Method Article

تحسين توليد المستحثة العضلية باستخدام تعبيد متعدد المقارين تعرب عن النسبة المثلى من Gata4، Mef2c وTbx5

DOI:

10.3791/53426

⸱

November 13th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا بروتوكولا لتوليد iCMs باستخدام التسليم بوساطة الفيروسات القهقرية ل Gata4 و Tbx5 و Mef2c في بنية متعددة السترونيك. ينتج عن هذا البروتوكول مجموعة متجانسة نسبيا من الخلايا المعاد برمجتها مع تحسين الكفاءة والجودة وهو ذو قيمة للدراسات المستقبلية لإعادة برمجة iCM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحويل المباشر من الخلايا الليفية القلب (CFS) في العضلية التي يسببها (ICMS) يحمل إمكانات كبيرة للطب التجديدي من خلال توفير استراتيجيات بديلة لعلاج أمراض القلب. وقد تم تحقيق هذا التحويل عن طريق التعبير القسري لعوامل محددة مثل Gata4 (G)، Mef2c (M) وTbx5 (T). تقليديا، يتم إنشاؤها ICMS بواسطة مزيج من الفيروسات التعبير عن هذه العوامل الفردية. ومع ذلك، إعادة برمجة كفاءة منخفضة نسبيا والأهم من ذلك في المختبر G، M، T-transduced الخلايا الليفية لا تصبح برمجتها بشكل كامل، مما يجعل من الصعب دراسة آليات إعادة برمجة. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن رياضيات الكيمياء من G، M، T هو أمر حاسم لكفاءة إعادة برمجة ICM. ورياضيات الكيمياء الأمثل للG، M، T مع مستوى عال نسبيا من M وانخفاض مستويات G و T عن طريق استخدام ناقلات MGT متعدد المقارين (يشار إليها فيما MGT) زيادة كبيرة في كفاءة إعادة برمجة تحقيقها وتحسين نوعية ICM في المختبر. هنا نقدم وصفا مفصلا للمنهجية المستخدمة لتوليد ICMS مع MGT بناء من الخلايا الليفية القلب. وشملت عزل الخلايا الليفية القلب، جيل من الفيروسات لإعادة برمجة وتقييم عملية إعادة برمجة أيضا إلى توفير منصة لتوليد فعالة وقابلة للتكرار من ICMS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا تزال أمراض القلب والأوعية الدموية السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم ، حيث تمثل 17.3 مليون حالة وفاة سنويا1. يعد فقدان خلايا عضلة القلب الناتج عن احتشاء عضلة القلب (MI) أو قصور القلب التدريجي سببا رئيسيا للمراضة والوفيات2. بسبب القدرة المحدودة على التجدد ، تعاني قلوب الثدييات البالغة عادة من ضعف وظيفة المضخة وفشل القلب بعد الإصابة3-6. على هذا النحو ، فإن التوليد الفعال (إعادة) خلايا عضلة القلب في الجسم الحي وفي المختبر لعلاج أمراض القلب ونمذجة الأمراض هي قضية حاسمة تحتاج إلى معالجة.

التطور الأخير لإعادة البرمجة المباشرة ، والذي يعيد برمجة الخلايا مباشرة من نمط ظاهري متمايز إلى آخر دون الانتقال عبر الحالة متعددة القدرات ، يقدم نهجا بديلا واعدا للطب التجديدي. يحتوي قلب الثدييات على الخلايا الليفية القلبية الوفيرة (CFs) ، والتي تمثل ما يقرب من نصف الخلايا في القلب وتتكاثر بشكل كبير عند الإصابة7-9. وبالتالي ، يمكن أن تكون المجموعة الواسعة من CFs بمثابة مصدر داخلي لأنظمة الإدارة المتدرجة الجديدة للعلاج التجديدي إذا كان من الممكن إعادة برمجتها مباشرة إلى CMs وظيفية. لقد ثبت أن مجموعة من عوامل النسخ ، مثل Gata4 (G) و Mef2c (M) و Tbx5 (T) ، مع أو بدون microRNAs أو جزيئات صغيرة يمكن أن تعيد برمجة الخلايا الليفية إلى iCMs10-26. الأهم من ذلك ، يمكن أيضا إحداث هذا التحويل في الجسم الحي ، ويؤدي إلى تحسن في وظائف القلب وتقليل حجم الندبة في القلب المصاببالاحتشاء 16،27-29. تشير هذه الدراسات إلى أن إعادة البرمجة القلبية المباشرة قد تكون وسيلة محتملة لشفاء القلب المصاب. ومع ذلك ، فإن الكفاءة المنخفضة لإعادة برمجة iCM أصبحت عقبة رئيسية أمام مزيد من الدراسات الميكانيكية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قابلية إعادة برمجة القلب هي قضية أخرى مثيرة للجدل لهذه التكنولوجيا11،30،31.

