Method Article

كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة

DOI:

10.3791/53445

⸱

December 23rd, 2015

 ,  , 
1Molecular Microbiology and Microbial Pathogenesis Program, Washington University School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, Washington University School of Medicine, 3Drug Discovery Program in Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine, 4Biochemistry Program, Washington University School of Medicine, 5Center for the Investigation of Membrane Excitability Diseases, Washington University School of Medicine, 6Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 7Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا بروتوكول سريع وفعال من حيث التكلفة لإنتاج بروتينات الثدييات المفرزة والجليكوزيل والتنقية اللاحقة أحادية الخطوة مع عوائد كافية من البروتين المتجانس لعلم البلورات بالأشعة السينية والدراسات الفيزيائية الحيوية الأخرى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يكون إنتاج بروتينات الثدييات المفرزة للدراسات الهيكلية والفيزيائية الحيوية أمرا صعبا ويستغرق وقتا طويلا ومكلفا. فيما يلي بروتوكول فعال من حيث الوقت والتكلفة للتعبير عن البروتين المفرز في خلايا الثدييات وتنقية بخطوة واحدة باستخدام كروماتوغرافيا تقارب النيكل. يعتمد النظام على تعداء عابر على نطاق واسع لخلايا الثدييات المعلقة ، مما يقلل بشكل كبير من وقت إنتاج البروتين ، لأنه يلغي الخطوات ، مثل تطوير فيروسات التعبير أو توليد خطوط خلوية معبرة مستقرة. يستخدم هذا البروتوكول عوامل تعدين رخيصة الثمن ، والتي يمكن تصنيعها بسهولة عن طريق التعديل الكيميائي البسيط ، أو عوامل التعداء ذات الأسعار المعتدلة ، والتي تزيد من العائد من خلال زيادة كفاءة التعداء وتقليل السمية الخلوية. المراقبة الدقيقة والحفاظ على مستويات الجلوكوز في الوسائط تزيد من إنتاجية البروتين. يؤدي التحكم في نضوج الجليكان الأصلي في خطوة التعبير إلى زيادة العائد النهائي لبروتينات الثدييات المطوية والوظيفية بشكل صحيح ، وهي خصائص مثالية لمتابعة علم البلورات بالأشعة السينية. في بعض الحالات ، ينتج التنقية أحادية الخطوة بروتينا بدرجة نقاء كافية للتبلور ، وهو ما يتضح هنا كمثال على الحالة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم بنية البروتين على المستوى الذري هو المفتاح لكشف الأساس الجزيئي للمسارات البيولوجية والأمراض. الأشعة السينية البروتين البلورات هي / طريقة المطبق الأكثر استخداما لتحديد هياكل الجزيئات. التحدي الرئيسي لهذه الطريقة هو الحصول على كميات كافية من مطوية بشكل صحيح، البروتين النقي. هذا يصبح قضية خاصة عندما تعمل مع البروتينات الثدييات يفرز، التي تخضع التعديلات بعد متعدية محددة.

البروتينات أعرب البكتريا-هي المصدر الرئيسي للبروتينات تبلور المودعة في بنك معلومات البروتين 1. ويفضل أنظمة التعبير البكتيرية إلى حد كبير لأنها سريعة وغير مكلفة وتنتج غلة عالية من البروتين عادة. ومع ذلك، غالبا ما تكون غير مطوية بشكل صحيح المجالات خارج الخلية من البروتينات الثدييات أعرب في البكتيريا، التي مطلوبة refolding حالة وتنقية واسعة الخطوات للحصول على متجانس FOlded البروتين. بالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتينات الثدييات تتطلب بالغليكوزيل آخر متعدية لتحقيق لطي السليم 2. على الرغم من أن التعبير وبالغليكوزيل في خلايا الخميرة أو الحشرات يمكن التغلب على مشكلة قابلة للطي، والتعديلات بعد متعدية، بما في ذلك بالغليكوزيل، تختلف كثيرا عن تلك الخلايا الثديية 3، مما أسفر عن البروتينات مع التعديلات غير صحيحة أو غير متجانسة.

