Method Article

التصوير في الوقت الحقيقي من النبات خلية سطح حيوية مع زاوية المتغير المجهر epifluorescence

DOI:

10.3791/53437

⸱

December 12th, 2015

1Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا البروتوكول هو لإظهار كيفية رصد ديناميات البروتين fluorescently الموسومة على أسطح الخلايا النباتية مع متغير الزاوية المجهر epifluorescence، والتي تبين وامض النقاط من الموسومة GFP PATROL1، وهو بروتين الاتجار الغشاء، في القشرة خلية من مجمع الثغور في نبات الأرابيدوبسيس thaliana.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سطح خلية النبات هو واجهته لإدراك الإشارات البيئية ؛ يستجيب للتغيرات البيولوجية للخلية مثل تهريب الأغشية وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي. سيؤدي تحليل الصور في الوقت الفعلي وعالي الدقة لمثل هذه الأحداث داخل الخلايا إلى زيادة فهم بيولوجيا الخلايا النباتية على المستوى الجزيئي. الفحص المجهري اللامع متغير الزاوية (VAEM) هو تقنية ناشئة توفر صورا عالية الجودة بفاصل زمني للبروتينات ذات العلامات الفلورية على سطح الخلية النباتية. في هذه المقالة ، يتم وصف الإجراءات العملية لإعداد عينة VAEM ، وتعديل النظام البصري VAEM ، والتقاط الأفلام وتحليل الصور. كمثال على ملاحظة VAEM ، يتم تقديم نتائج تمثيلية حول ديناميكيات PATROL1. هذا بروتين ضروري لحركة الفم ، ويعتقد أنه يشارك في توصيل مضخة البروتون إلى أغشية البلازما في مركب الفم في نبات الأرابيدوبسيس الثاليانا. أظهرت المراقبة في الوقت الفعلي لخلايا الحراسة والخلايا الفرعية في A. thaliana cotyledons أن PATROL1 ذات العلامات الفلورية ظهرت كهياكل تشبه النقاط على أغشية البلازما لعدة ثوان ثم اختفت. حدد تحليل Kymograph لبيانات فيلم VAEM التوزيع الزمني لوجود (يسمى "وقت الإقامة") للهياكل الشبيهة بالنقاط. تمت مناقشة استخدام VAEM في سياق هذا المثال.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سطح الخلية النباتية ، بما في ذلك غشاء البلازما والسيتوبلازم المجاور له مباشرة ، هو المنطقة الرئيسية لإدراك الخلية النباتية وتكامل الإشارات الحيوية وغير الحيوية من البيئة خارج الخلية. استجابة لهذه الإشارات ، تخضع مكونات سطح الخلية بما في ذلك بروتينات غشاء البلازما والهيكل الخلوي القشري لتغييرات ديناميكية ، على مقياس زمني من ثوان إلىدقائق 1-4. وبالتالي ، فإن التصوير في الوقت الفعلي وعالي الدقة للبروتينات الفلورية على سطح الخلية يمكن أن يضيء استجابات النبات للإشارات البيئية على المستوى الجزيئي.

يعد الفحص المجهري للمسح بالليزر

أداة قوية لتحديد توطين البروتين الموسوم بالفلورسنت3 ، ومع ذلك ، غالبا ما يكون من الصعب مراقبة ديناميكيات البروتين في الوقت الفعلي بسبب أوقات التقاطها الطويلة نسبيا. من التقنيات الناشئة للمراقبة في الوقت الفعلي للبروتينات في الخلية النباتية الفحص المجهري الفلوري متغير الزاوية (VAEM) ، وهو تكيف للمعدات المستخدمة عادة في الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF). في الفحص المجهري TIRF ، مصدر ضوء الإثارة الفلورية هو مجال ضوئي زائل يتم إنشاؤه عندما تكون زاوية دخول الليزر ضحلة بدرجة كافية لتعكس الضوء داخليا تماما في واجهة الزجاج والماء. يبلغ عمق اختراق مجال الضوء الزائي حوالي 100 نانومتر. يعد الفحص المجهري TIRF أداة رائعة لتصوير الجزيء الفردي ، مثل الكشف عن إفراز الخلايا الحيوانية5. ومع ذلك ، لا يمكن للضوء الزائل الوصول إلى أغشية البلازما أو السيتوبلازم القشري في الخلايا النباتية ، لأن لها جدران خلوية سميكة. في الآونة الأخيرة ، تم تكييف معدات الفحص المجهري TIRF من قبل علماء أحياء الخلايا النباتية ، مع ملاحظة أن الليزر ، إذا كان بزاوية أعمق قليلا مما كان عليه عند استخدامه للحث على ظواهر الانعكاس الداخلي الكلية ، يمكن أن يثير سطح عينات الخلايا النباتية ، مما يؤدي إلى تصوير عالي الجودة للخلايا النباتية6،7. يختلف عمق إضاءة الإثارة عن طريق ضبط زاوية دخول الليزر. لذلك ، توصف هذه التقنية بأنها VAEM. يسمى هذا النظام البصري أيضا الفحص المجهري TIRF متغير الزاوية (VA-TIRFM) لأن هناك احتمال أن يحدث الانعكاس الكلي في واجهة جدار الخلية والمحيط7 ، ومع ذلك ، يتم استخدام مصطلح VAEM في هذه المقالة ، وفقا للتقرير الأول في النباتات6.