مؤخرا ، أنشأنا مجموعة كاملة من التركيبات متعددة السترونيك التي تشفر G و M و T في جميع أوامر الربط الممكنة بتسلسلات 2A متطابقة في mRNA واحد. أسفرت تركيبات البوليسترونيك هذه عن مستويات مختلفة من التعبير عن البروتين G و M و T ، مما أدى إلى كفاءة إعادة برمجة مختلفةبشكل كبير 25. الهيكل الأكثر كفاءة ، المسمى MGT ، والذي أظهر تعبيرا مرتفعا نسبيا ل Mef2c وتعبير Gata4 و Tbx5 منخفضا ، أدى إلى تحسين كفاءة إعادة البرمجة بشكل كبير وأنتج كميات كبيرة من iCMs مع تعبير علامات CM ، وتذبذب قوي للكالسيوم وضرب تلقائي25. علاوة على ذلك ، باستخدام بناء MGT polycistronic ، تجنبت دراستنا استخدام نواقل متعددة وخلايا مولدة بنسبة تعبير متجانسة من G ، M ، T ، مما يوفر منصة محسنة لأبحاث إعادة برمجة القلب. لزيادة قابلية التكاثر التجريبي ، نصف هنا بالتفصيل كيفية عزل الخلايا الليفية ، وإنتاج الفيروسات القهقرية التي تحمل كاسيت MGT ، وتوليد iCMs وتقييم كفاءة إعادة البرمجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول المذكورة هنا يستخدم الفئران حديثي الولادة. تتم رعاية الحيوانات والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها شعبة الطب المخبري الحيوان (DLAM) في جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل.

1. إعداد المخازن والإعلام

  1. إعداد الخلايا الليفية (FB) المتوسطة: الملحق 500 مل سائل الإعلام IMDM مع 100 مل مصل بقري جنيني (FBS) و 6 مل البنسلين / الستربتومايسين.
  2. إعداد ICM المتوسطة: الملحق 400 مل سائل الاعلام DMEM مع 100 مل سائل الإعلام M199 و 50 مل FBS.
  3. إعداد B27 المتوسطة: الملحق 490 مل RPMI1640 وسائل الإعلام مع 10 مل B27 وسائل الإعلام.
  4. إعداد بلات-E مستنبت: الملحق 500 مل DMEM وسائل الإعلام مع 50 مل FBS، 5 مل البنسلين / الستربتومايسين و 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية.
  5. إعداد بلات-E ترنسفكأيشن المتوسطة: الملحق 500 مل DMEM وسائل الإعلام مع 50 مل FBS و 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية.
  6. العلاقات العامةepare الجيلاتين المغلفة 24 لوحة جيدا: إضافة 0.5 مل 0.1٪ محلول الجيلاتين إلى بئر من 24 لوحة جيدا، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل، ونضح الحق قبل الاستخدام.
  7. إعداد FACS العازلة العلامات: الملحق 500 مل DPBS مع 10 مل FBS و 2 مل EDTA (0.5 M) للوصول إلى تركيز النهائي من 2 مم. تمر عبر مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  8. إعداد MACS الفرز العازلة: الملحق 500 مل DPBS مع 2.5 ز BSA و 2 مل EDTA (0.5 M) للوصول إلى تركيز النهائي من 2 مم. تمر عبر مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  9. إعداد العازلة HBS 2X لترنسفكأيشن: تكملة 500 مل HEPES العازلة (50 ملم) مع 280 ملي كلوريد الصوديوم (8.1816 ز)، 10 ملي بوكل (0.37275 جم)، 1.5 ملي نا 2 هبو 4 (0.10647 جم)، 12 ملي الجلوكوز (1.08096 جم ). إضافة حوالي 650 ميكرولتر 10 N هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة الحموضة إلى 7،05-7،12. مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  10. إعداد 2.5 M CaCl 2 حل لترنسفكأيشن: إضافة 18.376 ز كاالبنود 2-50 مل ده 2 O. مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  11. إعداد ICC (مناعية) عازلة التثبيت: إضافة 5 مل بارافورمالدهيد (PFA، 32٪) إلى 35 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 4٪.
  12. إعداد ICC العازلة permeabilization: إضافة 0.1 مل تريتون إلى 100 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 0.1٪.
  13. إعداد ICC عازلة حظر: إضافة 5 ز المصل البقري الزلال (BSA) إلى 100 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 5٪.
  14. إعداد ICC عازلة تلطيخ: إضافة 1 ز BSA إلى 100 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 1٪.

