آخر العمود اشتقاق عن طريق رد الفعل أعمدة تدفق عالية الأداء اللوني السائل

Summary

يتم تقديم بروتوكول لاستخدام أعمدة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء لتدفق التفاعل للطرق التي تستخدم اشتقاق العمود اللاحق (PCD).

Abstract

يتم تقديم بروتوكول لاستخدام أعمدة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء لتدفق التفاعل للطرق التي تستخدم اشتقاق العمود اللاحق (PCD). تتمثل إحدى الصعوبات الرئيسية في تكييف PCD مع أنظمة وأعمدة HPLC الحديثة في الحاجة إلى ملفات تفاعل كبيرة الحجم تمكن من خلط الكاشف ثم حدوث تفاعل الاشتقاق. يؤدي هذا الحجم الميت الكبير لعمود المنشور إلى توسيع النطاق ، مما يؤدي إلى فقدان كفاءة الفصل المرصودة والكشف عن الحساسية. في اشتقاق عمود ما بعد تدفق التفاعل (RF-PCD) ، يتم ضخ كاشف (كاشفات) الاشتقاق ضد تدفق الطور المتحرك إلى واحد أو اثنين من المنافذ الخارجية لعمود تدفق التفاعل حيث يتم خلطه مع نفايات العمود السائلة داخل فريت موجود داخل تركيب نهاية العمود. تسمح هذه التقنية بخلط أكثر كفاءة للكاشف (الكاشفات) السائلة للعمود والاشتقاق مما يعني أنه يمكن تقليل حجم حلقات التفاعل أو حتى إزالته تماما. وقد وجد أن طرائق الترددات الراديوية - PCD تعمل بشكل أفضل من طرائق PCD التقليدية من حيث كفاءة الفصل المرصودة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء. ميزة أخرى لتقنيات RF-PCD هي القدرة على مراقبة النفايات السائلة القادمة من المنفذ المركزي في حالتها المنخفضة. تم حاليا تجربة RF-PCD على نطاق صغير نسبيا من تفاعلات العمود اللاحق ، ومع ذلك ، لا يوجد حاليا سبب للإشارة إلى أنه لا يمكن تكييف RF-PCD مع أي مكون واحد أو اثنين موجودين (طالما تمت إضافة كلا الكواشف في نفس الوقت) تفاعل اشتقاق العمود اللاحق.

Introduction

عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) إلى جانب آخر عمود اشتقاق (PCD) هو أداة قوية يمكن أن يكون مفيدا في حل عدد من القضايا في المختبر التحليلي. ويمكن استخدامه للكشف عن المركبات التي لا يمكن اكتشافها إلا مع مجموعة من أجهزة كشف المتاحة ^1،2، وزيادة إشارة الحليلة الهدف، والذي يسمح الحدود الدنيا للكشف وتحديد الكميات ^3-5 أو انتقائي derivatize على الحليلة المستهدفة من أجل تجنب آثار مصفوفة ^6. وتشمل يشيع استخدامها ردود الفعل PCD رد فعل الأمينات، مثل الأحماض الأمينية، مع أورثو-phthaladehyde ^7-9، النينهيدرين ^9،10 أو fluorescamine ^11،12، واشتقاق من أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) لدى ديفينيل 2،2 1-picrylhydrazil المتطرفة (DPPH ^{•) 13،14} أو 2،2'-azino مكرر (حمض 3-ethylbenzothiazoline-6-السلفونيك (ABTS) ^15،16، واستخدام كاشف يوديد-أزيد إلى derivatize الكبريت جمركبات ontaining ^17،18.

