مقالة منهجية

تحليل تصفية عينات الهواء لالسموم الداخلية والمحتوى الحمض النووي

9.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53444

⸱

مارس 7, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

في هذه المقالة

ملخص

يتم وصف تحليلين تكميليين للجزيئات البيولوجية في الغلاف الجوي من مرشحات الهواء المأخوذة من العينات: استخراج واكتشاف السموم الداخلية والحمض النووي.

الملخص

يستخدم البحوث الهباء في الهواء الطلق عادة المادة الجزيئية عينات على مرشحات. يتيح هذا الإجراء الأوصاف مختلفة من الجزيئات التي تم جمعها لإجراء بالتوازي. والغرض من هذه الطريقة المعروضة هنا هو الحصول على تحليل درجة عالية من الدقة وموثوق بها من الذيفان الداخلي والحمض النووي محتوى-الهباء الجوي الحيوي المستخرج من المرشحات. استخراج جزيئات عالية الوزن الجزيئي العضوية، مثل عديدات سكر شحمية، من المرشحات عينات ينطوي تهز عينة في وسط المياه القائمة خالية من مولد الحمى. ويستند التحليل اللاحق على رد فعل الأنزيمية التي يمكن الكشف عنها باستخدام قياس قياس العكارة. ونتيجة لالمحتوى العضوي عالية على المرشحات عينات، يتم إجراء استخراج الحمض النووي من العينات باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية التي تم تصميمها في الأصل للتربة وتعديلها لتحسين العائد الحمض النووي. كشف وتقدير من الأنواع الميكروبية محددة باستخدام reacti البلمرة المتسلسل الكميفي التحليل (ف-PCR) موصوفة وبالمقارنة مع الطرق الأخرى المتاحة.

المقدمة

أخذ عينات من الهواء على مرشحات هي أداة أساسية في البحث الهباء الجوي. 1 المرشحات عينات هي نقطة انطلاق لتحديد خصائص البيولوجية للجسيمات المحيطة جمعت الكيميائية المختلفة، والمادية، و2-11 وميزة هذا النهج هو أن التحليلات المختلفة يمكن أن يكون أجريت خارج الخط على نفس العينة. تجميع البيانات من جميع التحاليل المختلفة تمكن الباحث من الحصول على فهم جيد للخصائص الجسيمات والمساعدات التي تم جمعها في حل المسائل المعقدة في علوم الغلاف الجوي. 12،13 على سبيل المثال،-عينات من الهواء البحرية والداخلية اتخذت خلال نفس فترة يمكن مقارنتها فيما يتعلق سمية الجسيمات عينات وتكوينها البيولوجي. 14 لهذه الدراسة، عديدات سكر شحمية (LPS)، والمكونات على بكتيريا خلية الجدران سلبية الغرام، المعروف أيضا باسم السموم الداخلية، انتزعت من المرشحات عينات على الشاطئ وفي وجرى تقييم موقع الداخلية باستخدامالليمول خلية أميبية الشكل المحللة (LAL) الاختبار. في موازاة ذلك، تقييم الجيني للمحتوى البكتيري (مجموع البكتيريا، سلبية الغرام، والبكتيريا الزرقاء) أجري على نفس العينة باستخدام الكمي تفاعل البلمرة المتسلسل (ف-PCR). ويستند اختبار LAL على قياسات التعكر شكلت بعد إضافة المستخلص المائي من amebocytes من سرطان حدوة الحصان، الليمول بوليفيموس، لمحلول مائي يحتوي على السموم الداخلية. وارتفاع تركيز الذيفان الداخلي في العينة، تطور تعكر أسرع. 15 ويستند التحليل ف-PCR على إشارة مضان المنبعثة كما يتم تضخيمه جزء DNA محددة. 16 من خلال رصد الوقت الحقيقي للإشارة خلال المرحلة الأسية من PCR رد فعل ومعايرة مع منحنى القياسية، وكمية الحمض النووي الأولي يمكن أن يكون كميا. الجمع بين هذين يحلل جنبا إلى جنب مع الآخرين، كما هو مفصل في أي مكان آخر، يمكن أن توفر 14 تقدير جيد من مستويات الذيفان الداخلي وكمية من البكتيريا مصدر في العينات.

والغرض من هذه الطريقة المعروضة هنا هو الحصول على تحليل درجة عالية من الدقة وموثوق بها من الذيفان الداخلي والحمض النووي محتوى-الهباء الجوي الحيوي المستخرج من المرشحات. بينما الأساليب لأخذ عينات من الخصائص الفيزيائية والكيميائية وغير العضوية من الهباء الجوي معروفة جيدا، وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير أساليب التحقيق المكون من المواد العضوية فيها (17) لم يكن هناك بحوث ضئيل على العنصر البيولوجي هباء 18 الأساس المنطقي للتيار طريقة لمعالجة هذه الفجوة من خلال تقديم بالتفصيل وسيلة قوية لاستخراج وتحليل، وتحديد جزء البيولوجي هباء المحمولة جوا (14).

