Method Article

كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة

DOI:

10.3791/53445

⸱

December 23rd, 2015

 ,  , 
1Molecular Microbiology and Microbial Pathogenesis Program, Washington University School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, Washington University School of Medicine, 3Drug Discovery Program in Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine, 4Biochemistry Program, Washington University School of Medicine, 5Center for the Investigation of Membrane Excitability Diseases, Washington University School of Medicine, 6Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 7Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا بروتوكول سريع وفعال من حيث التكلفة لإنتاج بروتينات الثدييات المفرزة والجليكوزيل والتنقية اللاحقة أحادية الخطوة مع عوائد كافية من البروتين المتجانس لعلم البلورات بالأشعة السينية والدراسات الفيزيائية الحيوية الأخرى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يكون إنتاج بروتينات الثدييات المفرزة للدراسات الهيكلية والفيزيائية الحيوية أمرا صعبا ويستغرق وقتا طويلا ومكلفا. فيما يلي بروتوكول فعال من حيث الوقت والتكلفة للتعبير عن البروتين المفرز في خلايا الثدييات وتنقية بخطوة واحدة باستخدام كروماتوغرافيا تقارب النيكل. يعتمد النظام على تعداء عابر على نطاق واسع لخلايا الثدييات المعلقة ، مما يقلل بشكل كبير من وقت إنتاج البروتين ، لأنه يلغي الخطوات ، مثل تطوير فيروسات التعبير أو توليد خطوط خلوية معبرة مستقرة. يستخدم هذا البروتوكول عوامل تعدين رخيصة الثمن ، والتي يمكن تصنيعها بسهولة عن طريق التعديل الكيميائي البسيط ، أو عوامل التعداء ذات الأسعار المعتدلة ، والتي تزيد من العائد من خلال زيادة كفاءة التعداء وتقليل السمية الخلوية. المراقبة الدقيقة والحفاظ على مستويات الجلوكوز في الوسائط تزيد من إنتاجية البروتين. يؤدي التحكم في نضوج الجليكان الأصلي في خطوة التعبير إلى زيادة العائد النهائي لبروتينات الثدييات المطوية والوظيفية بشكل صحيح ، وهي خصائص مثالية لمتابعة علم البلورات بالأشعة السينية. في بعض الحالات ، ينتج التنقية أحادية الخطوة بروتينا بدرجة نقاء كافية للتبلور ، وهو ما يتضح هنا كمثال على الحالة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم بنية البروتين على المستوى الذري هو المفتاح لكشف الأساس الجزيئي للمسارات البيولوجية والأمراض. الأشعة السينية البروتين البلورات هي / طريقة المطبق الأكثر استخداما لتحديد هياكل الجزيئات. التحدي الرئيسي لهذه الطريقة هو الحصول على كميات كافية من مطوية بشكل صحيح، البروتين النقي. هذا يصبح قضية خاصة عندما تعمل مع البروتينات الثدييات يفرز، التي تخضع التعديلات بعد متعدية محددة.

البروتينات أعرب البكتريا-هي المصدر الرئيسي للبروتينات تبلور المودعة في بنك معلومات البروتين 1. ويفضل أنظمة التعبير البكتيرية إلى حد كبير لأنها سريعة وغير مكلفة وتنتج غلة عالية من ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنتاج كميات مليغرام DNA البلازميد على نطاق واسع ترنسفكأيشن عابر

  1. استنساخ البروتين من الفائدة في نسخة عالية عدد الثدييات ناقلات التعبير باستخدام الاستنساخ موقع التقييد، أو تقنية أخرى مناسبة.
    1. لأفضل النتائج، استخدم pHLsec 7 ناقلات، والتي لديها المدمج في محطة سي 6His العلامة، مروج تسلسل كوزاك قوي وإشارة إفراز الأمثل.
  2. تحويل البلازميد على الخلايا المختصة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلي هذه الوثيقة نتائج هذا النظام التعبير تطبيقها على يفرز 13 كيلو دالتون المناعي (IG) المجال من البروتين مما اثار مستقبل بشري أعرب عن خلايا الدم النخاعي 2 (hTREM2، وبقايا 19-132). TREM2 هو نوع I بروتين الغشاء خارج الخلية التي تحتوي على مجال واحد أ.ج التي لديها اثنين من السندات ثاني كبريتيد وموقعين بالغليكوزيل المرتبطة N. على عكس العديد من البروتينات مجال أخرى الإيج 8، كان TREM2 غير قابلة للrefolding من الهيئات إدراج البكتيرية 9. مطلوبة الطفرات اللاحقة أكدت gl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا كلوة 293F تقدم إنتاج قوي من البروتينات التي تتطلب التعديلات بعد متعدية. هذا النظام يسمح التعبير السريع وقابلة للبروتينات مطوية أصلا تحتوي على ثنائي السلفيدات، بالغليكوزيل، والفسفرة التي لولاها تكون غائبة في استخدام المزيد من أدوات التعبير الروتينية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام يمكن استخدامه للتعبير عن وتنقية مجمعات متعددة البروتين ببساطة عن طريق التعاون ترنسفكأيشن من البلازميدات متعددة. إلى جانب TREM2، وقد تم هذا النظام يستخدم على نطاق واسع للدراسات الفنية مع البروتينا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'>تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01-HL119813 (إلى TJB) ، وجمعية الرئة الأمريكية RG-196051 (إلى TJB) ، ومنحة CIMED التجريبية والجدوى (إلى TJB) ، وزمالات ما قبل الدكتوراه لجمعية القلب الأمريكية 14PRE19970008 (إلى ZY) و 15PRE22110004 (إلى D.L.K.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
قوارير الثقافةGeneMateF-5909B
293 Freestyle MediaGibco / Life Technologies12338-018
GlutaMAXGibco / Life Technologies35050-061استخدم بدلا من كاشف الجلوتامين
Hype 5Oz BiosciencesHY01500
293fectin كاشفالتعداء Life Technologiesكاشف التعداء 12347019
PEISigma-Aldrich408727
Maxiprep KitQiagen12162
Ni-NTA Superflow Qiagen30430
Endo HfNEBP0703L
راتنج الأميليوزNEBE8021S
Cell Boost R05.2HyCloneSH30584.02مكمل زراعة الخلايا
GlucCellCESCO BioengineeringDG2032نظام مراقبة الجلوكوز
Opti-MEMLife Technologies519850.91مجاني متوسط لنقل الحمض النووي
مرق لوريا (LB Media) تقنياتالحياة10855-001
GC10 الخلايا المختصةسيجما ألدريتشG2919
مصل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674(2013).
  2. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mammalian Cell ExpressionExtracellular GlycoproteinsNickel Affinity ChromatographyTransient TransfectionProtein PurificationGlycan MaturationCell Viability MonitoringMedia Glucose ControlSingle step PurificationProtein Crystallization

Related Articles