خلايا الثدييات تعبر عن جميع الآلات الجزيئية اللازمة لضمان التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية المناسبة وقابلة للطي. ومع ذلك، لا يفضل هذه الأنظمة التعبير عادة من قبل معظم المختبرات، وذلك بسبب عائدات محدودة وارتفاع تكاليف الكواشف والمواد الاستهلاكية. Polyethyleneimine (PEI)، وكاشف ترنسفكأيشن هو معيار رخيصة نسبيا ولكن يفرض السمية الخلوية كبيرة وانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن، مما أدى إلى زيادة التكاليف في وسائل الإعلام خلية، DNA، وزراعة المعدات. العديد من البدائل لPEI باهظة التكاليف. نتناولهذه القضايا من خلال وصف مزيج من تحسين أدوات زراعة الخلايا ومعدلة كيميائيا PEI للطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا للتعبير عن البروتينات الثدييات يفرز، تليها خطوة واحدة تنقية. هذا الأسلوب القوي يعطي عوائد كافية للدراسات الفنية والبيوكيميائية 4، وفي بعض الحالات، يؤدي إلى بروتين قابلة للتبلور دون مزيد من التنقية.

يصف هذا البروتوكول العديد من التقنيات لتحقيق أقصى قدر من التعبير والاستسلام للبروتينات في الثدييات يفرز في الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293F الخلايا المزروعة في التعليق. كفاءة ترنسفكأيشن (والتكلفة)، وإنتاج البروتين وتنقية كلها تتعزز بشكل كبير باتباع هذا البروتوكول. PEI تعديل بإضافة الكربانيت من خلال خطوة واحدة رد فعل عصابة فتح (PEI-TMC-25 والتركيب والخواص وصفها بالتفصيل في المرجع 5) يحسن إلى حد كبير كفاءة ترنسفكأيشن، ويقلل من السمية الخلوية من الموجبةاضطراب الغشاء، وبالتالي يقلل من تكاليف التجربة. وعلاوة على ذلك، بقاء الخلية وبروتين تعبير تحسنت كثيرا مع إضافة المكملات الثقافة لتوفير الجلوكوز والفيتامينات. الأهم لإنتاج البروتينات الغليكوزيلاتي، والمعاملة مع kifunensine، مثبط كيميائية غير سامة من مانوزيداز I، وتنتج البروتينات مع المعرفة، glycans غير الناضجة، والتي يمكن إزالتها بواسطة EndoHf endoglycosidase لانتاج البروتينات مع واحد N-acetylglucosamine في مكان كامل طول N-ربط غليكان 6. وأخيرا، فإن إفراز البروتينات في المصل خالية والمتوسطة محددة كيميائيا يسمح تنقية السريعة والسهلة للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية. خطوة واحدة حامض والنيكل nitrilotriacetic (ني NTA) تنقية الراتنج يزيل معظم تلويث الأنواع في طاف، وفي بعض الحالات، يمكن أن تسفر عن بروتين من نقاء كافية لبلورة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنتاج كميات مليغرام DNA البلازميد على نطاق واسع ترنسفكأيشن عابر

  1. استنساخ البروتين من الفائدة في نسخة عالية عدد الثدييات ناقلات التعبير باستخدام الاستنساخ موقع التقييد، أو تقنية أخرى مناسبة.
    1. لأفضل النتائج، استخدم pHLsec 7 ناقلات، والتي لديها المدمج في محطة سي 6His العلامة، مروج تسلسل كوزاك قوي وإشارة إفراز الأمثل.
  2. تحويل البلازميد على الخلايا المختصة.
    1. إضافة 20 ميكرولتر من الخلايا القولونية E. المختصة على 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    2. خلايا الصدمة الحرارية في 42 درجة مئوية لمدة 35 ثانية، ثم احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة 300 ميكرولتر من متوسط ​​النمو الميكروبي (SOC)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، والهز في 220 دورة في الدقيقة.
    4. لوحة الخلايا على لوحة أجار مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة.
      1. استخدام 100 ميكروغرام / مل كربنيسيلين إذا البلازميد هو في ناقلات pHLsec.
  3. المستعمرات ثقافة في 250 مل من مرق لوريا (LB) وسائل الإعلام تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل مضاد حيوي (كربنيسيلين) O / N عند 37 درجة مئوية، والهز في 220 دورة في الدقيقة.
  4. تنقية DNA من الثقافة باستخدام مرحبا السرعة البلازميد ماكسي كيت وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
    1. أزل الحمض النووي في المخزن EB (10 ملي تريس الكلورين، ودرجة الحموضة 8.5)، بدلا من العازلة TE.
    2. قسامة البلازميد المنقى في المبلغ اللازم لترنسفكأيشن وتخزينها في -20 ° C.