الهدف من هذا البروتوكول هو توضيح الإجراءات العملية لاستخدام VAEM لتصور ديناميكيات البروتين الموسومة بالفلورسنت على أسطح الخلايا النباتية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف بروتوكول تحليل الصور لتحديد وقت الإقامة (مدة وجود) الجزيئات لتحليل فيلم VAEM. يستخدم وميض نقطة GFP-PATROL1 على الخلايا المعقدة الفموية في نبات الأرابيدوبسيس thaliana cotyledons كمثال. تم تحديد PATROL1 من خلال الأساليب الجينية الأمامية كجين سببي لمتحور عيب الاستجابة الفموية في A. thaliana8. PATROL1 هو متماثل نباتي ل MUNC-13 ، وهو عامل تحضيري في إفراز الحويصلة المشبك8. استجابة للإشارات البيئية ، مثل الضوء أو الرطوبة ، يعتقد أن PATROL1 ينظم بشكل عكسي توصيل مضخة البروتون إلى أغشية البلازما في مجمع الفم. تتكون كل من المجمعات الفموية من زوج من خلايا الحراسة8 والخلايا الفرعية9 ، وتتطلب مضخة بروتون لحركة الفم. في هذه الخلايا ، يتم توطين PATROL1 الموسومة ب GFP إلى هياكل تشبه النقاط تبقى على غشاء البلازما لمدة تقل عن 1 دقيقة9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الشتلات

  1. تعقيم البذور.
    1. تحضير محلول التعقيم عن طريق إضافة 500 ميكرولتر NaClO (الكلور المتاحة: 5.0٪) و 1 ميكرولتر 10٪ تريتون X-100-500 ميكرولتر الماء المعقم.
    2. مكان كاليفورنيا 10 المعدلة وراثيا A. thaliana البذور تحمل GFP-PATROL1 8 في أنبوب 1.5 مل.
    3. إضافة 1 مل 70٪ محلول الإيثانول، ومزيج جيد من قبل قلب خمس مرات. يترك لمدة 1 دقيقة.
    4. مراقبة البذور تنزل الى قاع الأنبوب. في نظيفة مجلس الوزراء تدفق الصفحي، وإزالة بلطف الايثانول 70٪ باستخدام micropipette، وإضافة 1 مل من محلول التعقيم. مزيج جيد من قبل قلب خمس مرات ويترك لمدة 5 دقائق.
    5. تغسل البذور. لا تزال تعمل تحت ظروف معقمة على مقاعد البدلاء النظيفة، وإزالة بلطف الحل باستخدام micropipette، وإضافة 1 مل من الماء المعقم. كرر هذه خمس مرات. يمكن تخزين البذور المعقمة في الماء المعقم عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
  2. هكذاث البذور المعقمة على 0.5٪ جيلان-عزز اللثة 1/2 Murashige وسكوغ لوحة المتوسطة (درجة الحموضة 5.8) 9. الشريط غطاء على لوحة باستخدام طبقتين من الشريط الجراحية.
  3. احتضان لوحة في الظلام في 4 درجة مئوية مع غرفة التخزين البارد، O / N.
  4. نقل لوحة في غرفة النمو وضعت في 23.5 درجة مئوية مع / 12 ساعة دورة ضوء الظلام لمدة 12 ساعة باستخدام 100 ميكرومول م -2 ثانية -1 أضواء بيضاء، واحتضان لمدة 7 أيام. الشتلات مع النبتات من حوالي 1 مم طويل ويمكن بعد ذلك أن تحصد.