هناك، ومع ذلك، العديد من المآخذ على استخدام ردود الفعل PCD مع أنظمة HPLC ^6. أساسا بين هذه هو استخدام لفائف رد فعل بين نقطة إضافة كاشف اشتقاق (ق) وكاشف، مما يتيح الوقت لخلط ورد فعل لتحدث ^8. هذه رد فعل الحلقات غالبا ما يكون حجم 500 ميكرولتر أو أكثر، وهو أمر مهم مقارنة مع حجم ما تبقى من نظام HPLC ^19. استخدام هذه ارتفاع حجم رد الفعل حلقات النتائج في زيادة الذروة توسيع بالمقارنة مع ما سيتم الاحتفال به بدون وجود حلقة رد فعل. هذه النتائج في أقصر، قمم الأوسع نطاقا التي لها حدود أعلى من الكميات والكشف وسلبيا يؤثر قرار الكروماتوغرافي. أرقام 1 و 2 تسليط الضوء على تدهور ذروة الشكل الذي ينتج من إضافة المختلفة بعد العمود كميات رد فعل حلقة. هذا التحليلوقد أجريت مع تكوين مرحلة المحمول من 94٪ الميثانول و 6٪ من المياه الملة-Q. وكان معدل تدفق الطور المتحرك 1 مل / دقيقة، وكان حجم حقن 20 ميكرولتر وكان الطول الموجي تحليل 265 نانومتر. أدرجت لفائف من مختلف أحجام الميتة من 20 ميكرولتر إلى 1000 ميكرولتر بين العمود وكاشف لمحاكاة آثار رد فعل حلقة حجم القتلى في أساليب PCD. تم إعداد هذه الحلقات من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها الداخلي 0.5 ملم. تم إجراء تجربة على نظام HPLC تتكون من وحدة تحكم (SCL-10AVP)، وانخفاض ضغط متدرجة صمام (FCL-10ALVP)، مضخة (LC-20AD)، والحاقن (SIL-10ADVP)، وكاشف المساعد الشخصي الرقمي ( SPD-M10ADVP). تم ضخ الطور المتحرك من خلال الغاز الراحل قبل إدخالها في نظام HPLC. تم إجراء فصل باستخدام س 4.6 ملم معرف 5 ميكرون العمود 250 ملم. وقد تم اختيار الظروف التجريبية لتكون نموذجية من ردود الفعل PCD أن تم مؤخرا نشرت في الأدب.

الأبسط، ويطلق آخر الأكثر شيوعا الإعداد مفاعل العمود مفاعل أنبوبي غير مجزأة والتي هي بالفعل طويلة، أنبوب رفيع من خلالها السائل يمكن أن تتدفق ورد فعل يمكن أن يحدث. في هذه الذروة نظام توسيع يعتمد على ليس فقط حجم القتلى إضافتها إلى النظام، ولكن أيضا القطر الداخلي للأنبوب نحو ما أبرزته إيجيما وآخرون. ^8. وعلاوة على ذلك، لفائف الهندسة تلعب دورا في توسيع العلامة التجارية لوحظ. ستيوارت ²⁰ ذكر أن اللف المفاعل يغير ملامح تدفق الثانوية، مما أدى إلى أفضل خلط، وهذا يعني أن حجم القتلى قد يكون الحد الأدنى. وقد ذكر أن ذروة توسيع ليس كبيرا عند استخدام أنبوبي مفتوحة محبوك لفائف ^21. عندما ذروة توسيع هو كبير جدا، ويمكن أيضا اعتبار أنواع أخرى من المفاعلات ^20،22. ويمكن أن تشمل هذه المفاعلات السرير أو مفاعلات تدفق مجزأة. هذه المفاعلات هي مفيدة بشكل خاص لردود الفعل البطيئة التي من شأنها أن اشتراطات غير ذلكحلقات رد فعل ه كبير. كما المفاعلات الأنبوبية غير مجزأة هي الأنواع الأكثر شيوعا من المفاعلات المستخدمة في التطبيقات PCD، والباقي من هذه الصفقات المادة مع هذا النوع من الإعداد المفاعل.

تصميم العمود تدفق رد فعل (RF) يشتمل على نهاية المناسب متعددة المنفذ الذي يسمح الطور المتحرك للخروج (أو دخول) العمود إما من خلال منفذ واحد يقع في المنطقة المركزية الشعاعية للعمود أو ثلاثة الموانئ الواقعة على الخارجي منطقة جدار العمود (انظر الشكل 3). يتم فصل هذين التيارين باستخدام المناسب نهاية تحتوي على فريت التي يسهل اختراقها المركزي الذي تحيط به حلقة كتيمة التي هي بدورها محاطة فريت التي يسهل اختراقها الخارجي الذي يمتد إلى جدار العمود. بسبب تدفق حلقة عبر المركزي كتيمة غير ممكن بين المناطق التي يسهل اختراقها اثنين.

