مقالة منهجية

طريقة بسيطة لالآلي المرحلة الصلبة استخراج عينات المياه للتحليل المناعية من الملوثات الصغيرة

12.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53438

⸱

يناير 1, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre Suisse d'Electronique et de Microtechnique, 2Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, 3Department of Information Technology and Electrical Engineering, ETH Zurich

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول لاستخراج الاستراديول وتركيزه المسبق من عينات المياه باستخدام نظام آلي ومصغر.

الملخص

ويقترح طريقة جديدة لاستخراج المرحلة الصلبة (SPE) من العينات البيئية للمياه. النموذج المتقدمة ودية فعالة من حيث التكلفة وسهلة، ويمكن أن تؤدي SPE السريع، والآلي وبسيط. الحل قبل المركز متوافق مع تحليلها من قبل المناعية، مع نسبة منخفضة من المذيبات العضوية. وصفت طريقة لاستخراج وقبل تركيز الهرمون الطبيعي 17β استراديول في 100 مل عينات المياه. يتم تنفيذ المرحلة العكسية SPE مع octadecyl السيليكا المواد الماصة ويتم شطف مع 200 ميكرولتر من الميثانول 50٪ ت / ت. غير المخفف شاطف بإضافة مياه دي لخفض كمية من الميثانول. بعد إعداد يدويا العمود SPE، يتم تنفيذ الإجراء الشامل تلقائيا في غضون 1 ساعة. في نهاية هذه العملية، يتم قياس تركيز الاستراديول باستخدام انزيم مرتبط التجاري المناعية بالأنزيم (ELISA). ويتحقق 100 أضعاف ما قبل التركيز ومحتوى الميثانول في 10٪ فقط ت / ت. المبالغ المستردة كامل للجزيءتتحقق مع 1 نانوغرام / L ارتفعت عينات مياه البحر غير المتأينة والاصطناعية.

المقدمة

إعداد نموذج يمثل خطوة مهمة في أي عملية التحليل. على وجه الخصوص، وإزالة آثار مصفوفة، انتقاص من تدخلات، وإثراء الحليلة ضرورية للحصول على نتائج دقيقة وتصل إلى حدود منخفضة من الكشف. الغدد الصماء المركبات (EDCs) تثير القلق بشكل خاص نظرا لعملها على الكائنات الحية حتى عندما الحالية في مستويات منخفضة جدا في البيئة. هرمون الطبيعي 17β استراديول موجود على تلوث المياه الاتحاد الأوروبي قائمة المراقبة وعرضة لتضاف إلى قائمة المواد ذات الأولوية تنظيمها بموجب الإطار التوجيهي للمياه الأوروبي. يتم تطبيق المرحلة الصلبة استخراج (SPE) عادة لتحليل الملوثات الصغيرة في الماء، مع كل الكيميائي 1-5 (اللوني، مطياف الكتلة) والمناعية 6-9 طرق الكشف. اكتسب هذا الأخير مصلحة في مجال الرصد البيئي، كما هي المناعية المتاحة في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأشكال، هي محددة لتاالحليلة r يمكنك الحصول، والوصول إلى حدود منخفضة من الكشف. 6، هي 7 و 10 و 11 مختلفة انزيم مرتبط المقايسات المناعي (ELISA) المتاحة تجاريا وتمكن لتحليل عينات متعددة في وقت واحد على لوحة متعددة أيضا. يتكون الإجراء في خطوات التفاعل المتعاقبة التي يمكن أن يستغرق بضع ساعات. ويمكن الكشف عن المنتج النهائي من ردود الفعل البصري لتحديد تركيز جزيء الهدف على أساس منحنى المعايرة.