ومن المتوقع أن يجد استخدام واسع النطاق في مشاريع داخلية وخارجية البيولوجية الهباء الجوي البحوث التي تنطوي على تحليل مرشح طريقة تفصيله هنا. 20-24

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تظهر قائمة مفصلة بجميع المواد والأجهزة المستخدمة في هذا البروتوكول في قسم المواد.

1. أخذ عينات الهواء على المرشحات

  1. تحضير المرشحات
    1. لأخذ عينات ذات حجم كبير، استخدم مرشحات بمساحة 20.3 x 25.4 cm2. اختر النوع المحدد من المرشح الذي يناسب احتياجات البحث، بالإضافة إلى حجم قطع المرشح (filter cut-off size)، إذا كان ذلك متاحاً.1 في هذه التجربة، استخدم مرشحات ميكروفيبر الكوارتز.
    2. قم بالخبز المسبق للمرشحات المخصصة لأخذ عينات المركبات العضوية والبيولوجية لتدمير الرواسب العضوية. وللقيام بذلك، غلف المرشحات بشكل فردي بورق الألومنيوم، ثم اخبزها في فرن مختبري عند 450 °C لمدة 5 hr على الأقل.
    3. احفظ المرشحات المخبوزة عند -20 °C حتى موعد أخذ العينات.
  2. التعامل مع الجهاز وأخذ عينات الهواء
    1. نظف الغبار المتبقي من رأس جهاز أخذ العينات عالي الحجم. امسح القطع بمناديل ورقية نظيفة واتركها تجف في الهواء قبل إعادة توصيلها بالجهاز.
    2. قم بتطهير كاسيت المرشح باستخدام الإيثانول، واعمل بارتداء القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات.
    3. ضع مرشحاً مخبوزاً مسبقاً داخل كاسيت المرشح النظيف، وتابع الخطوات وفقاً لدليل استخدام جهاز أخذ العينات عالي الحجم.
    4. دون التاريخ وأي ظروف جوية غير عادية، إن وجدت (مثل المطر أو العواصف الغبارية) على غلاف الألومنيوم، واحفظه في مكان نظيف حتى اكتمال عملية أخذ العينات.
    5. اجمع المرشح الذي تم أخذ العينة به واطوه إلى نصفين، بحيث يكون الجانب الذي جمع العينة موجهاً للداخل.
    6. غلف المرشح بورق الألومنيوم الأصلي واحفظه عند -20 °C حتى إجراء التحليل.
      ملاحظة: إذا كانت الفترة الزمنية بين أخذ العينات والتحليل تزيد عن شهرين، فاحفظ العينة عند -80 °C لتجنب تحلل المواد العضوية والبيولوجية.

2. تحليل السموم الداخلية

ملاحظة: قم بتطهير سطح العمل باستخدام إيثانول بتركيز 70%، واعمل فقط باستخدام أنابيب ورؤوس ماصات وكواشف خالية من المواد المحدثة للحمى. في حال استخدام الأدوات الزجاجية، يجب تسخينها مسبقاً عند 250 °C لمدة 30 min، أو عند 200 °C لمدة 60 min.25 قم بتحضير جميع الكواشف داخل كبينة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية، والتزم بارتداء القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات.