خلال رد فعل اللوني التدفق، وضخ كاشف اشتقاق (ق) ضد اتجاه تدفق مرحلة المحمول إلى واحد أو TWس من الموانئ الخارجية للعمود تدفق رد فعل. يتم خلط شاطف عمود مع كاشف اشتقاق (ق) في فريت الخارجي وتمريرها إلى كشف من خلال منفذ خارجي خال. يمكن استخدام تدفق رد فعل إما لاشتقاق كاشف واحد (1 منفذ للكاشف اشتقاق، 1 منفذ لتمرير شاطف العمود إلى كشف و 1 منفذ سدت) أو نظام كاشف المزدوج (2 الموانئ لالكواشف اشتقاق و 1 منفذ ل تمرير شاطف العمود إلى كاشف). إما أن تدفق من التيار المركزي أن تستخدم للكشف عن شاطف العمود underivatized وفعالية الكشف عن الإرسال المتعدد ^23، أو تمريرها إلى النفايات.

أسلوب واحد ضبط الرئيسية المتوفرة عند تشغيل RF-PCD اللوني هو نسبة التدفقات المركزية والطرفية. النسبة المثلى لكل اشتقاق يعتمد على عدد من العوامل مثل ما إذا كان سيتم الكشف عن تدفق المركزي أو تمريرها إلى النفايات. لذلك مرة واحدة وقد تم تحديد النسبة المثلىيجب التأكد من أن نسبة تدفق الصحيحة يتحقق قبل كل تشغيل التي يتم تنفيذها.

وقد وجد أن استخدام فريت لخلط تيار العمود شاطف وكاشف اشتقاق في نتائج RF-PCD في خلط أكثر كفاءة مقارنة مع تقنيات خلط التقليدية التي عادة ما تستخدم صفر حجم القتلى T-قطعة أو حجم القتلى منخفض W- قطعة لمزيج من التيارين. وقد سمح ذلك لاستخدام الحلقات رد فعل صغيرة نسبيا، أو حتى القضاء على حلقة رد فعل تماما. الحد من نتائج رد الفعل حجم حلقة في قمم أكثر وضوحا بالمقارنة مع الطرق التقليدية اشتقاق آخر عمود. وهذا يعني أنه على الرغم من حقيقة أن ليس كل من شاطف عمود وderivatized، لوحظ أكبر إشارة إلى نسب الضوضاء وحدود وبالتالي أقل الكشف والكميات لا يمكن أن يتحقق.

وقد وضعت تدفق رد فعل اللوني للتغلب على الصعوبات مع التكيف من رد فعل PCD الصورة الأعمدة الحديثة HPLC والأنظمة، لا سيما الخسارة في الكفاءة الناجمة عن الفرقة توسيع بسبب آخر عمود كميات كبيرة ميتة الناجمة عن الحاجة إلى توظيف رد الفعل حجم كبير حلقات. عمليات خلط أكثر كفاءة في RF-PCD مقارنة PCD التقليدي يعني أن أحجام التداول حلقة رد فعل أصغر قد تكون عاملة مما يؤدي إلى زيادة في كفاءة الفصل المرصودة. وعلاوة على ذلك يظهر RF-PCD اللوني على حد سواء زيادة إشارة وانخفاض الضوضاء بالمقارنة مع التقنيات التقليدية PCD مما أدى إلى الحدود الدنيا من الكشف والكميات بالمقارنة مع الطرق التقليدية PCD. ميزة إضافية لRF-PCD بالمقارنة مع الطرق التقليدية PCD هي القدرة على رصد تيار underivatized أن elutes من الميناء الرئيسي للعمود RF فضلا عن تيار derivatized أن elutes من المنطقة الطرفية من العمود. RF-PCD هي تقنية جديدة نسبيا ولكنها واعدة أن يعرض مزايا عديدة أكثر من الطرق التقليدية PCD.

> ويتحقق اتصال العمود RF في تقريبا بنفس طريقة عمود HPLC التقليدية مع فارق كبير يجري عدد من التجهيزات نهاية على عمود RF. التجهيزات المستخدمة لربط عمود HPLC القياسية لنظام HPLC هي قادرة على أن تستخدم لربط عمود الترددات اللاسلكية لنظام HPLC.