2. على نطاق واسع الثقافة وعابر ترنسفكأيشن من خلايا 293F

  1. الملحق 1 L 293F وسائل الإعلام مع 10 مل من الجلوتامين و 5 مل القلم / بكتيريا (سواء 100X). تخزينها في 4 ° C. 5 مل القلم / بكتيريا هو مصدر قوة كافية في ظروف خالية من المصل وتركيز المضادات الحيوية انخفاض يحسن بقاء الخلية خلال ترنسفكأيشن، مما يحسن من عوائد البروتين.
  2. ثقافة الخلايا 293F في 300 مل سائل الاعلام في 1 L البولي حير قوارير مخروطي مع غطاء تنفيسالصورة في 37 ° C مع 8٪ CO 2، في حين تهتز في نسيج الثقافة حاضنة قياسية.
  3. تمييع الخلايا إلى 5 × 5 10 / مل كثافة قبل ترنسفكأيشن يوم واحد.
  4. في يوم ترنسفكأيشن، الملحق مستنبت بإضافة حجم 10٪ من 2٪ ث / ت سرع في 293F وسائل الإعلام.
    1. قياس تركيز الجلوكوز باستخدام جهاز الجلوكوز وفقا لتعليمات الشركة الصانعة والمكملات استخدام حسب الحاجة لتحقيق تركيز الجلوكوز من 500 ملغ / ديسيلتر.
  5. إضافة kifunensine (1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) في هذه الخطوة للسيطرة على البروتين بالغليكوزيل.
  6. حساب حجم DNA اللازمة ل1 ميكروغرام البلازميد في 1 × 10 6 خلايا. تحت ظروف معقمة، وتمييع DNA في 5 مل مصل خالية المتوسطة.
  7. حساب حجم كاشف ترنسفكأيشن اللازمة ل1 ميكروغرام البلازميد في 2 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن. تحت ظروف معقمة، وتمييع كاشف ترنسفكأيشن (PEI-TMC-25) في 5 مل مصل خالية المتوسطة.
  8. إضافةكاشف ترنسفكأيشن إلى حل DNA في 1 مل الزيادات، خلط بلطف. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT للمجمعات-DNA كاشف لتشكيل. ثم إضافة محلول على الخلايا بطريقة الإفلات من الحكمة.
  9. السماح الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل للتعبير عن البروتين ل72-96 ساعة. الملحق مع وسائل الإعلام ~ 10٪ زيادة حجم خلية يوميا، أو حسب الضرورة للحفاظ على مستوى السكر في قراءة 400-600 ملغ / ديسيلتر.

3. تنقية

  1. صب الثقافة في قارورة الطرد المركزي، الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1300 x ج لتكوير الخلايا ومن ثم جمع طاف. إذا لزم الأمر، وتدور مرة ثانية و / أو استخدام فلتر 0.22 ميكرون لتوضيح طاف.
  2. إضافة 10٪ حجم 10X ني NTA العازلة ملزمة (1.5 M كلوريد الصوديوم، 0.5 MK 2 هبو 4، 0.1 M تريس درجة الحموضة 8.5، 50 ملي إميدازول).
  3. إعداد عمود الجاذبية عن طريق إضافة 2 مل من ني NTA الطين في عمود وتوازنه مع 10 مجلدات العمود (CV) من 1X العازلة ملزمة. إذا كان ذلك ممكنا، القيام بكل الخطوات عمود في غرفة C 4 درجات. البديلةاعل، البروتين البرد وجميع المخازن على الجليد قبل الخطوة العمود، والحفاظ على البروتين والتي تم جمعها من خلال التدفق على الجليد.
    ملاحظة: ني NTA الطين هو 50٪ راتنج من حيث الحجم والقدرة على تصنيع وملزمة المعلن هو 50 ملغ / مل. حبات ني NTA يمكن إعادة شحن لاستخدامات متعددة
  4. تدفق طاف على الراتنج وجمع التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة.
  5. يغسل مع 10 CV من غسل العازلة (300 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي K 2 هبو 4 و 20 ملي إميدازول درجة الحموضة 8).
  6. أزل البروتين في 5 CV من شطف العازلة (300 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي K 2 هبو 4، 250 ملي إميدازول درجة الحموضة 8).
  7. إذا كنت بحاجة deglycosylation:
    1. عن الحجم النهائي من 0.5 مل، والتركيز شطافة إلى 0.43 مل باستخدام مكثف الطرد المركزي. إذا يترسب النموذج، بيليه أي حطام بواسطة الطرد المركزي في 16000 x ج و 4 درجات مئوية.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من 500 ملي نا السيترات درجة الحموضة 5.5.
    3. إضافة 20 ميكرولتر من EndoHf (1 × 10 6 U / مل). في احتضان RT لمدة 2 ساعة.
      ليسه: يعمل انزيم الأمثل عند 37 درجة مئوية، مما قد يسبب البروتين مركزة لتجميع. تمديد حضانة RT، إذا deglycosylation، المقررة من قبل SDS-PAGE أو immunoblotting، غير كامل. لم يقم انزيم النشاط في 4 درجات مئوية.
    4. لإزالة EndoHf: غسل الأميلوز الراتنج 3X في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو عازلة التخزين النهائي. احتضان البروتين مع الراتنج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تدور 5 دقائق في 1000 x ج لتكوير الخرز وجمع طاف.
    5. تركيز البروتين باستخدام الوزن الجزيئي قطع فلتر الطرد المركزي المناسب والعازلة الصرف إلى العازلة التخزين (150 ملي كلوريد الصوديوم، و 20 ملي HEPES 7.5 درجة الحموضة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلي هذه الوثيقة نتائج هذا النظام التعبير تطبيقها على يفرز 13 كيلو دالتون المناعي (IG) المجال من البروتين مما اثار مستقبل بشري أعرب عن خلايا الدم النخاعي 2 (hTREM2، وبقايا 19-132). TREM2 هو نوع I بروتين الغشاء خارج الخلية التي تحتوي على مجال واحد أ.ج التي لديها اثنين من السندات ثاني كبريتيد وموقعين بالغليكوزيل المرتبطة N. على عكس العديد من البروتينات مجال أخرى الإيج 8، كان TREM2 غير قابلة للrefolding من الهيئات إدراج البكتيرية 9. مطلوبة الطفرات اللاحقة أكدت gl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا كلوة 293F تقدم إنتاج قوي من البروتينات التي تتطلب التعديلات بعد متعدية. هذا النظام يسمح التعبير السريع وقابلة للبروتينات مطوية أصلا تحتوي على ثنائي السلفيدات، بالغليكوزيل، والفسفرة التي لولاها تكون غائبة في استخدام المزيد من أدوات التعبير الروتينية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام يمكن استخدامه للتعبير عن وتنقية مجمعات متعددة البروتين ببساطة عن طريق التعاون ترنسفكأيشن من البلازميدات متعددة. إلى جانب TREM2، وقد تم هذا النظام يستخدم على نطاق واسع للدراسات الفنية مع البروتينا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'>تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01-HL119813 (إلى TJB) ، وجمعية الرئة الأمريكية RG-196051 (إلى TJB) ، ومنحة CIMED التجريبية والجدوى (إلى TJB) ، وزمالات ما قبل الدكتوراه لجمعية القلب الأمريكية 14PRE19970008 (إلى ZY) و 15PRE22110004 (إلى D.L.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
قوارير الثقافةGeneMateF-5909B
293 Freestyle MediaGibco / Life Technologies12338-018
GlutaMAXGibco / Life Technologies35050-061استخدم بدلا من كاشف الجلوتامين
Hype 5Oz BiosciencesHY01500
293fectin كاشفالتعداء Life Technologiesكاشف التعداء 12347019
PEISigma-Aldrich408727
Maxiprep KitQiagen12162
Ni-NTA Superflow Qiagen30430
Endo HfNEBP0703L
راتنج الأميليوزNEBE8021S
Cell Boost R05.2HyCloneSH30584.02مكمل زراعة الخلايا
GlucCellCESCO BioengineeringDG2032نظام مراقبة الجلوكوز
Opti-MEMLife Technologies519850.91مجاني متوسط لنقل الحمض النووي
مرق لوريا (LB Media) تقنياتالحياة10855-001
GC10 الخلايا المختصةسيجما ألدريتشG2919
مصل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674(2013).
  2. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
  3. Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
  4. Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
  5. Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
  6. Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
  7. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
  8. Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
  9. Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
  10. Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
  11. Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
  12. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mammalian Cell ExpressionExtracellular GlycoproteinsNickel Affinity ChromatographyTransient TransfectionProtein PurificationGlycan MaturationCell Viability MonitoringMedia Glucose ControlSingle step PurificationProtein Crystallization

Related Articles