  1. تحضير الكواشف
    1. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة LAL لإعادة ترطيب المستخلص قبل الاستخدام بفترة وجيزة.26 انقرر بلطف على القارورة لإزالة ما تبقى من LAL على جدرانها. ارفع السدادة برفق لكسر الفراغ. باستخدام حقنة بإبرة، أضف 5 ml من الماء الخالي من البيروجينات (PFW) إلى القارورة لإعادة ترطيب كامل محتوى المستخلص، وامزجه بلطف لتجنب تكون الرغوة.
    2. أغلق القارورة بفيلم البارافين البلاستيكي عند عدم الاستخدام وخزنها في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى يومين. خزن أي مستخلص متبقٍ في درجة حرارة -20 °C لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
      ملاحظة: يمكن تجميد هذا الكاشف مرة واحدة فقط.
    3. أعد ترطيب المعيار الضابط للإندوتوكسين (CSE)، الذي يحتوي على 0.5 µg من E. coli، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.27 حدد الكمية المحددة من الماء التي يجب إضافتها إلى قارورة CSE من الموقع الإلكتروني للشركة المصنعة28 عن طريق إدخال رقم التشغيلة الخاص بالمجموعة حيثما هو محدد في الموقع. يتم قياس التركيز النهائي لـ E. coli في القارورة بوحدات الإندوتوكسين (EU؛ حيث 10 EU = 1 ng). ضع ملصق Ed0 على هذه القارورة.
    4. أغلق قارورة CSE بفيلم البارافين البلاستيكي عند عدم الاستخدام وخزنها في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  2. تحضير منحنى القياس والمرشحات المطعمة
    1. داخل كابينة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية، جهز 22 أنبوب طرد مركزي سعة 2 ml خالية من البيروجينات تحتوي على كميات متناقصة من CSE (الأنابيب Ed1-Ed11) أو بدون CSE (أنبوب الفراغ الذي يحتوي على PFW فقط) لإنتاج سلسلة تخفيف مكررة من الإندوتوكسين، كما هو موضح في الجدول 1.
    2. داخل كابينة بيولوجية ذات تدفق دائري، قص 22 قطعة دائرية من مرشح نظيف ومخبوز مسبقًا باستخدام ثاقبة فلين معقمة بقطر 1.12 cm.
    3. ضع أزواج المرشحات في أطباق بتري معقمة.
    4. طعم 50 µl من كل عضو في سلسلة تخفيف الإندوتوكسين Ed2-Ed11 ومن أنبوب الفراغ على زوج المرشحات المقابل.
    5. اترك أطباق بتري التي تحتوي على المرشحات المطعمة مفتوحة تحت غطاء الكابينة لتجف لمدة 30 min.
    6. ضع كل قطعة مرشح في أنبوب سعة 2 ml خالٍ من البيروجينات.
الأنبوبالتركيز النهائي للاندوتوكسين (EU ml-1)حجم الاندوتوكسين القياسي (ml)حجم الماء الخالي من المحدثات الحمومية (ml)الحجم الإجمالي (ml)
Ed02,500المحلول المخزني*5
Ed11,00080 (من Ed0)120200
Ed210020 (من Ed1)180200
Ed35010 (من Ed1)190200
Ed4255 (من Ed1)195200
Ed512.52.5 (من Ed1)197.5200
Ed66.251.25 (من Ed1)198.75200
Ed73.1256.25 (من Ed2)193.75200
Ed81.5636.25 (من Ed3)193.75200
Ed90.7816.25 (من Ed4)193.75200
Ed100.3916.25 (من Ed5)193.75200
Ed110.1956.25 (من Ed6)193.75200
العينة الفارغة00200200
* قم بتحضير المحلول المخزني وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

الجدول 1: منحنى المعايرة القياسي للسموم الداخلية. يوضح هذا الجدول تركيز السموم الداخلية، وحجم السّم الداخلي القياسي وحجم الماء الخالي من المحدثات الحمية المراد إضافتهما، والحجم الكلي الناتج لكل أنبوب تخفيف في منحنى المعايرة.

  1. استخلاص السموم الداخلية من المرشحات التجريبية والمرشحات المطعمة
    1. داخل كابينة سلامة بيولوجية ذات تدفق دائري، تُقطع مرشحات العينات (من الخطوة 1.2) إلى قطع دائرية باستخدام ثاقب فلين معقم بقطر 1.12 سم، وتوضع هذه القطع، جنباً إلى جنب مع مرشحات المعايير المطعمة (من الخطوة 2.2)، في أنابيب سعة 2 مل خالية من المحدثات الحموية (أي، أنابيب العينات).
    2. أضف 1 مل من PFW إلى الأنابيب ورجّها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، باستخدام هزاز مختبري.
    3. تُطرد أنابيب العينات مركزياً في جهاز طرد مركزي دقيق (microcentrifuge) عند 375 x g لمدة 10 دقائق.29
    4. انقل السائل الطافي، الذي يحتوي على السموم الداخلية، إلى أنبوب جديد سعة 2 مل خالٍ من مسببات الحمى.
  2. اختبار ليمولوس أميبوسايت ليسات (LAL)
    1. حدد تركيز الذيفان الداخلي (endotoxin) في العينات عن طريق إجراء اختبار LAL في لوحة ميكروية ذات 96 بئراً خالية من المحدثات الحرارية، وتتميز بقاع مسطح وغطاء.
    2. خطط مصفوفة الأطباق مسبقاً، كما هو موضح في الشكل 1تضَمّن في كل لوحة اختبار منحنى قياسياً يتم تحضيره مباشرة من محاليل قياسية للسموم الداخلية (Ed2-Ed11)، وبذلك يغطي نطاق تركيز يتراوح بين 100 و0.195 وحدة سموم داخلية/مل (انظر القسم 2.2). يجب أن يشغل المنحنى القياسي الآبار من 1 إلى 10 في الصفين A وB من اللوحة. خَصِّص الآبار 11-12 في هذه الصفوف للعينات الفارغة (ليصبح المجموع أربع عينات فارغة).
    3. قم بتشغيل قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) وبرمجته لإجراء تفاعل حركي يتضمن تحضين الطبق الدقيق عند 37 °C والرج كل 5 دقائق، يلي ذلك قياسات الامتصاص عند 405 نانومتر. كرر العملية 18 مرة لمدة 1.5 ساعة.
    4. تحديد كفاءة استخلاص السموم الداخلية (endotoxins) من مرشحات العينات (أي أن، والعينات التي تم الحصول عليها من المرشحات القياسية المطعمة) عن طريق قسمة كمية الإندوتوكسين المحسوبة على الكمية الأصلية المطعمة.
    5. ابدأ المقايسة بوضع 50 µl من محاليل الإندوتوكسين القياسية (من الخطوة 2.4.2)، أو من مستخلص المرشح المضاف إليه الإندوتوكسين وعيناته الضابطة (من القسم 2.3)، أو من العينات التجريبية وعيناتها الضابطة (أيضاً من القسم 2.3)، وفقاً لمصفوفة الأطباق المخطط لها (الشكل 1) ثم أغلق الغطاء.
    6. أضف بسرعة إلى كل بئر 50 µl من محلول LAL، ورج اللوحة برفق أفقيًا أثناء وضعها على الطاولة قبل رفعها ووضعها في جهاز القراءة.
    7. ضع الطبق في قارئ الأطباق وابدأ التشغيل التجريبي.