وتشمل الإجراءات SPE الكلاسيكية الماصة قبل تكييف، واستخراج عينة والغسيل والشطف، والتركيز عن طريق التبخر من شاطف. المذيبات المستخدمة للتخفيف من هذا المستخلص يتم اختياره تبعا لطريقة الكشف. للحصول على طرق المناعية، وكمية من المذيبات العضوية التأثيرات بشدة حساسية هذه الطريقة. 12

بالإضافة إلى الانتعاش والأداء ما قبل الاعتقال، يحتاج الأسلوب أيضا أن تكون بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. أتمتة الاجراءه يساعد على الحد من الأخطاء المتعلقة البشرية. في عملنا السابق 13 قدمنا ​​النموذج من أجل SPE الآلي، وتطبيق أسلوبنا في تحليل الهرمون الطبيعي 17β استراديول في عينات مياه البحر. مع الفيديو الحالي نود تسليط الضوء على المزايا التقنية من أسلوبنا مقارنة مع التقليدية خارج الخط وعلى الخط SPE، والتوافق خاص مع الكشف عن طريق تفاعلات المناعية. وصفنا بروتوكول تطبيقها على عينات المياه للكشف عن 17β استراديول. يتم تنفيذ SPE مع يتم تنفيذ octadecyl السيليكا (C18) المرحلة الماصة وشطف مع الميثانول المخفف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يصف بروتوكول التالية إجراء SPE على 100 عينة مل من الماء مع C18 الماصة وشطف مع 50٪ ت / ت الميثانول. يتم تخفيف العينة المخصب لتصل الى 10٪ ت / ت الميثانول قبل التحليل مع انزيم مرتبط المناعي مقايسة (ELISA) عدة.

1. إعداد الكواشف

  1. تحضير عينات المياه
    1. قبل أي خطوة أخرى، تصفية كل عينة 100 مل من الماء مع مرشحات حجم 0.2 ميكرون المسام.
    2. ارتفاع العينة مع التركيز المطلوب عن طريق تمييع حجم مناسب من حل إشارة إلى حجم المياه. على سبيل المثال، وإعداد 100 مل من عينة المياه مع 100 نانوغرام / L من E2 عن طريق تمييع 3.3 ميكرولتر من محلول إشارة E2 بتركيز 300 ميكروغرام / لتر. تمييع هذا الحل عشر مرات للحصول ارتفعت عينة مع 10 نانوغرام / L E2. تمييع هذا الأخير مرة أخرى العشر للحصول على عينة من 100 مل مع 1 نانوغرام / L E2.
    3. ضع العينة التي تمت تصفيتها (معدلة أو ارتفعت) في زجاجة مع GL45 الموضوع. استخدام عينة في نفس اليوم. أخذ جزء صغير ليتم تحليلها مع ELISA لتقدير تركيز الأولي.
  2. إعداد 300 ميكرولتر من شاطف عن طريق تمييع الميثانول في دي المتأينة (DI-) المياه إلى 50٪ ت / ت في أنبوب ضيق.

2. إعداد العمود SPE

  1. إعداد 20 ملغ / مل تعليق من الجسيمات octadecyl السيليكا المواد الماصة عن طريق إضافة ميكرولتر 1600 الأولى من الميثانول ثم 400 ميكرولتر من مياه دي إلى 40 ملغ من العكسي المرحلة الماصة. بإحكام إغلاق الغطاء وتستنهض الهمم مع دوامة.
  2. تركيب غشاء أسفل في العمود
    1. اختر واحدا غشاء نايلون مع حجم المسام 11 ميكرون ووضعه على طبقة مزدوجة من النسيج مكافحة الغبار. مع 3 مم لكمة، وقطع اثنين من أجزاء صغيرة في الغشاء.
    2. انتزاع واحدة من الأغشية صغيرة مع نهاية مسطحة ملقط مرشح ووضعه على جانب واحد من العمود.
    3. المسمار الموصل مسطحة القاع مع أنبوب وتشديد. الغشاء هو نآه في المكان والمواد الماصة ويمكن أن يضاف بشكل آمن. رسم السهم على جثة لافتا عمود في نهاية حيث وضعت الغشاء.
  3. إعداد العمود الماصة معبأة
    1. تأمين العمود على حامل مع سهم يشير نحو القاع. يجب تعيين العمود رأسيا وقت ممكن.
    2. إرفاق فارغة 10 مل حقنة القابل للتصرف في نهاية الأنبوب العمود، باستخدام موصلات لور للقفل.
    3. إعداد ماصة صغيرة مع طرف 20-200 ميكرولتر، ضبط مستوى الصوت إلى 100 ميكرولتر. ويتم تكييف هذا الشكل طرف ماصة لحجم العمود الماصة لتكون مستعدة. فإن الإجراء سيكون أكثر صعوبة مع نصائح ماصة أكبر مثل تلك التي استخدمت مع 1 مل الماصات.
    4. تستنهض الهمم تعليق الماصة مع دوامة، والماصة بسرعة 100 ميكرولتر في المركز على العمود. في حين حقن، نضح بلطف عن الحل pipetted الحوض الصغير الغشاء باستخدام الحقنة باليد الأخرى. في هذه الحاديالعمر، ويجب أن يكون الحل ملء الحقنة واضح من الجسيمات، ويمكن في نهاية المطاف أن تراعى سرير الجسيمات في العمود.
    5. كرر هذه العملية 2 مرات أكثر من تهييج تعليق الأسهم بين جميع الخطوات pipetting للضمان وقف متجانس من الجزيئات في الحل. العمود الناتج يحتوي على 6 ملغ من المواد الماصة.
    6. عندما تم تحميل 300 ميكرولتر من تعليق وتجفيفها بواسطة الشفط مع حقنة، والحفاظ على حقنة في موقف ووضع غشاء نايلون الثاني على رأس باستخدام ملقط مع جهة أخرى.
    7. برغي أسفل موصل الثاني مع أنبوب والتخلص الحقنة. العمود SPE جاهزا للاستخدام.