Protocol

تنبيه: يرجى الرجوع إلى بيانات سلامة المواد (MSDS) لجميع المواد والكواشف قبل الاستخدام (أي، MSDS من الميثانول). ضمان استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند التعامل مع المذيبات وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) شاطف. ضمان الاستخدام الملائم للضوابط هندسية من HPLC والتحليلية التوازن وكشف عن الأجهزة، وضمان استخدام معدات الوقاية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، كامل طول السراويل، وأحذية مغلقة اصبع القدم).

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول 3 طرق تدفق رد فعل آخر عمود اشتقاق (RF-PCD) تقنيات، مع كل كاشف مختلفة محددة لطبيعة مركب كيميائي من الفائدة. لتحليل ROS انتقل إلى قسم "1. الكشف عن ROS باستخدام DPPH ^•"، لتحليل الأمينات الأولية انظر القسم "2. الكشف عن الأمينات الأولية باستخدام fluorescamine"، ولتحليل المركبات الفينولية انتقل إلى قسم "3 . الكشف عن الفينولاتباستخدام 4-aminoantipyrene وفيري سيانيد البوتاسيوم ". استخدام مياه نقي للغاية (على سبيل المثال، ميلي-Q المياه) في جميع أنحاء.

ملاحظة: يتم تحقيق اتصال العمود RF في تقريبا بنفس طريقة عمود HPLC التقليدية مع فارق كبير يجري عدد من التجهيزات نهاية على عمود RF. التجهيزات المستخدمة لربط عمود HPLC القياسية لنظام HPLC هي قادرة على أن تستخدم لربط عمود الترددات اللاسلكية لنظام HPLC.