مخطط تخطيط الصفيحة الدقيقة؛ منحنيات القياس، العينات المختبرة، والضوابط المضاف إليها مادة قياسية والضوابط الفارغة.
الشكل 1: صفيحة مصفوفة الداخلي سموم. مثال لمصفوفة تحليل الداخلي سموم في صفيحة دقيقة ذات 96 بئراً.

3. التحليل الجينومي

ملاحظة: لاستخلاص الـ DNA، قم بتطهير سطح العمل باستخدام ethanol بتركيز 70% واستخدم الأنابيب والرؤوس والكواشف المعقمة فقط. ولتحليل الـ DNA عن طريق q-PCR، قم بتطهير سطح العمل باستخدام مزيل تلوث الـ DNA المخصص للأسطح. قم بتحضير جميع الكواشف داخل كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية (class II biosafety cabinet) مع الالتزام بارتداء القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات.

  1. تحضير بادئات ومجاسات الـ DNA
    1. قبل استخلاص الـ DNA، يتم إما طلب مجموعة من البادئات ومجس متاح تجارياً (في حال تطبيق طريقة مجس التحلل المائي)، أو تصميم مجموعة جديدة من البادئات ومجس باستخدام أدوات حوسبة لتصميم البادئات.30
    2. أعد تمييه البادئات وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام إما 10 mM Tris-0.1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (محلول TE المنظم) أو ماء بدرجة نقاء PCR.
      ملاحظة: يوصى بإذابة المخزون الأولي لبادئات PCR في محلول TE المنظم بتركيز منخفض من EDTA (0.1%) لأن ذلك يمنع تحلل البادئات عند حفظها لفترات طويلة. استخدم ماء بدرجة نقاء PCR في التخفيفات اللاحقة لتقليل كميات EDTA التي قد تثبط تفاعلات PCR.
    3. قم بتحضير حصص مقدارها 50 µl أو 100 µl من البادئة والمجس في أنابيب معقمة سعة 0.5 ml واحفظها في درجة حرارة -20 °C حتى وقت التحليل.
  2. تقييم تركيز الخلايا القياسي قبل استخلاص الـ DNA
    1. في أنبوب طرد مركزي ذي حجم مناسب، قم بتحضير محلول خلايا قياسي للأنواع الميكروبية المستهدفة (الأنبوب Od0، الجدول 2A). اخلط معلق الخلايا عن طريق سحب السائل وإطلاقه للأعلى والأسفل في الأنبوب من 7-10 مرات باستخدام ماصة ذات فتحة صغيرة.
    2. إذا كانت الخلايا ملونة (مثلاً بعض الأبواغ الفطرية)، فلا تقم بإجراء عملية الصبغ. إذا كان صبغ الخلايا مطلوباً، قم بتخفيف معلق الخلايا في صبغة مناسبة للكشف المجهري عن الخلايا المستهدفة.31
    3. نظف غطاء الشريحة ومقياس كرات الدم (hemocytometer) باستخدام الإيثانول. بلل غطاء الشريحة وثبته على مقياس كرات الدم.
    4. ضع حوالي 8 µl من معلق الخلايا في كلتا حجرتي مقياس كرات الدم عن طريق لمس حافة غطاء الشريحة بعناية بطرف الماصة وملء الحجرة عن طريق الخاصية الشعرية. تجنب ملء الحجرة بشكل زائد أو ناقص.
    5. حدد عدد الخلايا من خلال فحصها تحت المجهر بتكبير 400X (40X في العدسة الشيئية و10X في العدسة العينية). يجب أن تظهر تسعة مربعات بمساحة 1 x 1 mm2 ومرتبة في شبكة 3 x 3. ركز المجهر على أحد المربعات الأربعة الموجودة في زوايا الشبكة (يمكن استخدام تكبير أعلى). يجب أن يحتوي المربع ذو مساحة 1 x 1 mm2 على 16 مربعاً أصغر.
    6. قم بعدّ جميع الخلايا في المربعات الأربعة الزاوية بمساحة 1 x 1 mm2، وكذلك في المربع الأوسط من شبكة 3 x 3. إذا كان عدد الخلايا كبيراً جداً أو قليلاً جداً بحيث يصعب عدها، كرر الإجراء، إما بتركيز أو تخفيف معلق الخلايا الأصلي حسبما يقتضي الأمر (يجب أن يغطي من 15-50 خلية منطقة واحدة بمساحة 1 mm2).
    7. احسب تركيز الخلايا (cells ml-1) في محلول الخلايا القياسي Od0 من عدد الخلايا المتوسط عبر المربعات الخمسة التي تم عدها كما يلي: عدد الخلايا ml-1 = متوسط عدد الخلايا square-1 × معامل التخفيف × 104.
  3. تقييم كفاءة استخلاص الـ DNA
    1. قم بتحضير تسعة أنابيب معقمة سعة 0.5 ml وفقاً لـ الجدول 2A.
    2. خفف محلول الخلايا القياسي (Od0) ليحتوي على حوالي 107 cells ml-1 في حجم إجمالي قدره 20 µl (Od1).