3. إعداد النظام

  1. تشديد العمود SPE على الجهاز باستخدام موصلات لور للقفل. يجب أن يكون السهم الذي يشير إلى نفس اتجاه واحد هو مبين على الجهاز.
  2. ربط زجاجة تحتوي العينة إلى الجهاز عن طريق الشدقدمت GL45 سلامة غطاء على ذلك.
  3. تحميل 200 ميكرولتر من شاطف في الخزان "شاطف".
  4. تحميل 800 ميكرولتر من مياه دي في الخزان "التخفيف".
  5. ضع زجاجة عند مخرج النفايات لجمع المياه المعالجة خلال خطوة الاستخراج. الشكل ليس مهما ولكن يحتاج إلى أن تكون كبيرة الحجم بما فيه الكفاية فيما يتعلق حجم العينة.
  6. ضع قارورة صغيرة عند مخرج الاستشعار لديها القدرة حجم الحد الأدنى من 1.5 مل. وهناك أقصى حجم 1 مل تكون صغيرة جدا كما فقاعات ستشكل في هذا المنفذ عند جمع شاطف المخصب وعازلة التخفيف.
  7. تحقق من منظم الضغط هو في موقف مغلقة بتحويلها يدويا، عكس اتجاه عقارب الساعة حتى مزيد من الحركة ليست ممكنة.

4. SPE مع النموذج

  1. تشغيل النموذج عن طريق الضغط على زر على ظهره.
  2. إعداد واجهة المستخدم واختيار البرنامج
    1. فتح واجهة المستخدم. اختارمنفذ الاتصال من الكمبيوتر الذي يتم توصيل الجهاز من القائمة، ثم انقر على زر "التالي".
    2. أدخل القيم 580 PSET و 30 لdpset. والمضخة ضبط للحفاظ على الضغط في نظام الضغط والخزانات في 580 ± 30 مليبار عند تشغيل.
    3. تحديد وضع الآلية.
    4. في الزاوية وضع الآلي، تحميل ملف البرنامج في "مسار ملف التكوين" مربع.
  3. ضبط منظم ضغط
    1. بدء تشغيل المضخة.
    2. تحويل يدويا منظم الضغط حتى قيمة القراءة لPREG هو أدنى ولكن قريبة من 320 مليبار.
    3. إيقاف المضخة.
  4. البدء في إجراء SPE
    1. اضغط على "بدء" في وضع زاوية الآلي. ومضخة التبديل على وسوف الاستخراج، وشطف وتخفيف الخطوات تتبع تلقائيا بعضها البعض. يتم تنفيذ الإجراء بأكمله لعينة 100 مل في 50 دقيقة.
    2. تحقق من قيمة PREG. يجب أن تكون في حدود 320-350 مليبار خلال خطوة الاستخراج لضمان معدل التدفق الأمثل.
    3. إغلاق قارورة صغيرة وتخزينها في 4-5 درجة مئوية في الظلام حتى تحليل. تحليل أداء في 30 ساعة التالية لمنع تدهور الحليلة.
    4. التخلص من المياه المعالجة.
  5. تنظيف النظام
    ملاحظة: بعد كل إجراء استخراج النظام يحتاج إلى تنظيفها لمنع انتقال التلوث.
    1. إعداد 10 مل من محلول الميثانول 70٪ ت / ت في زجاجة GL 45.
    2. افصل العمود SPE وتوصيل الأنابيب مع الموصلات.
    3. في وضع الآلي، حدد "تنظيف" الملف وتشغيله مع ضبط ضغط نفسها.