1. الكشف عن ROS باستخدام DPPH ^•

1. إعداد صك HPLC
   1. إعداد الصك HPLC بالماء٪ 100 على خط والميثانول٪ 100 على خط B كما الطور المتحرك. تطهير المضخات وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
   2. إعداد مكونات مفيدة HPLC ومضخة اشتقاق إضافية كما هو موضح في الشكل رقم 4A.
   3. تعيين كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس لتحليل عند طول موجي 520 نانومتر.
2. إعداد لالعمود RF
   1. ربط مدخل العمود RF في الصك HPLC.
   2. توصيل طول 15 سم من 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء منفذ المركزي للعمود RF.
   3. قم بتوصيل منفذ الطرفية منفذ للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام طول 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
   4. ربط DPPH ^• خط ضخ إلى منفذ الطرفية على منفذ العمود RF.
   5. منع ميناء الطرفية غير المستخدمة على منفذ العمود RF باستخدام سدادة العمود.
   6. جعل معدل تدفق المضخة HPLC إلى 1 مل دقيقة ^-1 في 100٪ خط B - 100٪ الميثانول.
   7. تتوازن العمود مع الطور المتحرك الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقيقة للحصول على 4.6 ملم معرف × 100 عمود طول مم. يجب تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
3. إعداد DPPH ^• كاشف
   1. إعداد محلول / مل 0.1 ملغ من DPPH ^• في الميثانول.
   2. يصوتن القارورة التي تحتوي على DPPH ^• كاشف لمدة 10 دقيقة.
   3. تغطية قارورة في احباط لمنع التعرض للضوء.
   4. تطهير DPPH ^• مضخة مع استعداد DPPH ^• كاشف وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
4. ضبط العمود مخرج RF
   1. بدقة تزن سفينتين نظيفة وجافة. تسمية سفينة واحدة مركزية وأخرى هامشية.
   2. جمع النفايات السائلة التي تخرج من ميناء المركزي في الإناء المسمى المركزية ل 1.0 دقيقة.
   3. إعادة تزن السفينة ميناء المركزية وحساب وزن التدفق من ميناء المركزي على النحو التالي:
      الوزن من ميناء الوسطى (ز) = الوزن النهائي من ميناء الوسطى سفينة (ز) - الوزن الأولي من ميناء الوسطى سفينة (ز)
   4. كرر الخطوات من 1.4.2 و 1.4.3 لمياه الصرف الصحي التي تخرج من الأشعة فوق البنفسجية فيس التي يتم تركيبها إلى ميناء الطرفية العمود الترددات اللاسلكية وحساب الوزن للسفينة ميناء الطرفية والتالي:
      الوزن من ميناء الطرفية (ز) = الوزن النهائي من ميناء الطرفية السفينة (ز) - الوزن الأولي من ميناء الطرفية السفينة (ز)
   5. حساب نسبة تدفق القادمة من موانئ المركزية والطرفية كما يلي:
      ٪ المركزي ميناء = الوزن من ميناء الوسطى (ز) / (وزن ميناء الوسطى (ز) + وزن الطرفية ميناء (ز)) × 100
      ٪ الطرفية ميناء = الوزن من ميناء الطرفية (ز) / (وزن ميناء الوسطى (ز) + وزن الطرفية ميناء (ز)) × 100
   6. ضمان نسبة تجزئة بين تدفق المركزي وتدفق المحيطي هو 30:70 (المركزي: الطرفية). إذا كان تدفق المركزي هو فوق 30٪، وانخفاض كمية تدفق الخروج بإضافة بطول 0.13 ملم معرف أنابيب إلى منفذ ميناء المركزي. إذا كان تدفق المركزي هو أقل من 30٪ تخفيض طول 0.13 ملم أنابيب من ميناء المركزي.
   7. كرر الخطوة 1.4.1 إلى 1.4.6 حتى نسبة تجزئة 30:70: ويتحقق (وسط الطرفية).
   8. ضبط معدل تدفق DPPH ^• مضخة كاشف ^ل-1 0.5 مل دقيقة.
      ملاحظة: عمود RF اقامة مع DPPH ^• كاشف هو الآن على استعداد لتحليلها. يمكن الآن حقن عينات.
5. آخر تشغيل شروط الاغلاق
   1. مرة واحدة كل من العينات تم حقنها، مشيرا إلى أن على المدى قد انتهت، ووقف تدفق مضخة اشتقاق كاشف.
   2. إزالة DPPH ^• خط ضخ الكاشف من ميناء الطرفية وسدادة الميناء.
   3. تتوازن العمود مع الطور المتحرك الذي يجب ان يكون لتخزينها عن طريق السماح للمرحلة النقالة بالمرور عبر العمود في 1 مل دقيقة ^-1 لمدة 10 دقيقة.
   4. وقف تدفق المضخة الطور المتحرك على الصك HPLC.
   5. استبدال DPPH ^• كاشف مع الميثانول وتطهير مضخة إضافية.
      ملاحظة: نظام HPLC يمكن أن يكون الآن الاغلاق.