    3. أضف 18 µl من ماء PCR المعقم الخالي من النوكلياز (NFW) إلى الأنابيب من Od2 إلى Od8، و20 µl إلى أنبوب العينة الفارغة (blank tube)، Od9.
    4. انقل 2 µl من محلول الخلايا من Od1 إلى Od2. استخدم الماصة بلطف للمزج ثم انقل 2 µl من الأنبوب Od2 إلى Od3. استمر في تخفيف الخلايا بنفس الطريقة على طول الأنابيب وصولاً إلى الأنبوب Od8 بما في ذلك، للحصول على تخفيف تسلسلي من 107 إلى 100 cells ml-1.
    5. داخل كابينة سلامة بيولوجية ذات تدفق دائري، قص 18 قطعة دائرية من مرشح نظيف ومخبوز مسبقاً، باستخدام ثاقبة فلين معقمة قطرها 1.12 cm. ضع المرشحات في أزواج داخل أطباق بتري معقمة.
    6. أضف 10 µl من التخفيفات من Od1 إلى Od8 ومن أنبوب العينة الفارغة Od9 على كل زوج من المرشحات، بحيث يكون هناك زوج مرشحات واحد مقابل كل تركيز خلوي قياسي.
    7. اترك أطباق بتري مفتوحة تحت غطاء الكابينة واتركها تجف لمدة 30 دقيقة.
    8. ضع كل قطعة مرشح في أنبوب معقم سعة 2 ml ذو غطاء لولبي واستخلص الـ DNA وفقاً للإجراء المفصل في القسم 3.4.
  4. استخلاص الـ DNA من المرشحات التجريبية والمرشحات المضافة إليها الخلايا
    ملاحظة: لاستخلاص الـ DNA من المرشحات، استخدم الأطقم التجارية المصممة لاستخلاص الـ DNA من التربة وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة مع التعديلات التالية.
    1. لكل عينة مرشح (Od1-Od8)، قم بتحضير خليط من حبيبات زجاجية مغسولة بالحمض في أنبوب معقم سعة 0.5 ml. استخدم 0.1 g من الحبيبات بقطر 425-600 µm و0.3 g من الحبيبات بقطر ≤106 µm.
    2. داخل كابينة سلامة بيولوجية ذات تدفق دائري، قص ثلاث قطع دائرية من مواقع مختارة عشوائياً من كل عينة مرشح باستخدام ثاقبة فلين معقمة قطرها 1.12 cm، وضعها في أنابيب ذات غطاء لولبي سعة 2 ml.
    3. أضف خليط الحبيبات الزجاجية إلى الأنابيب.
    4. أضف محلول تحلل الخلايا (cell-lysis buffer) المرفق مع طقم الاستخلاص إلى كل أنبوب داخل الكابينة البيولوجية، بالكمية المحددة في بروتوكول الشركة المصنعة.
    5. جهز وعاءً من الثلج وقم بتكسير الخلايا ميكانيكياً باستخدام جهاز تكسير الحبيبات (bead beater).
    6. قم بتكسير الحبيبات لمدة 1 دقيقة ثم ضعها على الثلج لمدة 1 دقيقة. كرر العملية خمس مرات.
    7. تابع بروتوكول مورد الطقم بدءاً من خطوة ما بعد التحلل.
    8. بعد الاستخلاص باستخدام محلول الاستخلاص المرفق (يحتوي على 10 mM Tris buffer) أو NFW، قم بتحميل العينة المستخلصة عبر العمود مرة أخرى لتحسين إنتاجية الـ DNA.
      ملاحظة: في حال عدم تحليل العينات في نفس يوم استخلاص الـ DNA، يمكن تخزينها في درجة حرارة -20 °C حتى وقت التحليل.
أ- تحضير سلسلة تخفيفات خلوية قياسية
أنبوبالتركيز النهائي للخلايا (خلية/مل)-1)حجم الخلية القياسي (مل)حجم الماء الخالي من النوكلياز (مل)الحجم الكلي (مل)
Od0تحديد العدد باستخدام غرفة عد كرات الدم (Hemocytometer)
Od1يجب استخلاصها لتصل إلى نطاق 107 خلية/مل-120
Od210-1 Od12 من Od11820
كثافة بصرية 3 (Od3)10-2 أو دي 1 (Od1)2 من Od21820
كثافة بصرية عند 400 نانومتر (Od400)10-3 Od1٢ من Od31820
الكثافة الضوئية عند طول موجي 5 (أو الامتصاصية عند 5)10-4 أود12 من Od41820
Od610-5 كثافة بصرية 12 من Od51820
Od710-6 الامتصاص الضوئي عند طول موجي 600 نانومتر (Od600)2 من Od61820
Od810-7 Od12 من Od71820
فراغ002020
ب- تحضير منحنى DNA القياسي
أنبوبالتركيز النهائي للحمض النووي (مجم/مل)-1)حجم الحمض النووي القياسي (مل)حجم الماء الخالي من النوكلياز (مل)الحجم الإجمالي (مل)
Dd0التحديد باستخدام NanoDrop
Dd1يجب أن يتم استخلاصها لتصل إلى نطاق 101 ملجم/مل-120
Dd210-1 Dd12 من Dd11820
Dd310-2 Dd12 من Dd21820
دي دي 4 (Dd4)10-3 Dd12 من Dd31820
Dd510-4 Dd12 من Dd41820
دي دي 6 (Dd6)10-5 Dd1٢ من Dd51820
Dd710-6 دي دي 1 (Dd1)2 من Dd61820
Dd810-7 دي دي 12 من Dd71820
فارغ002020