5. الكشف عن استراديول تركيز مع ELISA

  1. إعداد العينات المعايرة مع تركيز على النحو المبين في بروتوكول المتوفرة مع عدة ELISA الذي يتم استخدامه. إعداد calibra واحدنشوئها مع مجموعة نفس المصفوفة كما العينة، ومعايرة مجموعة واحدة مع الميثانول 10٪ ت / ت.
  2. الاستغناء عن المبلغ اللازم للعينة في الآبار على لوحة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام عينات المعايرة، وعينات المياه غير المعدلة وارتفعت التي تم تصفيتها لكن لم تتم معالجتها مع SPE، وإثراء العينات في الميثانول 10٪ ت / ت. استخدام 3 آبار في عينة للحد من الخطأ المرتبط الفحص.
  3. اتبع مؤشرات على البروتوكول الذي يتم توفيرها مع عدة لإضافة المواد المتفاعلة، فترة حضانة والغسيل ومزيد من التفاعل مع الإنزيم.
  4. قراءة إشارة ضوئية في كل بئر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة عدة مع أداة قارئ لوحة وجمع البيانات.
  5. استخدام البرنامج للصك قارئ لوحة لتناسب منحنيات المعايرة وتحديد تركيز E2 في العينة الأولية مع نفس المصفوفة، والعينات المخصب مع الميثانول 10٪ ت / ت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تقييم استنساخ المواد الماصة التعبئة من قبل التجفيف والترجيح والمواد الماصة pipetted في قوارير زجاجية ويتم إظهار النتيجة في الشكل 1. استنساخ وقت الحقن تم اختباره لمدة 100 مل العينات، كما هو مبين في الشكل 2. التركيز في البداية ومرحلة ما قبل ارتفعت المركزة تم تحديد العينات باستخدام مجموعة ELISA التجارية ل17β استراديول وتظهر في الشكل 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

واقترح طريقة جديدة لإعداد عينات من المياه تليها التحليل باستخدام المناعية. تمكن أداة لتنفيذ استخراج المرحلة الصلبة بطريقة مؤتمتة وسهلة الاستعمال.

الترشيح من عينة المياه قبل الحقن لها في النظام أمر بالغ الأهمية. فإن أي الجسيمات التي لا تزال موجودة في الحل أن يسبب انسداد في الشبكة الموائعية وعرقلة العمود SPE. خطوة هامة أخرى هي إعداد العمود SPE. كمية من الجسيمات في العمود أمر بالغ الأهمية لتحقيق أفضل أداء ممكن. يجب ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج الإطار السابع للاتحاد الأوروبي FP7 / 2007-2013 بموجب اتفاقية المنحة رقم 265721. يشكر المؤلفون معهد RIKILT لسلامة الأغذية (NL) على دعمهم في هذا المشروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غشاء المرشح 0.2 & مو ؛ م حجم المسامMerck MilliporeGNWP04700لترشيح عينة
غشاء النايلون 11 & م حجم المسامMerck MilliporeNY1104700لعمود SPE
لكمة خزعة يمكن التخلص منها 5 ممالميزانية الطبية39302439
Nucleodur C18 ec & nbsp ؛Macherey Nagel713550.0150 & mu; قطر الجسيمات م
مياه البحر الاصطناعيةسيجما ألدريتشSSWS500-500 مل
ميثانولVWR
17 بيتا استراديول قياسيإنزو لايف ساينس300 نانوغرام / مل
17 بيتا استراديول طقم ELISAإنزو لايف ساينسADI-900-00896 بئر ، النطاق 30 - 3,000 نانوغرام / لتر

المراجع

  1. Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
  2. Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
  3. Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
  4. Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
  5. Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
  6. Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
  7. Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
  8. Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
  9. Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
  10. Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
  11. Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
  12. Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
  13. Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
  14. Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
  15. Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ELISA

مقالات ذات صلة