2. الكشف عن الأمينات الأولية عن طريق Fluorescأمين

1. إعداد الطور المتحرك
   1. إعداد 1 لتر من 10 ملي حل خلات الأمونيوم، وضبط درجة الحموضة من الحل إلى 9.0 مع 5 هيدروكسيد الأمونيوم M قبل التخفيف إلى وحدة تخزين.
   2. إضافة 52.6 مل من الأسيتونتريل (إيه سي) إلى المخزن المؤقت خلات الأمونيوم لبلوغ مرحلة الجوالة خلط من 95:05 (المخزن المؤقت: ACN).
2. إعداد صك HPLC
   1. إعداد الصك HPLC مع العازلة استعداد قبل مختلطة على خط كمرحلة النقالة. تطهير مضخة وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
   2. إعداد مكونات مفيدة HPLC ومضخة اشتقاق إضافية كما هو موضح في الشكل رقم 4A.
   3. إرفاق ملف نبض يستمتع إلى المضخة اشتقاق.
   4. انشاء كاشف مضان (الكبد الدهني) مع الطول الموجي الإثارة من 390 نانومتر الطول الموجي وانبعاث 475 نانومتر.
3. إعداد العمود RF
   1. ربط الالبريد مدخل العمود RF في الصك HPLC.
   2. توصيل طول 15 سم من 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء منفذ المركزي للعمود RF.
   3. قم بتوصيل منفذ الطرفية منفذ العمود الترددات اللاسلكية لكشف الكبد الدهني باستخدام طول 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
   4. ربط خط ضخ اشتقاق إلى منفذ الطرفية على منفذ العمود RF.
   5. منع ميناء الطرفية غير المستخدمة على منفذ العمود RF باستخدام سدادة العمود.
   6. جعل معدل تدفق المضخة HPLC إلى 1 مل دقيقة ^-1 في 100٪ ألف خط - 10 ملي الأمونيوم خلات درجة الحموضة عازلة 9، خلط مع 5٪ ACN.
   7. تتوازن العمود مع خط المرحلة أ النقالة 100٪ لمدة 10 دقيقة للحصول على 4.6 ملم معرف × 100 عمود طول مم. يمكن تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
4. إعداد كاشف fluorescamine
   1. جعل 100 مل من 0.1 ملغ مل ^-1 fluorescamine كاشف.
   <لى> يصوتن لمدة 1 دقيقة.
   2. مع تغطية احباط لمنع التعرض للضوء.
   3. تطهير مضخة كاشف مع كاشف fluorescamine استعداد وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
5. ضبط العمود مخرج RF
   1. بدقة تزن سفينتين نظيفة وجافة. تسمية سفينة واحدة مركزية وأخرى هامشية.
   2. جمع النفايات السائلة التي تخرج من ميناء المركزي في الإناء المسمى المركزية ل 1.0 دقيقة.
   3. إعادة تزن السفينة المركزية وحساب وزن التدفق من ميناء المركزي على النحو التالي في الخطوة 1.4.3.
   4. كرر الخطوات من 2.5.2 إلى 2.5.3 لمياه الصرف الصحي التي تخرج من الكبد الدهني التي يتم تركيبها إلى ميناء الطرفية العمود الترددات اللاسلكية وحساب الوزن لالطرفية على النحو التالي في الخطوة 1.4.4.
   5. حساب نسبة تدفق القادمة من موانئ المركزية والطرفية على النحو التالي في الخطوة 1.4.5.
   6. ضمان نسبة تجزئة بين تدفق المركزي والطرفيالتدفق 43:57 (المركزي: الطرفية). إذا كان تدفق المركزي هو فوق 43٪، وانخفاض كمية تدفق الخروج بإضافة بطول 0.13 ملم معرف أنابيب إلى منفذ ميناء المركزي. إذا كان تدفق المركزي أقل من 43٪، وتقليل طول 0.13 ملم أنابيب من ميناء المركزي.
   7. كرر الخطوة 2.5.1 إلى 2.5.6 حتى نسبة تجزئة 43:57: ويتحقق (وسط الطرفية).
   8. ضبط معدل تدفق المضخة الطور المتحرك إلى 0.7 مل دقيقة ^-1.
   9. ضبط مضخة اشتقاق في التدفق في 0.1 مل دقيقة ^-1.
      ملاحظة: عمود RF اقامة مع كاشف fluorescamine هو الآن على استعداد لتحليلها. يمكن الآن حقن عينات.
6. آخر تشغيل شروط الاغلاق
   1. مرة واحدة كل من العينات تم حقنها، مشيرا إلى أن على المدى قد انتهت، ووقف ضخ اشتقاق.
   2. إزالة السطر مضخة اشتقاق من ميناء الطرفية وسدادة.
   3. تتوازن العمود مع الطور المتحرك فيالتي هي ليتم تخزينها من خلال السماح للمرحلة النقالة بالمرور عبر العمود في 1 مل دقيقة ^-1 لمدة 10 دقيقة.
   4. وقف تدفق المضخة الطور المتحرك.
   5. استبدال كاشف fluorescamine مع الأسيتونتريل وتطهير مضخة اشتقاق.
      ملاحظة: نظام HPLC يمكن أن يكون الآن الاغلاق.