2. السماء قطرة تركيب النبتة العينات

ملاحظة: ثمة عامل مهم في إعداد العينات للمراقبة VAEM هو تجنب إدراج فقاعات الهواء بين العينة وغطاء زجاجي. فقاعات يقلل كثيرا من جودة الصورة من خلال التسبب في VAEM الاختلافات في معامل الانكسار. وهناك طريقة بسيطة، والتي طالبنا 'قطرة السماء "تصاعد مستمر، ويمكن استخدامها لتجنب الفقاعاتبين A. النبتات thaliana وغطاء زجاجي. ينبغي أن يتم ذلك مباشرة قبل المراقبة.

  1. ضع 30 ميكرولتر من العازلة القاعدية [5 ملي 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic حمض تريس (MES-تريس) في درجة الحموضة 6.5، 50 ملي بوكل، 100 ميكرومتر CaCl 2] في وسط شريحة زجاجية (الحجم: 76 × 26 مم، سمك: 1،0-1،2 مم).
  2. إزالة فلقة من الشتلات القديمة لمدة 7 أيام باستخدام مقص تشريح. تعويم فلقة مع الجانب المراقبة تواجه حتى على قطرة القاعدية العازلة (الشكل 1، الخطوة 1).
  3. ضع 30 ميكرولتر من العازلة القاعدية في وسط غطاء زجاجي (الحجم: 18 × 18 مم، سماكة: 0،12-0،17 مم) (الشكل 1 الخطوة 2). تحويل الزجاج غطاء رأسا على عقب بلطف. والتوتر السطحي منع انخفاض عازلة من السقوط. عقد غطاء زجاجي مع ملاقط على حافة واحدة. ضع حافة المعاكس على شريحة زجاجية بحيث انخفاض عازلة تقريبا فوق فلقة.
  4. مع حافة غطاء زجاجي لا يزال على الشريحة، والاستمرار في الضغط على الحافة المقابلة مع ملاقط، وضبط الموقف من الانخفاض عازلة تحت غطاء زجاجي بحيث تكون مباشرة فوق العينة فلقة (الشكل 1، الخطوة 3). ترك من الزجاج غطاء. جبل انخفاض على عينة مما أدى إلى إعداد دون فقاعات الهواء.
  5. تمحو عازلة الزائد باستخدام أنسجة خالية من الوبر. مراقبة إعداد فورا (راجع الخطوة 3).
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لختم العينات.

3. VAEM مراقبة واكتساب السينما

ملاحظة: نظام المجهر TIRF 9 المستخدمة في هذه الدراسة يوصف على النحو التالي: تم تجهيز مجهر مقلوب مع وحدة TIRF وعدسة موضوعية TIRF مع الفتحة العددية 1.49. من أجل السيطرة الآلية لزاوية دخول الليزر، يتم استخدام مربع عنصر التحكم. بروتين الفلورية الخضراء (GFP) هو متحمس مع 488 نانومتر ضخ بصريا ليزر أشباه الموصلات، وروقال انه تم الكشف عن مضان من خلال 510-550 نانومتر الفرقة تمرير فلتر لمنع تألق ذاتي من البلاستيدات الخضراء. القيمة القصوى المقاسة من انتاج الألياف السلطة هي 13،0-13،5 ميغاواط. للكشف، إلكترون تتضاعف الجهاز المسؤول عن جانب (EM-CCD) نظام الكاميرا رئيس وحدة تغير الكاميرا التكبير C-جبل تستخدم.