2. جيل من الأطفال حديثي الولادة ماوس القلب الليفية

  1. توليد الخلايا الليفية القلب من طريقة ثقافة يزدرع
    1. نظيف حديثي الولادة αMHC-GFP الماوس المعدلة وراثيا (P1 إلى P2) مع 75٪ من الإيثانول. قطع رأس قبالة مع مقص العقيمة. ثم إجراء شق أفقي من تحت الإبط واحدة إلى أخرى. استخدام معقمملقط حادة وعازمة على تشريح من القلب ووضعه في بئر واحدة من لوحة 24 جيدا تحتوي على الجليد الباردة PBS العازلة.
      1. بدلا من ذلك، اخراج القلب بعد شق أفقي.
    2. تحقق من التعبير GFP في القلب عن طريق المجهر الفلورسنت. منذ مدفوعة التعبير GFP التي كتبها αMHC المروج الذي هو المروج معين في القلب، وينبغي أن يكون القلب من الماوس المعدلة وراثيا في الأخضر 15، في حين أن القلب السلبي الباهت في أي مضان.
    3. يستغرق 3-4 GFP قلوب الإيجابية إلى 60 ملم مركز جيد صحن الثقافة واللحم المفروم إلى قطع صغيرة أقل من 1 مم 3 في حجم بواسطة مقص العقيمة وملقط.
    4. ضع 3-4 قلوب المفروم في واحد صحن 10 سم مع 2 مل سائل الإعلام FB. السماح للأنسجة يستقر لمدة 3 ساعة.
    5. إضافة ببطء 8 مل قبل تحسنت وسائل الإعلام FB إلى الأطباق التي تحتوي على أنسجة القلب. لا تخل الأنسجة لمدة ثلاثة أيام.
    6. استبدال وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام.
    7. في يوم 7، aspirأكل مستنبت وغسل الخلايا مع DPBS. إضافة 3 مل 0.05٪ التربسين إلى كل لوحة وهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    8. إضافة 5 مل سائل الإعلام FB لإرواء التربسين. بلطف فصل الخلايا مع مكشطة الخلية. ماصة وسائل الاعلام صعودا وهبوطا لفصل مزيد ميكانيكيا الأنسجة.
    9. جمع الخلايا وتصفية من خلال 40 ميكرومتر مصافى الخلية لتجنب التلوث من شظايا أنسجة القلب، ومن ثم بيليه الخلايا من خلال الدوران في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. غسل الخلايا مرة واحدة مع MACS العازلة والخلايا جاهزة للفرز.
  2. توليد الخلايا الليفية القلب من طريقة الهضم انزيم
    1. حصاد GFP قلوب إيجابية 2.1.1. نقل كل القلوب في صحن 10 سم مع 10 مل DPBS الجليد الباردة.
    2. ضغط البطينين مع ملقط معقم لإزالة الدم وشطف مرة واحدة مع DPBS الجليد الباردة.
    3. تقليم قلوب لتكون خالية من الأنسجة والدهون الأخرى.
    4. قطع كل القلب إلى ما يقرب من 4 قطع التي لا تزال ارتباطا فضفاضا.
    5. إذا كانت أقل من 20 القلوب، نقل نفوس الى 15 مل أنبوب مخروطي مع 8 مل دافئ 0.05٪ التربسين-EDTA، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      1. إذا كان هناك 20-30 القلوب، ونقل القلوب إلى 50 مل أنبوب مخروطي مع 10 مل دافئ 0.05٪ التربسين-EDTA، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    6. تجاهل التربسين وإضافة 5 مل (لأقل من 20 القلوب) أو 10 مل (لمدة 20-30 القلوب) الدافئة النوع الثاني كولاجيناز (0.5 ملغ / مل) في HBSS.
    7. دوامة أنبوب على vortexer لمدة 1 دقيقة على مستوى السرعة في جميع أنحاء 4-6 (إذا كان السائل لا تحصل على ما يصل إلى الغطاء، ثم سرعة على ما يرام).
    8. احتضان أنبوب في 37 ° C حمام الماء لمدة 3-5 دقيقة.