3. الكشف عن الفينولات باستخدام 4-Aminoantipyrene والبوتاسيوم فيري سيانيد

1. إعداد الطور المتحرك
   1. إعداد 1 لتر من 100 ملي حل خلات الأمونيوم، وضبط درجة الحموضة من الحل إلى 9.0 مع 5 هيدروكسيد الأمونيوم M قبل التخفيف إلى وحدة تخزين.
   2. إضافة 52.6 مل من الميثانول إلى المخزن المؤقت خلات الأمونيوم لبلوغ مرحلة الجوالة خلط من 95: 5 (المخزن المؤقت: الميثانول).
2. إعداد صك HPLC
   1. إعداد الصك HPLC مع العازلة استعداد قبل مختلطة على خط كمرحلة النقالة. تطهير مضخة حسب الشركة المصنعة؛ ق المتطلبات.
   2. إعداد مكونات مفيدة HPLC واثنين من مضخات كاشف إضافية كما هو موضح في الشكل رقم 4B.
   3. إرفاق ملف نبض يستمتع كل من المضخات كاشف.
   4. تعيين كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس لتحليل عند طول موجي 500 نانومتر.
3. إعداد العمود RF
   1. ربط مدخل العمود RF في الصك HPLC.
   2. توصيل طول 15 سم من 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء منفذ المركزي للعمود RF.
   3. قم بتوصيل منفذ الطرفية منفذ العمود الترددات اللاسلكية لكشف أشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام طول 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
   4. ربط كل كاشف (أي 4 aminoantipyrene وفيري سيانيد البوتاسيوم) خط ضخ إلى منفذ الطرفية على منفذ العمود RF.
   5. جعل معدل تدفق المضخة HPLC إلى 1 مل دقيقة ^-1 في 100٪ ألف خط - 100 ملي الأمونيوم خلات درجة الحموضة عازلة 9، خلط مع 5٪ الميثانول.
   6. تتوازن العمود ثإيث خط الطور المتحرك 100٪ ولمدة 10 دقيقة للحصول على 4.6 ملم معرف × 100 عمود طول مم. يمكن تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
4. إعداد كاشف 4 aminoantipyrene
   1. إعداد العازلة خلات الأمونيوم مع الرقم الهيدروجيني من 9 باتباع الخطوة 3.1.1.
   2. تزن 150 ملغ 4 aminoantipyrene وتذوب في 100 مل من استعداد عازلة خلات الأمونيوم (الرقم الهيدروجيني 9).
   3. يصوتن لمدة 1 دقيقة.
   4. مع تغطية احباط لمنع التعرض للضوء.
   5. تطهير أول مضخة كاشف مع استعداد كاشف 4 aminoantipyrene وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
5. إعداد البوتاسيوم فيري سيانيد كاشف
   1. تزن 150 ملغ من فيري سيانيد البوتاسيوم وتذوب في 100 مل من العازلة خلات الأمونيوم (الرقم الهيدروجيني 9) التي أعدت وفقا للخطوة 3.1.1.
   2. يصوتن لمدة 1 دقيقة.
   3. تغطية في احباط لمنع التعرض للضوء.
   4. Purgالبريد مضخة كاشف الثانية مع استعداد كاشف فيري سيانيد البوتاسيوم وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
6. ضبط العمود RF
   1. بدقة تزن سفينتين نظيفة وجافة. تسمية سفينة واحدة مركزية وأخرى هامشية.
   2. جمع النفايات السائلة التي تخرج من ميناء المركزي في الإناء المسمى المركزية ل 1.0 دقيقة.
   3. إعادة تزن السفينة المركزية وحساب وزن التدفق من ميناء المركزي على النحو التالي في الخطوة 1.4.3.
   4. كرر الخطوات من 3.6.2 إلى 3.6.3 لمياه الصرف الصحي التي تخرج من الأشعة فوق البنفسجية فيس التي يتم تركيبها إلى ميناء الطرفية العمود الترددات اللاسلكية وحساب الوزن لالطرفية على النحو التالي في الخطوة 1.4.4.
   5. حساب نسبة تدفق القادمة من موانئ المركزية والطرفية على النحو التالي في الخطوة 1.4.5.
   6. ضمان نسبة تجزئة بين تدفق المركزي وتدفق المحيطي هو 50:50 (المركزي: الطرفية). إذا كان تدفق المركزي هو فوق 50٪، وانخفاضكمية تدفق الخروج بإضافة بطول 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء المركزي منفذ. إذا كان تدفق المركزي هو أقل من 50٪، وتقليل طول 0.13 ملم أنابيب من ميناء المركزي.
   7. كرر الخطوة 3.6.1 إلى 3.6.6 حتى نسبة تجزئة 50:50: ويتحقق (وسط الطرفية).
   8. ضبط معدل تدفق المضخة 4 aminoantipyrene إلى 0.5 مل دقيقة ^-1.
   9. ضبط معدل تدفق المضخة فيري سيانيد البوتاسيوم و 0.25 مل دقيقة ^-1.
      ملاحظة: عمود RF اقامة مع الكواشف اثنين من عناصر جاهز الآن للتحليل. يمكن الآن حقن عينات.
7. آخر تشغيل شروط الاغلاق
   1. مرة واحدة كل من العينات تم حقنها على المدى قد انتهت، مشيرا إلى أن على المدى قد انتهت، ووقف كل من المضخات كاشف.
   2. إزالة خطوط ضخ الكاشف من الموانئ الطرفية واستبدالها مع 15 سم قطعة من 0.13 ملم أنابيب.
   3. تتوازن العمود مع الطور المتحرك في مبادرة الخوذ البيضاءالفصل هو ليتم تخزينها من خلال السماح للمرحلة النقالة بالمرور عبر العمود في 1 مل دقيقة ^-1 لمدة 10 دقيقة.
   4. وقف تدفق المضخة الطور المتحرك على الصك HPLC.
   5. استبدال كل من الكواشف على كاشف مضخات مع الميثانول وتطهير مضخات إضافية وفقا لمتطلبات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: نظام HPLC يمكن أن يكون الآن الاغلاق.