  1. معايرة معدات الاختبار والتركيز وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة لملاحظات VAEM دقيقة. فمن المستحسن أن فحوص دورية للإجراءات تعديل مسار الليزر، ومناسبة لالمجهر، يتم تنفيذها.
    1. تحديد الموقف المركزي مضيئة مع موضوعي مسار الضوء خالية من العدسة على سقف الغرفة المجهري. بمناسبة موقعا مركزيا، ووضع ختم دائرة الملونة على السقف (الشكل 2، الخطوة 1، 2).
    2. إلقاء الضوء على السقف مع العدسة الشيئية (الشكل 2 الخطوة 3، 4). نقل طlluminated المنطقة إلى موقف وسط (الشكل 2، الخطوة 5). تركيز الليزر (الشكل 2، الخطوة 6). صقل موقف ليزر مركز لمركز (الشكل 2، الخطوة 7).
  2. وضع العينة على مرحلة المجهر وتحديد خلايا للمراقبة باستخدام إضاءة حقل مشرق.
  3. تأكد من أن بروتين فلوري يمكن ملاحظة في الخلايا، وتحديد موقف ض -axis على سطح الخلية باستخدام epifluorescence إضاءة (الشكل 3A).
  4. أداء الملاحظات VAEM.
    1. تركنوا زاوية دخول شعاع الليزر تدريجيا مع مربع وحدة تحكم. وفي الوقت نفسه، رصد صورة حية بعناية. في البداية، سوف يكون واضحا للصورة (الشكل 3B).
    2. كما يزيد زاوية الليزر، فإن الصورة VAEM تصبح أقل واضح، في نهاية المطاف إنتاج صورة واضحة (الشكل 3C وD). في هذه المرحلة، ووقف increaالغناء زاوية الليزر. في حالة فقدان إشارة مضان، تنخفض إلى زاوية الضحلة.
    3. صقل زاوية دخول ليزر للحصول على أفضل صورة. صقل موقف ض -axis يمكن أيضا تحسين الصورة. إذا لزم الأمر، وضبط المعلمات البصرية (قوة الليزر، والطول الموجي ومجموعة فلتر) والمعلمات صورة الاستشعار [حجم الصورة، وقت التعرض، كسب، التحويل الرقمي وبضرب الإلكترون (EM) أرباح].
      ملاحظة: في حالة المعدات المجهر TIRF المذكورة أعلاه، المعلمات التمثيلية هي على النحو التالي. التكبير من عدسة عادل امام الكاميرا: 2X. انتاج الليزر: 1،0 ميغاواط. حجم الصورة: 512 × 512 بكسل. وقت التعرض: 100 مللي ثانية. كسب: 5 ×؛ التحويل الرقمي: 11 ميغاهرتز؛ وEM مكاسب: 100.
  5. الحصول على الفيلم باعتباره TIFF ملف صورة متعددة الصفحات باستخدام برنامج المجهر التجاري. هنا، والفيلم هو من النقاط المسمى GFP امض على سطح خلايا الثغور.
    ملاحظة: التمثيلية شروط الحصول على الصور هي كما فلأدنى مستوياته. الوضع الاستحواذ: تيار لذاكرة الوصول العشوائي؛ عدد الإطارات: 600؛ وحجم متعدد الصفحات ملف TIFF: ~ 302 MB.

4. تحليل مخطاط التموج لالكمي لالمسمى GFP دوت الإقامة الوقت عن طريق فيجي البرمجيات