    9. دوامة الأنبوب لمدة 1 دقيقة.
    10. الرواسب لمدة 1 دقيقة عن طريق الجاذبية حتى قطعة نسيج يستقر، وجمع السائل في أنبوب جديد يحتوي على 5 مل FB الباردة المتوسطة.
    11. كرر الخطوات من 2.2.6-2.2.10 3-5 مرات.
    12. الجمع بين جميع المجموعات من خلال تصفية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومترلجعل تعليق خلية واحدة.
    13. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    14. خلايا resuspend في 10 مل MACS العازلة، وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    15. اختياري: إذا كان هناك الكثير من خلايا الدم، Resuspend الخلايا مع 1 مل RBC تحلل العازلة (150 ملي NH 4 الكلورين، 10 ملي KHCO 3، و 0.1 ملي EDTA)، والحفاظ على الجليد لمدة 1 دقيقة، ثم تمييع مع 10 مل MACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. غسل واحد لمزيد من الوقت مع العازلة MACS.
  3. عزل Thy1.2 + الليفية التي كتبها MACS (المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا)
    1. تحديد عدد الخلايا قابلة للحياة من خلال تلطيخ التريبان الأزرق.
      1. يستغرق 10 ميكرولتر من خلايا من 10 مل تعليق خلية في الخطوة 2.2.14. مزجها مع 10 ميكرولتر 0.4٪ التريبان حل الأزرق.
      2. إضافة الخليط إلى عدادة الكريات. السماح لها الوقوف لمدة 3-5 دقيقة ثم فحص على الفور تحت المجهر. وملطخة في الخلايا الزرقاء وقابلة للحياة الخلايا الميتة هي غير ملوثين.
        3. عدد جميع خلايا قابلة للحياة في أربعة مربعات 1 مم ركن من أركان عدادة الكريات. تحديد عدد الخلايا قابلة للتطبيق: متوسط ​​عدد لكل متر مربع × 2 (عامل التخفيف) × 10 4 × 10 (الحجم الكلي للتعليق الخلية).
    2. أقل من 1 × 10 7 خلايا، Resuspend الخلايا مع بلي Thy1.2 10 ميكرولتر في 90 ميكرولتر برود عازلة MACS. إضافة المزيد من الخرز نسبيا إذا كان هناك أكثر من 1 × 10 7 الخلايا. تخلط جيدا واحتضان في الثلاجة (2-8 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
    3. إضافة 10 مل MACS العازلة وعينات تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق. يغسل مرة واحدة مع 10 مل MACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
    4. تحقيق وحدة التخزين إلى 2 مل العازلة في MACS.
    5. إنشاء فاصل MACS في غطاء محرك السيارة. إدراج عمود LS لالفاصل. تطبيق 3 مل MACS العازلة إلى العمود لكي تتوازن فيه.
    6. تمرير تعليق الخلية من خلال العمود LS معايرتها.
    7. يغسل 3 مرات مع 2 مل MACS العازلة في كل مرة.
    8. تأخذ العمود LS قبالة ركان فاصل وأزل 3 مرات مع 2 مل MACS العازلة في أنبوب جديد 50 مل.
    9. تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. خلايا resuspend في 10 مل سائل الإعلام FB، عد الخلايا والبذور في لوحات في كثافة المناسبة. لالليفية الناتجة عن أسلوب ثقافة يزدرع، يمكن أن كثافة الخلايا البذر يكون حوالي 2-3 × 10 4 خلايا / جيد من 24 لوحة جيدا. لالليفية ولدت من طريقة انزيم الهضم، يمكن أن كثافة الخلايا تكون حوالي 4-5 × 10 4 خلايا / جيد من 24 لوحة جيدا.