الجدول 2: منحنى DNA القياسي. سلسلة تخفيف خلايا الكائنات الحية الدقيقة القياسية (A)، موضحاً بها حجم الخلايا القياسي، وحجم NFW، والحجم الكلي في كل أنبوب تخفيف. تحضير منحنى DNA القياسي (B)، موضحاً بها حجم DNA القياسي، وحجم NFW، والحجم الكلي في كل أنبوب تخفيف.

  1. تحضير المنحنى القياسي للحمض النووي DNA
    1. استخلص الحمض النووي DNA مباشرة من عينة قياسية من الكائن الحي الدقيق المستهدف (Dd0) باستخدام نفس الإجراء الموضح للمرشحات التجريبية في الخطوة 3.4.
    2. استخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز الحمض النووي DNA في العينة القياسية (Dd0) عند طول موجي 260 nm.
    3. جهز تسعة أنابيب معقمة سعة 0.5 ml لتحضير المنحنى القياسي للحمض النووي DNA، كما هو موضح في الجدول 2B.
    4. إذا لزم الأمر، خفف محلول الحمض النووي DNA القياسي Dd0 ليكون ضمن نطاق تركيز يتراوح بين 1-10 µg ml-1 في الأنبوب الأول (Dd1) في حجم إجمالي قدره 20 µl.
    5. أضف 18 µl من الماء الخالي من النيوكلياز NFW إلى الأنابيب Dd2-Dd8 و20 µl إلى أنبوب العينة الفارغة (blank tube).
    6. انقل 2 µl من محلول الحمض النووي DNA القياسي من Dd1 إلى Dd2. استخدم الماصة بلطف للمزج ثم انقل 2 µl من Dd2 إلى Dd3. استمر في تخفيف الحمض النووي DNA بنفس الطريقة عبر الأنابيب لتحقيق تخفيف تسلسلي بنسبة 100-10-7 في الأنابيب Dd2-Dd8، بالإضافة إلى أنبوب فارغ يحتوي على NFW فقط.
      ملاحظة: في حال عدم إجراء التحليل في نفس يوم الاستخلاص، تُحفظ العينات عند درجة حرارة -20 °C حتى موعد التحليل.
  2. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي Quantitative-PCR
    1. قم بتشغيل جهاز q-PCR مسبقاً لتهيئة درجة حرارته.
    2. في ملف برنامج جديد، أدخل تفاصيل تشغيل q-PCR في برنامج تشغيل الجهاز كما هو مفصل في الجدول 3.
      ملاحظة: تختلف الأجهزة في التوقيت الأمثل لكل خطوة من خطوات الدورة الحرارية. يتم تحديد هذه المدخلات في دليل استخدام الجهاز.
    3. قم بتطهير سطح العمل باستخدام مزيل تلوث الحمض النووي DNA الخاص بالأسطح، واعمل فقط باستخدام أنابيب ورؤوس ماصات وكواشف معقمة.
    4. جهز وعاءً من الثلج بجانب طاولة العمل. احفظ خليط Taq-polymerase على الثلج.
    5. احسب العدد الإجمالي لآبار التفاعل التي سيتم إشغالها في اللوحة. ضع في الاعتبار هامشاً نظرياً للتفاعلات الإضافية (5%) واضرب عدد التفاعلات الموسع في حجم التفاعل الواحد لحساب الحجم الإجمالي للتفاعل.
    6. جهز المزيج المشترك للتفاعل، بدءاً من NFW، ثم البادئات (primers)، والمسبار (probe)، وأخيراً خليط Taq polymerase. انظر المثال الخاص بحسابات حجم المزيج المشترك في الجدول 4.
    7. احفظ مزيج التفاعل في مكان مظلم وعلى الثلج حتى استخدامه.