  1. تثبيت فيجي ('فيجي هو فقط يماغيج') برنامج 10 باستخدام إرشادات المؤلفين (http://fiji.sc/Fiji).
  2. تشغيل فيجي وفتح ملف TIFF متعددة الصفحات المكتسبة باستخدام القائمة فيجي "ملف المفتوحة".
  3. وضع خط على موقع مصلحة، وذلك باستخدام أداة فيجي شريط القوائم "خط مستقيم أداة التحديد". اختياريا، واستخدام "مقطع الخط أداة التحديد" أو "حر الخط أداة التحديد". في النتائج المعروضة هنا، وضعت خط مستقيم من 100 بكسل (الموافق 8،0 ميكرون) على خلية تابعة الشكل (4A).
  4. تقديم صورة مخطاط التموج باستخدام القائمة فيجي "صورة-الأكوام-الديناميكي Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (الشكل 4B). اختياريا، "الوجه عموديا" و "استدارة 90 درجة" في إطار خانة الاختيار متاحة (لا تستخدم في النتائج المقدمة هنا). وX- و y-axis في الصورة مخطاط التموج تشير إلى موقف خط (100 بكسل المقابلة لكما 8.0 ميكرون)، ووقت رصد (600 بكسل الموافق 60 ثانية)، على التوالي. إذا كانت الصورة مخطاط التموج ليست مرضية، وموقف ونوع (على التوالي، مجزأة ومرفوعة) من خط على الصورة متعدد الصفحات قد تغيرت. كما التغييرات الخط، صورة مخطاط التموج يتغير بشكل حيوي. حفظ صورة مخطاط التموج كملف TIFF باستخدام القائمة فيجي "ملف-حفظ باسم-المشاجرة".
  5. قياس طول النقطة في اتجاه محور الزمن.
    1. لأداء الحد من الضوضاء، وتطبيق فلتر التمويه على الصور مخطاط التموج باستخدام القائمة فيجي "عملية-فلاتر التمويه الضبابي". و"سيغما (رادالناهية) "المعلمة غير الانضباطي (يستخدم 1 بكسل دائرة نصف قطرها عن النتائج المقدمة).
    2. الجزء المناطق إشارة من العتبة، وذلك باستخدام القائمة فيجي "صورة-ضبط-عتبة".
      ملاحظة: هناك العديد من الخوارزميات العتبة للاختيار من بينها. في النتائج المقدمة، تم اختيار خوارزمية "الين" (الشكل 4C).
    3. الاستعداد لقياس الوقت (ص) -axis طول النقطة باستخدام القائمة "القياسات تحليل-مجموعة". التحقق من "المستطيل إحاطة" في "مجموعة قياسات" النافذة. من الناحية المثالية ينبغي أن تكون مجموعة منطقة صغيرة قدر الإمكان، على أن تستبعد الضوضاء. هنا، تم تعيين الحد الأدنى من المنطقة في 50 بكسل. قياس الوقت (ص) -axis طول النقطة باستخدام القائمة "تحليل-تحليل الجزيئات". للحصول على القيم نتيجة وإثبات مصداقية المناطق القياس، والتحقق من "عرض النتائج" و "إضافة إلى مدير </ م> "صناديق.
    4. القيم في العمود "الطول" هي الوقت (ص) -axis أطوال لسائل قياس (الشكل 4D). حفظ القيم باستخدام القائمة جدول نتائج "ملف-حفظ باسم" وحساب ومعالجة بيانات من فترات صورة النقطة باستخدام الحزمة الإحصائية و / أو برنامج جداول البيانات (الشكل 4E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة الفيديو، وبروتوكولات لمراقبة VAEM من GFP-PATROL1 في A. وتقدم خلايا معقدة thaliana فلقة الثغور. انخفاض السماء تصاعد هي طريقة إعداد بسيط قد يساعد على التقليل من حدوث فقاعات الهواء في الأعمال التحضيرية VAEM من A. النبتات thaliana (الشكل 1). سوف Overtilting ليزر الدخول و / أو ض المواقع من العينات للVAEM تقديم صورة واضحة. وإذا حدث ذلك، فمن المستحسن أن تبدأ من جديد من موقع مباشرة فوق العينة، كما تقرره epifluorescence ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة الفيديو، الذي يتم إعطاء بروتوكولات لرصد وقياس السلوك الديناميكي من النقاط GFP-PATROL1 على مجمع الثغور من نبات الأرابيدوبسيس thaliana. كما هو موضح هنا، والمراقبة VAEM هو أداة قوية لتصوير حي لأسطح الخلايا النباتية. تحت ظروف تجريبية تستخدم هنا لرصد GFP-PATROL1، كان هناك القليل جدا photobleaching من مضان في العينة المستخدمة لمدة 1 دقيقة من تسجيل الفيديو، لأن حساسة للغاية EM-CCD يسمح استخدام ضعيفة نسبيا ليزر الإثارة في البصريات VAEM. معدات الاختبار والتركيز، وذل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف ليس لديه ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنا ممتن للدكتور ماسارو فوجيموتو على اقتراحاته الفنية ل VAEM. كما أنني ممتن للبروفيسور كوه إيبا والدكتورة ميمي هاشيموتو سوجيموتو لتوفير النباتات المعدلة وراثيا PATROL1 GFP ، والمناقشات حول PATROL1. أشكر البروفيسور سيشيرو هازيزاوا على دعمه المستمر لعملي. تم دعم هذا العمل من قبل منحة KAKENHI رقم 25711017 من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
المجهر المقلوبأوليمبوسIX-73
وحدة TIRFأوليمبوسIX3-RFAEVAW
TIRF عدسة موضوعية  أوليمبوسUAPON 100 & مرات ؛ OTIRF NA = 1.49
صندوق التحكم في زاوية الليزرChuo SeikiQT-AK
ضخ بصري ليزر أشباه الموصلاتمتماسكالياقوت < سوب > TM < / sup> LP USB 488-20 CDRH Laser
510 & ndash ؛ 550 نانومتر مرشح تمرير النطاقOlympusU-FBNA
EM CCD كاميراHamamatsu PhotonicsImagEM C9100-13
C-mount وحدة تغيير تكبير الكاميرا  أوليمبوسU-TVCAC
MetaMorph البرمجياتالأجهزة الجزيئيةMetaMorph الإصدار 7.7.11.0
دليل الفحص المجهري TIRFأوليمبوسAX7385التعليمات: إجمالي نظام إضاءة الانعكاس الداخلي (طبع في اليابان في 24 أغسطس 2012)
زيت الغمرأوليمبوسالغمر Typr-Fne = 1.518 (23 درجة)
زيت

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
  2. Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
  3. Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
  4. Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
  5. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
  6. Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
  7. Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
  8. Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215(2013).
  9. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
  10. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
  12. Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
  13. Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
  14. Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
  15. Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
  16. Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Variable Angle Epifluorescence MicroscopyPlant Cell Surface DynamicsFluorescent Protein TrackingReal time ImagingKymograph AnalysisResidence Time MeasurementGuard Cell ObservationSubsidiary Cell AnalysisPATROL1 Protein DynamicsArabidopsis thaliana

Related Articles