3. توليد الارتجاعي للICM إعادة برمجة

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية في BSL2 خزانة السلامة البيولوجية تحت ظروف معقمة. يوصى التخلص السليم من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، نصائح ماصة والأنابيب لتجنب خطر حدوث الأخطار البيئية والصحية.

  1. الحفاظ على خلايا بلات-E في بلات-E وسائل الإعلام تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل بوروميسين و 10 ميكروغرام / مل بlasticidin عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  2. في يوم 2 استبدال المتوسطة التي كتبها بلات-E مستنبت تفتقر بوروميسين وblasticidin.
  3. في اليوم 0، تقسيم الخلايا بلات-E في 10 سم أطباق اليوم قبل ترنسفكأيشن في حوالي 4-5 × 10 6 خلايا لكل لوحة. يجب أن تكون الخلايا ~ 80-90٪ متكدسة يوم ترنسفكأيشن.
  4. في يوم 1، وسائل الإعلام ثقافة التغيير إلى وسائل الإعلام ترنسفكأيشن على الخلايا داخل 1 ساعة قبل ترنسفكأيشن. إجراء ترنسفكأيشن على النحو التالي:
    1. ترنسفكأيشن باستخدام مجموعات تجارية
      1. مزيج 20 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن (على سبيل المثال Lipofectamine) و 500 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل (على سبيل المثال، غروب MEM). إضافة 10 ميكروغرام من البلازميد فيروسات إلى 500 ميكرولتر آخر خفضت وسائل الاعلام المصل. احتضان كل الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
      2. إضافة ببطء الخليط إلى خليط ترنسفكأيشن البلازميد. هذه الخطوة قد تستغرق 15-30 ثانية. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في RT (قد يظهر حل غائم).
      3. إضافة قطرة مزيج من الحكمة أن الخلايا.
      4. احتضان بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    2. ترنسفكأيشن باستخدام فوسفات الكالسيوم.
      1. مزيج 40 ميكرولتر 2.5 M CaCl 2 و 440 ميكرولتر ده 2 O، ثم إضافة 20 ميكروغرام من البلازميد فيروسات (ضبط كمية من ده 2 O بحيث الحجم الإجمالي هو 500 ميكرولتر).
      2. إضافة 500 ميكرولتر 2X HBS إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
      3. دوامة HBS وفي الوقت نفسه إضافة خليط-DNA الكالسيوم إلى HBS قطرة من الحكمة. هذه الخطوة يستغرق حوالي 30 ثانية لكل عينة. حتى الحد الأقصى قيام 3-4 عينات في وقت واحد.
      4. في احتضان RT لمدة 3 دقائق الحضانة لوقت أطول يؤدي إلى راسب أكبر والخلايا أقل ستتناول راسب.
      5. يضاف خليط إسقاط الحكمة أن الخلايا ومراقبة تحت المجهر 20X. وينبغي أن ينظر الرواسب الدقيقة (الكثير من الشركات الصغيرة هي جيدة ولكن عدد قليل من الشركات الكبيرة ليست جيدة).
      6. احتضان بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  5. في يوم 2، تغيير وسائل الاعلام على الخلايا مع 8 مل prewarmed سائل الإعلام والثقافة. احتضان لمدة 24 ساعة.
  6. في يوم 3 و 4 يوم، وجمع ثقافة طاف من الأطباق باستخدام الحقنة 10 مل العقيمة، وتصفية من خلال 0.45 ميكرون حجم المسام السليلوز مرشح خلات، ونقل في أنبوب 50 مل. إضافة 2 مل من الفيروس الارتجاعي هطول حل كل 8 مل تحتوي على فيروس طاف. مزيج بلطف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  7. في يوم 5، وتدور الخليط الفيروسي في 1500 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يجب أن تظهر الجسيمات الفيروسية في بيليه الأبيض في الجزء السفلي من الأنبوب.
  8. تجاهل طاف. تدور باستمرار الحل المتبقي بواسطة الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة كل آثار السائل بواسطة الشفط، مع الحرص الشديد على عدم تعكير صفو الرجعية الجسيمات المترسبة في بيليه.
  9. و resuspend الكريات فيروسات مع 100 ميكرولتر العازلة DPBS لكل 8 مل طاف الفيروسي. قاسم غير تامفيروس على الجليد. استخدامها على الفور أو تخزين في -80 ° C.