    8. ضع 1 µl من الحمض النووي DNA القياسي، أو الحمض النووي DNA للعينة، أو NFW (كضابط سلبي) داخل آبار لوحة q-PCR الدقيقة في ثلاث مكررات.
    9. تأكد من وضع اللوحة في حامل اللوحات لمنع ملامستها لسطح العمل وللحفاظ على نظافتها.
    10. أضف 9 µl من المزيج المشترك (الجدول 4) في كل بئر تفاعل.
    11. غطِّ اللوحة بفيلم لاصق بصري وأحكم إغلاقه من جميع الجوانب.
    12. قم بتدوير اللوحة في جهاز طرد مركزي مزود بحوامل لوحات لمدة 1 min عند 1,000 x g قبل وضعها في جهاز q-PCR.
    13. ضع اللوحة في الجهاز وقم بتفعيل برنامج التشغيل.
معلمةالتفاصيلتعليقات
طريقة الكشف مسبار تحلل كمي
شروط الدورات الحرارية 
المسخ الأولي وتنشيط الإنزيم 95 °C لمدة 10 دقائق
المسخ (Denaturation) 95 °C لمدة 15 ثانيةكرر ٤٥ مرة
الارتباط والتمديد60 °C لمدة 60 ثانية
مصفوفة الأطباق
المنحنى القياسيدي 1 - دي 83 مكررات لكل تخفيف في الآبار من 1 إلى 8 في الصفوف الثلاثة العلوية
ضابط عدم وجود قالب (NTC)ماء خالٍ من النوكلياز (NFW)٣ تكرارات في الـ ٩th املأ الصفوف الثلاثة العليا.
العينات التي تم تحليلهاالحمض النووي (DNA) المستخلص من المرشحات٣ مكررات لكل عينة في الآبار المتبقية.
مجموعة البادئاتلكل بئر
حجم العينة١٠ مل

الجدول 3: تفاصيل برنامج تشغيل q-PCR. تفاصيل معايير التحليل التي يجب إدخالها في ملف برنامج q-PCR.

الكاشفالحجم لكل تفاعل (ml)عدد التفاعلاتهامش الخطأ (5%)إجمالي حجم الخليط (ml)
Taq polymerase mix55052.5262.5
F primer (10 mM) 0.55052.526.25
R primer (10 mM)0.55052.526.25
ماء خالٍ من النيوكلياز 35052.5157.5
DNA - سيتم إضافة 1 ml مباشرة في الآبار المستهدفة في لوح الـ 96.

الجدول 4: حسابات خليط تفاعل Quantitative-PCR. يتم تفصيل الحجم لكل تفاعل، وعدد التفاعلات، وهامش الخطأ، وإجمالي الحجم المحسوب الواجب إضافته إلى خليط التفاعل لكل كاشف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من الشائع دراسة الهباء الجوي باستخدام تحليلات "غير متصلة" (off-line) للمرشحات التي تم أخذ عينات منها (انظر الشكل 2).32 وتشمل التحليلات الكيميائية للمواد التي تم جمع عينات منها المحتوى العضوي (على سبيل المثال: البروتينات، وجزيئات الهيدروكربونات، والسكريات) وغير العضوي (على سبيل المثال: المعادن والأملاح). بينما تشمل التحليلات البيولوجية محتوى الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة، وتحديد الأنواع باستخدام منهجية الحمض النووي D...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا العمل طرق الاستخراج والكشف لقياس كل من السموم الداخلية والحمض النووي الموجودة في عينات الهباء الجوي التي تم جمعها على المرشحات. تتطلب الأساليب إجراءات روتينية دقيقة ويمكن تنفيذها بسهولة طالما أن التجريبي يلتزم ببعض النقاط الأساسية والمهمة التي تمت مناقشتها هنا.

