تستهدف ضمن الهيكل الأساسي أو الثانوي في أن توجيهها إلى عضية بمساعدة translocating بروتين معقد وآلات للطي 21،22. الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل (MTS) تم الحصول عليها من البروتينات المقيمين الميتوكوندريا حصرا مثل COX8 يمكن أن تضاف إلى N-محطة من أي تسلسل الجيني لاستهداف بروتينات معينة في الميتوكوندريا 11،23،24. هنا، تم استنساخ CyclinB1 وCdk1 الجينات إلى MTS COX8.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة CA133402 و CA152313 ومكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة DE-SC0001271. نشكر مختبر الموارد المشتركة لقياس التدفق الخلوي بجامعة كاليفورنيا ديفيس بتمويل من CA0933730 NCI P30 ، و NIH NCRR C06-RR12088 و S10 RR12964 و S10 RR 026825 والمساعدة الفنية من السيدة بريدجيت ماكلولين والسيد جوناثان فان دايك لمساعدتهم في تجارب قياس التدفق الخلوي.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأرInvitrogen A-11003Alexa-546 مترافق
الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانبInvitrogen   ؛A11029Alexa-488 مترافق
ATPResearch Organics1166Aلمقايسة كيناز في المختبر
تقنية إشارات الخلايا للأجسام المضادة Cdk19112
Cdk1 كيناز عازلةنيو إنجلاند بيولابزP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 مجموعة التصويرLife TechnologiesC10337لتحليل دورة الخلية باستخدام وضع
العلامات على EdUتقنية إشارات الخلايا بالأجسام المضادة COX IV4844Sللتلوين المناعي للميتوكوندريا
الجسم المضاد Cyclin B1 سانتاكروز Biotechsc-752
CyclinB1 / Cdk1 مركب إنزيمنيو إنجلاند BiolabsP6020Sتجنب التجميد / الذوبان
CyDye DIGE Fluor Labeling KitGE Healthcare Life Sciences25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer KitGE علوم الحياة الصحية28-9480-26 AA
ثنائي ميثيل فورماميد سيجما ألدريتش319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004للطفرات الموجهة بالموقع
إنزيم Dpn IStratagene200519-53للطفرات الموجهة للموقع
سائل غطاء الشريط الجافGE Healthcare Life Sciences17-1335-01يستخدم كزيت معدني
EDTAJT Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge ConcentratorFisher Scientific07-748-13يستخدم كمكثف للطرد المركزي الفراغي
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01محلول تركيب مضاد للبهتان
مقياس التدفق الخلوي FortessaBD Biosciences649908لدورة الخلية التحليل باستخدام وضع العلامات على EdU
Histone H1Calbiochem382150لاختبار كيناز في المختبر
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704لتنقية شظايا الحمض النووي من المواد الهلامية
Immobiline DryStripGE Healthcare Life Sciences18-1016-61شرائط IEF (التركيز متساوي الكهرب
الجلوتاثيونالثابت Thermo Scientific15160حبات الجلوتاثيون الاغاروز
يودوأسيتاميدسيجما ألدريتشI1149IAA
IPGphor 3 وحدة التركيز المتساوية الكهربائيةGE Healthcare LifeSciences 11-0033-64IPGphor حاملي الشريط
الأيزوبروبيل-b-D-ثيو-جالاكتوبيرانوسيد RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinSigma AldrichL9783للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027كاشف الإرسال
LysineSigma AldrichL5501لوضع العلامات على CyDye
LysozymeEMD Chemicals5960
Mitoctracker أحمر / أخضرInvitrogen M7512 / M7514أصباغ الفلورسنت الميتوكوندريا
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1ناقلات التعبير
GFP PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 & nbsp;GE Healthcare Life Sciences28-9545-53ناقلات GST المعبرة
عن Phenylmethylsulfonyl فلوريدشيلتون ScientificIB01090PMSF
Phosphate BufferedSaline Life Technologies14040PBS
Spectra / Por 4 أنابيب غسيل الكلىSpectrum Labs132700كأنابيب غشائية مسامية لغسيل الكلى
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel StainLife TechnologiesP-33300لتلوين البروتينات الفوسفورية على المواد الهلامية ثنائية الأبعاد
كوكتيل مثبط البروتينازCalbiochem539134للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
QuikChange طفرات التواجد الموجهة للموقعStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104MiniPrep Plasmid Isolation
Kit RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Cdk1 مثبط
RotenoneMP Biomedicals150154المجمع الأول مثبط
كربونات الصوديومفيشر ScientificS93359
كلوريد الصوديومEMD ChemicalsSX0420-5للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
أورثوفاناديت الصوديومMP Biomedicals159664 لمحلول تحلل الخلايا
بيروفوسفات الصوديوم ديكاهيدراتألفا إيسار33385للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
الصوديوم & بيتا ؛ -جليسيروفوسفاتألفا إيسارL03425لمحلول تحلل الخلايا
SpectraMax M2e & nbsp ؛الأجهزة الجزيئيةM2Eقارئ الصفيحة
السكروزفيشر العلمي57-50-1
مدقة طاحونة الأنسجةKimble Chase885301-0007لعزل الميتوكوندريا
أنبوب طاحونة الأنسجةKimble Chase885303-0007لعزل الميتوكوندريا
محلول حمض ثلاثي كلورو أسيتيكSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TrypsinCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09ماسح ضوئي جل بالليزر ذهابا وإيابا 2D-DIGE
UbiquinoneSigma AldrichC7956
) عن الدقيقة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

Related Articles