4. إعادة برمجة الخلايا الليفية القلب

  1. إضافة 4 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حل polybrene في ICM المتوسطة 10 مل، والمزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. التركيز النهائي من polybrene هو 4 ميكروغرام / مل.
  2. إضافة 500 ميكرولتر وسائل الإعلام ICM التي تحتوي على polybrene إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا المصنف مع الخلايا الليفية.
  3. إضافة 10 ميكرولتر الارتجاعي لتحتوي كل منها على ما يرام سواء 3/2 × 10 4 الخلايا من ثقافة يزدرع أو 4-5 × 10 4 الخلايا من طريقة انزيم الهضم. وينبغي زيادة كمية الفيروس بشكل متناسب مع زيادة عدد الخلايا في لوحات ثقافة مختلفة أو الأطباق. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة للسماح للعدوى فيروسية. يظهر خط الزمن لإعادة البرمجة القلب في الشكل 1.
  4. بعد تنبيغ الفيروسية، استبدل الفيروس التي تحتوي على وسائل الاعلام مع 500 ميكرولتر وسائل الإعلام ICM منتظم.
  5. تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. لاختيار الإيجابية للخلايا transduced الفيروسية، إضافة وسائط ICM تستكمل مع بوروميسين في 2 ميكروغرام / مل لاستهداف الخلايا. يبقيه لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك، والحفاظ على بوروميسين في المتوسط ​​ICM في تركيز 1 ميكروغرام / مل.
  6. بعد ثلاثة أيام من العدوى الفيروسية، واتخاذ لوحة الخروج من الحاضنة ووضعه تحت المجهر الفلورسنت المقلوب (20X) لمراقبة GFP التعبير.
    ملاحظة: بعد عشر أيام من العدوى الفيروسية، ويمكن أن تحصد الخلايا لتحليل FACS وتحليل للمحكمة الجنائية الدولية لتحديد كفاءة إعادة برمجة (في الخطوة 5 و 6).
  7. بعد أربعة عشر يوما عدوى فيروسية، استبدال ICM وسائل الاعلام مع وسائل الإعلام B27. تغيير وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام. قد تظهر الضرب العفوي خلية مواضع من ثلاثة (الخلايا من طريقة الهضم انزيم) أو أربعة (الخلايا من يزدرع الأسلوب الثقافة) أسابيع بعد تنبيغ الفيروسية.

5. تحليل Immunocytochemical من كفاءة إعادة برمجة

  1. الخلايا شطفمع الثلج الباردة PBS ثلاث مرات؛ إزالة حل الزائد.
  2. إضافة 0.5 مل ICC عازلة التثبيت إلى كل بئر من 24 لوحات جيدة. إصلاح الخلايا في RT لمدة 15-20 دقيقة.
  3. شطف الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
  4. إضافة 0.5 مل ICC العازلة permeabilization إلى كل بئر من 24 لوحات جيدة. Permeabilize الخلايا في RT لمدة 15 دقيقة.
  5. شطف الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
  6. إضافة 0.5 مل ICC عرقلة العازلة إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا، في احتضان RT لمدة 1 ساعة.
  7. الأجسام المضادة الأولية مخففة مع العازلة تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية. إضافة 200 ميكرولتر الحلول الضد إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يتم سرد العوامل الأجسام المضادة في تخفيف المواد.
  8. في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
  9. إضافة 200 ميكرولتر الحلول الضد الثانوية إلى الخلايا واحتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
  10. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث مرات.
  11. إضافة 150 ميكرولتر تركيب محلول يحتوي على دابي إلى كل بئر. السماح لوصمة عار نواة لمدة 1 دقيقة. ثمتغطية كل بئر مع جولة الغطاء الزجاجي الانزلاق واضغط بلطف زلة ضد السطح السفلي مع ملقط لإزالة فقاعات الهواء.
  12. نضح الحل الزائد والعينات جاهزة للتصوير. وتظهر الصور التمثيلية تظهر الخلايا المعاد برمجتها التي تعبر عن علامة القلب cTnT وαActinin في D14 في الشكل 2B.

6. تحليل FACS من كفاءة إعادة برمجة

  1. اغسل خلايا مرة واحدة مع DPBS. إضافة 0.3 مل التربسين (0.05٪) إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. اضغط برفق لوحة لتسهيل رفع الخلايا. تحقق من مفرزة الخلايا تحت المجهر. إضافة 1 مل FACS العازلة على كل جانب عندما يتم فصل معظم الخلايا. ماصة صعودا وهبوطا لفصل مزيد ميكانيكيا الخلايا.
  3. نقل الخلايا في لوحة جيدا 24 إلى 96 لوحة بئر عميقة جيدا جيدا جيدا. تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية لجمع الخلايا.
  4. غسل الخلايا مرة واحدة معFACS العازلة.
  5. إضافة 100 ميكرولتر الحلول تثبيت / permeabilization ل resuspend الخلايا لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. غسل الخلايا مرتين مع حل 1X غسل، بيليه، وإزالة طاف.
  7. يعد حل الأجسام المضادة الأولية ضد GFP وcTnT في غسل العازلة 1X. تماما resuspend كل عينة مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. غسل خلايا مرة واحدة في محلول غسل 1X، بيليه، وإزالة طاف.
  9. إضافة 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على فلور اليكسا 488 حمار مترافق مفتش المضادة للأرنب وفلور اليكسا 647 حمار مترافق مكافحة الفأر مفتش لكل عينة. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  10. غسل خلايا مرة واحدة في محلول غسل 1X، بيليه، وإزالة طاف.
  11. Resuspend الخلايا في 400 ميكرولتر العازلة التثبيت (DPBS مع 1٪ PFA). نقل الخلية في أنبوب FACS مع غطاء مصفاة الخلية. عينات جاهزة للكشف FACS. تحليل FACS التمثيلي للبرمجة الكفاءهذ باستخدام pMxs-بوروميسين-MGT بناء مع أو بدون اختيار بوروميسين هو مبين في الشكل 2A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتولى التخطيطي لخص خطوات إعادة برمجة في الشكل 1. بعد MGT تنبيغ، يمكن الكشف عن التعبير GFP في إعادة برمجة الخلايا في وقت مبكر من يوم 3. بوروميسين اختيار الخلايا transduced تبدأ من يوم 3 وحافظت خلال الأسبوعين الأولين إذا PMX-بورو يستخدم بناء -MGT. يوم 10 إلى يوم 14، قد يتم الكشف عن التعبير عن علامات القلب مثل cTnT وαActinin من قبل كل من المحكمة الجنائية الدولية (الشكل 2B، الخطوة 5) وFACS (الشكل 2A، الخطوة 6)، مشيرا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوليد ICM الناجح عند استخدام هذا البروتوكول، وهناك العديد من العوامل الهامة التي تؤثر على الكفاءة بوجه عام. خاصة في ظل الظروف الخلايا الليفية بدء ونوعية الترميز الارتجاعي MGT يمكن أن تؤثر بشكل كبير على كفاءة إعادة برمجة.