بالنسبة لخطوة الكشف عن السموم الداخلية ، لاحظ أن محلول المحلل لزج تماما ويميل إلى إنتاج فقاعات عند سحب العينات. من الصعب إزالة الفقاعات ، وتؤدي إلى تغييرات في قيم قارئ الصفيحة الدقيقة. لذلك ، من المهم وضع العينة أولا في اللوحة و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الدكتور يوآف باراك من كلية الكيمياء في معهد وايزمان على الدعم والمشورة. تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة # 913/12) ، ومؤسسة مينيرفا بتمويل من الوزارة الألمانية الفيدرالية للتعليم والبحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > مرشح أخذ العينات < / قوي >
HiVol 3000 - جهاز أخذ عينات الهواء عالي الحجمEcotech
Quartz MicrofiberWhatman1851-865203 مم × 254 مم
قزم - أفران غرفة المختبرCarboliteELF 11series
رقائق الألومنيومأوبال
< strong>nameCompanyCatalog NumberComments
Endotoxin
EthanolSigma Aldrich16368 كاشف المختبر ، 96٪
خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية من Airstream AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell -TAssociates of Cape Cod، Inc.T0051
معيار التحكم في السمومشركاء كيب كود ، Inc.E0005-1الإشريكية القولونية  O113: H10 ، 0.5 & مايكرو ؛ ز / قارورة 1 عبوة
LAL كاشف المياهالشركاء من كيب كود ، Inc.W0051
حقنة معقمة سعة 10 مل مع طرف Luer-LokBecton-Dickinson & Co.309605
إبرة حقنة BD PrecisionglideBecton-Dickinson & Co.305129معقم 
شريط الختم Parafilm-MParafilmP7543رقم كتالوج Sigma
MicrotubesAxigenMCT-200-C2 مل ، خالي من البيروجين
بقطر 1.12 سم Cork BorerBoekel Scientific1601 BD Series - جزءفولاذي من مجموعة حفار الفلين تحتوي على حفار بأقطار مختلفة.
50 مم طبق بتريمينيبلاست عين شيمر72050-01دوامة معقمة
جيني 2  الصناعات العلمية ، وشركةSI-0297
جهاز طرد مركزي دقيق 5415 DEppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI w / lidNunc167008آبار مسطحة القاع (مع غطاء (ملفوفة بشكل فردي)) ، معقمة ، خالية من البيروجين
Synergy HT Multi-Detection Microplate ReaderBiotek7091000
Name< / strong > Company < / strong><قوي>رقم الكتالوجتعليقات
DNA
DNA بعيداSigma Aldrich7010
الحمض النووي القياسي للأنواع الميكروبية ذات الأهميةATCC أو مجموعةإما السلالة الميكروبية المناسبة لاستخراج الحمض النووي أو الحمض النووي
المستخرجTE لمقياس الدم Marienfeld640030
المحسن من Neubauer، Low EDTALife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0)  0.1 ملي متر EDTA 
مياه خالية من النوكلياز من الدرجة PCR يستهدف Sigma Aldrich3315959001
بادئات PCRSigma Aldrichالأنواع الميكروبية ذات الأهمية
مجسات ذات علامات مزدوجةSigma Aldrichتستهدف الأنواع الميكروبية ذات الأهمية
أنابيب الغطاء اللولبيAxigenST-200-SS2 مل & nbsp ؛
مجموعة استخراج الحمض النووي PowerSoil Mo Bio Laboratories12888-100
خرز زجاجي ، مغسول بالحمض 425-600 ومايكرو ؛ مسيجما ألدريتشG8772-100G
حبات زجاجية ، مغسولة بالحمض < ؛ 106 وميكرو ؛ mSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Solution C1Mo Bio Laboratories12888-100-1عازلة تحلل الخلايا ، مجموعة التربة
دلو الثلج Magic TouchBel-Art18848-4001
Mini-Beadbeater-16BioSpec607EUR
StepOnePlus نظام PCR في الوقت الحقيقيالأنظمة الحيوية المطبقة4376600
سريع SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4370048
MicroAmp لوحة تفاعل بصرية سريعة 96 بئر مع باركود ، 0.1 ملأنظمة حيوية تطبيقية4346906
MicroAmp خالية من الرذاذ 96 بئربيوأنظمة حيويةتطبيقية 4312063
فيلملاصق بصري MicroAmpأنظمة حيوية تطبيقية4311971
الطرد المركزي 5810 REppendorf5811 000.010الدوار A-4-62 مع جرافات MTP   ؛
مرشحات الداخلية الثقافة الأخرى المخزن المؤقت الكهربائية قاعدة أجهزة

المراجع

  1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
  3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).
  9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
  10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
  26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
  27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
  28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
  29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
  32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
  33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
  40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة