التحول من الخميرة بروبيوتيك وشفائهم من الجهاز الهضمي المناعي الأنسجة بعد بالتزقيم عن طريق الفم في الفئران

ملخص

المقدمة هنا هو وصف موحد من التقنيات التي يمكن استخدامها لتطوير وتحويل وإدارة، واختبار بروتين تعبير مغاير للخميرة الخباز بروبيوتيك boulardii.

الملخص

تطوير العلاج الفموي المؤتلف سيسمح بمزيد من الاستهداف المباشر للجهاز المناعي المخاطي وتحسين القدرة على مكافحة اضطرابات الجهاز الهضمي. إن تكييف خميرة البروبيوتيك على وجه الخصوص لهذا النهج يحمل العديد من المزايا. لا تملك هذه السلالات القدرة على تصنيع مجموعة متنوعة من البروتينات غير المتجانسة المعقدة فحسب ، بل إنها قادرة أيضا على البقاء على قيد الحياة وحماية تلك البروتينات أثناء العبور عبر الأمعاء. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يتطلب خبرة في العديد من التقنيات المختبرية المتنوعة التي لا تستخدم عادة جنبا إلى جنب. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن البروتوكولات الفردية لتحويل الخميرة تتميز بشكل جيد بسلالات المختبر شائعة الاستخدام ، إلا أنه يتم التركيز هنا على الأساليب البديلة وأهمية تحسين التحول لسلالات البروبيوتيك الأقل تميزا. سيساعد تفصيل هذه الأساليب في تسهيل المناقشة حول أفضل الأساليب لاختبار خميرة البروبيوتيك كوسائل توصيل المخدرات عن طريق الفم وتعمل بالفعل على تعزيز تطوير هذه الاستراتيجية الجديدة لعلاج الجهاز الهضمي.

المقدمة

الكائنات الحية الدقيقة بروبيوتيك وسيلة للفضول المحتملة للبكفاءة واقتصاديا تقديم البروتينات مغاير إلى الجهاز الهضمي. هذه الكائنات قادرة على قيد الحياة المرور عبر الجهاز الهضمي بعد لا استعمار ^{النتيجة} 1، مما الجرعات التي تسيطر عليها والحد من التعرض للدواء أعربت. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على مهندس بسهولة هذه الكائنات لإنتاج البروتين مغاير على نطاق واسع يجعل لهم بديل اقتصادي لجزيئات تسليم الاصطناعية. ومع ذلك، وضع مثل هذا النهج، كما ثبت مؤخرا باستخدام سلالة العوز الغذائي في خميرة بروبيوتيك boulardii ^2، يتطلب معرفة التقنيات المخبرية لا جنبا إلى جنب تقليديا ضمن دراسة معينة، بدءا من الخميرة وعلم....

البروتوكول

1. الأشعة فوق البنفسجية الطفرات لتوليد العوز الغذائي سلالات الخميرة

1. توليد منحنيات البقاء على قيد الحياة لتحديد الجرعات المطلوبة من الأشعة فوق البنفسجية
   1. إعداد YPD (خلاصة الخميرة ببتون سكر العنب) وسائل الاعلام والكواشف الأخرى المدرجة في الجدول 1 وفقا للاجراءات المتبعة ^{26 و} تطعيم المستعمرات واحد إلى 5-10 مل من وسائل الاعلام YPD. احتضان الثقافات على طبل الأسطوانة عند 30 درجة CO / N من التشبع لا يقل عن 8 ساعة.

النتائج

جيل من منحنى البقاء على قيد الحياة بعد اشعة فوق البنفسجية يتطلب الطلاء من خلايا الخميرة المخفف بحيث مستعمرة مميزة (كفو) قادرة على تشكيل. كل عينة 500 ميكرولتر التي تم جمعها على النحو المبين أعلاه يحتوي على حوالي 5 × ¹⁰ 6 خلايا. ومع ذلك، أكثر من 100 المستعمرات في لوحة يصعب التمييز بدقة. تصفيح عينة غير مخفف وكذلك مسلسل 1:10 التخفيفات من خلايا المشع مما يضمن كفو يمكن حصرها في كل جرعة الأشعة فوق البنفسجية، كما هو موضح في الشكل 1.

المناقشة

معا، وبروتوكولات تصف الوثيقة الخطوات الأساسية اللازمة لتطوير واختبار بعامل نمائي سلالات الخميرة بروبيوتيك للتسليم من البروتين العلاجي مغاير إلى الأمعاء. هذا التلاعب واختبار الخميرة بروبيوتيك المؤتلف يتطلب تقنيات والموارد التي أي مختبر الفردية حاليا قد لا تكون مألوفة. وهكذا، على الرغم من أن العديد من الدراسات السابقة قد وصف البروتوكولات المذكورة أعلاه لعدة الخميرة والفأر السلالات، وهذه الأساليب لها عدم قدمت المعرفة المؤلفين في شكل مفصل، موحدة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا المخطوط يضع ال.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
SmartSpec 3000 مقياس الطيف	BioRad	170-2501	مثال على مقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز الخلية و OD600< / sub> من مزارع الخميرة نيو
برونزويك الأسطوانة	Eppendorf	M1053-4004	مثال على أسطوانة الأسطوانة لحضانة ثقافة الخميرة
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	مثال على stratalinker
ستيوارت كولوني كاونتر SC6PLUS	11983044	فيشر لوحة علمية	حامل مع سجلات تكبير المستعمرة العد على استشعار الضغط من القلم
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	باليد مستعمرة عداد القلم
نسخة طبق الأصل جهاز طلاء	Fisherbrand	09-718-1	مثال على حامل الطلاء المقلدة والوسادات & nbsp ؛
مربعات Velveteen	Fisherbrand	09-718-2
موزعات الخلايا المعقمة على شكل L	Fisherbrand	14665230
حمض الديوكسي ريبونوكلييك ، تقطعت بهم السبل من خصيتين السلمون	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	مثال على الحمض النووي الناقل للخميرة LiOAc تحويل
إبر التزقيم	Braintree Scientific	N-PK & nbsp ؛ 002	بالنسبة للفئران 15-20 جم ، فإن الإبرة المقترحة هي مقياس 22 (كرة 1.25 مم) ، 1 في إبرة تزقيم طويلة ومستقيمة قابلة لإعادة الاستخدام. للفئران التي يزيد وزنها عن 20   ؛ يمكن استخدام إبر تزقيم مستقيمة أو منحنية بمقياس 20 أو أكبر
1 مل حقنة درنة معقمة ذات طرف انزلاقي يمكن التخلص	Becton Dickinson	BD 309659
ملقط حاد مثل علوم المجهر الإلكتروني 7 بوصات (178 مم) طرف مسنن ، ملقط قبضة عريضة	علوم المجهر الإلكتروني	77937-28	مثال على ملقط حاد مطلوب للتشريح   ؛
مقص تشريح مستقيم ومنحني	علوم المجهر الإلكتروني	72966-02 و 72966-03	أمثلة على المقص اللازم لتشريح
تقنيات IMDM		Life 12440053

الضوئي منها