Results

كانت الطريقة PCD الأولى التي تم تكييفها للاستخدام من قبل RF-PCD في اشتقاق من المواد المضادة للاكسدة باستخدام 2،2-ثنائي-1-picrylhydrazil الراديكالي (DPPH ^{•) 24.} وقدم هذا رد فعل من جانب Koleva وآخرون. ²⁵ واستخدمت على نطاق واسع منذ ذلك الحين. يعتمد الكشف على إزالة اللون من DPPH ^و• جذري في وجود أنواع الاكسجين التفاعلية، وبالتالي وجود نتائج المواد المضادة للاكسدة في انخفاض الامتصاصية لوحظ. وDPPH ^• رد فعل في كثير من الأحيان...

Discussion

RF-PCD يسمح لخلط الفعال للكاشف اشتقاق مع النفايات السائلة بعد عمود HPLC دون استخدام لفائف رد فعل، والتقليل من آثار توسيع نطاق وتحسين أداء الانفصال. وقد أظهرت أساليب RF-PCD أيضا التحسينات في الاستجابة إشارة فيما يتعلق طريقة الكشف. كان Camenzuli وآخرون. ²⁸ أول من أشار إلى استخدام الأعمدة تدفق رد فعل مع DPPH ^• للكشف عن ROS في عينة صنع قهوة اسبريسو. وشملت الدراسة تحليل وتحسين ظروف الترددات اللاسلكية لتحقيق أقصى قدر من الأداء، واختبار مجموعة من DPPH ^...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
أداة HPLC	Agilent	1290 Series HPLC
مضخات (مضخات) إضافية لنظام الاشتقاق	Shimadzu	LC-20A
RF colum			أنابيب نظرة خاطفة غير تجارية
	Sigma Aldrich	Z227307
سدادات			مزودة
بقاطع أنبوب PEEK	Sigma Aldrich	Z290882
ميزان الميزان التحليلي			4 نقاط الميزان التحليلي
ساعة			غير العلمية
قوارير جمع المواد أي			قارورة صغيرة ذات قاع مسطح ستفي بالغرض ، على سبيل المثال < / em> ، قوارير HPLC
قوارير			على الأداة المستخدمة
أوعية لحلول (حلول) المرحلة المتنقلة والاشتقاق	سيجما ألدريتش	Z232211
الأواني			قوارير حجمية ، ماصات ، <م >وما إلى ذلك < / em> تعتمد الكمية والأحجام على طريقة تحضير العينة.
الميثانول	سيجما ألدريتش	34860
DPPH	سيجما ألدريتش	D9132
أسيتات الأمونيوم	سيجما ألدريتش	17836
الأمونيا	سيجما ألدريتش	320145	أكالة
أسيتونيتريل	سيجما ألدريتش	34998
فلوريسكامين	سيجما ألدريتش	F9015
4- أمينوأنتيبيرين	أكروس أورجانيكس BVBA	AC103151000
فيريسيانيد البوتاسيوم	أنالار	B10204-30