من المهم لتوليد الخلايا الليفية كما طازجة وصحية ممكن. ليزدرع الأسلوب الثقافة والليفية يمكن استخدامها من قبل كانت مطلية سبعة أيام بعد إإكسبلنتس على الأطباق. لانزيم طريقة الهضم، والخلايا الليفية ي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون للمساعدة الفنية المتخصصة من UNC Flow Cytometry Core و UNC Microscopy Core. نشكر أعضاء مختبر Qian ومختبر Liu على المناقشات المفيدة والمراجعات النقدية للمخطوطة. تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة HL109079 من المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI R00 للدكتور ليو ومنحة تطوير العلماء لجمعية القلب الأمريكية (AHA) 13SDG17060010 ومنحة الباحث الجديد لمؤسسة إليسون الطبية (EMF) AG-NS-1064-13 للدكتور تشيان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
التروبونين المضاد للقلب TThermo ScientificMS-295-PO1:200 ل FACS و 1:400 ل ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 لكل من FACS و ICC
anti- aActininSigma-AldrichA78111:500 لكل من FACS و ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 for  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441: 1,000 ل ICC   ؛
anti-Gata4سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-12371:200 ل ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 ل ICC
Alexa Fluor 488 & ndash ؛ الحمار المترافق المضاد للأرانب IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521: 500 لكل من FACS و ICC
Alexa Fluor 647 & ndash ؛ الحمار المترافق المضاد للفأر IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501: 500 لكل من FACS و
ICC Cytofix / Cytoperm kit للتلوين داخل الخلاياBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium ImagingLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microbeadsMiltenyi Biotec130-049-101
حل Vectashield مع DAPIمختبرات ناقلاتH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0.05٪)Corning25-052
PRMI1640تقنيات الحياةالمتوسطة 11875-093
مكمل B27Life Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM تقنيات مصل متوسطالعمرمخفضة 31985-070
M199 تقنيات العمر المتوسط10-060
DMEM ، تقنيات حياة الجلوكوز العالي10-013
البنسلين الستربتومايسينكورنينج30-002
الأحماض الأمينية غير الأساسيةLife Technologies11130-050
ليبوفيكتامين 2000لايف تكنولوجيز11668500
بلاستيسيدينلايف تكنولوجيزA11139-03
بورومايسينلايف تكنولوجيزA11138-03
كولاجيناز الثانيورثينجتونLS004176
بوليبرينميليبورTR-1003-G
تريتون X-100فيشرBP151-100
CaCl< فرعي>2< / فرعي>سيجما ألدريتشC7902
هيبسسيجما ألدريتشH4034
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشBP358-212
KClسيجما ألدريتشPX1405
Na2< / sub>HPO4< / sub>Sigma-AldrichS7907
الجلوكوزسيجما ألدريتشG6152
ألبومين مصل الأبقارفيشر9048-46-8
بارافورمالدهيدEMS15714
محلول ترسيب الفيروسات القهقريةALSTEMVC-200
0.4٪ محلول تريبان الأزرقسيجما ألدريتشT8154
الجيلاتينسيجما ألدريتشG1393
برنامج تلفزيوني Dulbecco بدون CaCl 2 < / sub > و MgCl 2< / sub > (D-PBS ، 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (محلول الملح المتوازن هانكس) Corning21022
LSالعمود Miltenyi Biotec130-042-401
0.45 & mu ؛ م مرشح أسيتات السليلوز Thermo Scientific190-2545
24 بئر ألواحCorning3524
10 سم أطباق زراعة الأنسجة Thermo Scientific172958
60 مم طبق ثقافة بئر مركزي   ؛  Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 مل من مادة البولي بروبيلين بئر عميقة صفيحةDenville ScientificP9639
أنابيب البوليسترين ذات القاع المستدير مع غطاء مصفاة الخلية   ؛BD Biosciences352235
الطرد المركزيEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS فاصلMiltenyi Biotec130-042-302
زلة غطاء زجاجي دائريعلوم المجهر الإلكتروني72195-15
Kit

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Induced CardiomyocytesCardiac FibroblastsPolycistronic ConstructGata4 Mef2c Tbx5Retroviral ReprogrammingCell IsolationFlow Cytometry AnalysisImmunochemistry DetectionPurmycin SelectionGFP Expression

Related Articles