الستار العمود تدفق: تحسين الكفاءة والحساسية

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا لتشغيل وتحسين عمود تقنية التدفق النشط (AFT) في وضع تدفق الستارة (CF) لتحسين أداء الفصل.

الملخص

< p class = 'jove_content'> تقنية التدفق النشط (AFT) هي شكل من أشكال تقنية الأعمدة التي تزيد من أداء الفصل لعمود HPLC من خلال استخدام تركيبات (تركيبات) طرفية متعددة المنافذ مصممة خصيصا لغرض خاص. تنتمي أعمدة تدفق الستارة (CF) إلى مجموعة أعمدة AFT ، وتحديدا تم تصميم عمود CF بحيث يتم حقن العينة في المنطقة المركزية الشعاعية للسرير ويمنع تدفق الستارة للطور المتحرك المحيط بحقن المذاب التشتت الشعاعي للعينة على الحائط. يعمل العمود كعمود "قطر لا نهائي". الغرض من التصميم هو التغلب على عدم التجانس الشعاعي لسرير العمود ، وفي نفس الوقت تعظيم حمل العينة إلى المنطقة المركزية الشعاعية لطبقة العمود ، مما يعمل على زيادة حساسية الكشف. يحدد البروتوكول الموضح هنا إعداد النظام وعمود CF وعملية الضبط لعمود "افتراضي" بقطر لانهائي محسن.

المقدمة

في السنوات الأخيرة، التكنولوجيا المتقدمة العمود عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) إلى حد كبير؛ زادت قدرات الذروة إلى حد كبير إلى حد كبير بفضل استخدام أحجام الجسيمات الأصغر حجما وأكثر كفاءة الجسيمات الأساسية قذيفة. منذ الانفصال عادة ما تكون أكثر كفاءة، وقد تدفق على أثر زيادة في حساسية منذ القمم هي الآن أكثر وضوحا، وبالتالي اطول ^1-8.

ومع ذلك، عدم التجانس السرير شعاعي لا يزال عاملا مقيدا في أداء جميع الأعمدة، ولكن هذه ليست قصة جديدة منذ chromatographers ويعرف هذا لسنوات عديدة. سرير عمود غير متجانسة في كل من الاتجاه شعاعي ^12/09، وعلى طول العمود محور ^10،12-15. للتأثير الجدار خصوصا ومساهما هاما في فقدان ^7،16-18 أداء الانفصال. Shalliker وريتشي ⁷ استعرضت مؤخرا جوانب عدم التجانس عمود السرير وبالتالي هذا لا يلزم أن يكون discusseد هنا أبعد من ذلك. على الرغم من أن يكفي القول، أن الاختلاف في العمود كثافة السرير التعبئة والتغليف وآثار جدار يؤدي إلى تشويه المكونات المذاب، ان هذه العصابات أزل من خلال العمود في المقابس، وتماثل مملوءة جزئيا الحساء الأطباق بدلا من رقيقة أقراص صلبة مسطحة ⁷ التي هي يصور عادة في النصوص التعليمية الأساسية. عندما أجريت تجارب من هذا القبيل أن الهجرة المذاب من خلال السرير يمكن تصور كانت لمحات المكونات داخل العمود جوفاء جزئيا وقسم المخلفات في الفرقة هو إلى حد كبير مكون جدار المكونات العينة. والنتيجة النهائية هي أنه يأخذ الكثير من لوحات لفصل هذه المقابس "جوفاء جزئيا" من شأنه أن يكون مطلوبا إذا كانت أقراص صلبة ومسطحة ^12،14،17. للتغلب على الفرقة توسيع القضايا المرتبطة آثار الجدار والاختلاف في كثافة التعبئة شعاعي، وقد تم تصميم شكل جديد من التكنولوجيا العمود المعروفة باسم النشطين تقنية التدفق (AFT) ^7،19. وكان الهدف من هذا التصميملإزالة آثار الجدار من خلال الفصل المادي بين يبلغ حجمه المذيبات على طول منطقة الجدار، من أن من الطور المتحرك يبلغ حجمه في المنطقة الوسطى شعاعي العمود ^19. هناك نوعان رئيسيان من الأعمدة AFT. موازية مقطع التدفق (PSF) الأعمدة والستار تدفق (CF) أعمدة ^7. منذ يهدف هذا البروتوكول في استخدام والاستفادة المثلى من الأعمدة CF، لن يتم مواصلة مناقشة الأعمدة قوات الأمن الفلسطينية.

الستار تدفق (CF)

الستار تدفق (CF) صيغ العمود الاستفادة AFT-التجهيزات نهاية في كل من مدخل ومخرج العمود. تتكون AFT نهاية التجهيزات لفريت الحلقي تقع داخل تركيب متعدد المنافذ. ويتكون فريت تتكون من ثلاثة أجزاء: الجزء المركزي شعاعي يسهل اختراقها والتي تتماشى مع الميناء الرئيسي للنهاية المناسب، وهو الجزء الخارجي يسهل اختراقها والتي تتماشى مع ميناء الطرفية (ق) من نهاية مناسبة، وحلقة كتيمة أن يفصل بين الأجزاء التي يسهل اختراقها منع أي عبر-flow بين المنطقتين الوسطى والخارجية شعاعي للفريت ¹⁹ الشكل 1 يوضح تصميم فريت الخلف ويوضح الشكل 2 الشكل العمود CF. في هذا النمط من العمليات (CF) يتم حقن العينة إلى ميناء المركزي شعاعي من مدخل المناسب، في حين يتم إدخال الطور المتحرك إضافية عن طريق ميناء الطرفية من مدخل إلى 'ستار' هجرة المواد المذابة من خلال المنطقة الوسطى شعاعي لل عمود. ومن هنا يدخل عينة السرير في المنطقة الوسطى الشعاعية للعمود مع المنطقة الخارجية للعمود وجود الطور المتحرك مرت فقط من خلال ذلك. وقد أظهرت الدراسات أن نسبة حجمية معدل تدفق حوالي 40:60 (وسط: منفذ الطرفية) لمدخل نهاية تركيب عمود 4.6 مم القطر الداخلي (معرف) هو ^6،7،16 الأمثل. منفذ الخلف العمود CF يسمح تعديل تدفق المركزي والمحيطي لجزء نسبي ويمكن أن تختلف إلى ما يقرب من أي راتي المطلوبس من خلال إدارة الضغوط. الاستفادة المثلى من عمود CF يمكن أن تحسن بشكل كبير الجوانب الفنية المختلفة للتكنولوجيا العمود، مثل كفاءة الفصل أو حساسية الكشف. في هذه الطريقة يتم تأسيس "الجدار أقل '،' لا حصر له القطر" أو عمود "الظاهري" ^{6،10،18،20.} والغرض من الأعمدة CF هو إدارة بنشاط في الهجرة من العينة من خلال العمود لمنع عينة من الوصول إلى منطقة الجدار. وبالتالي، يتم تكبير تركيز المذاب عند الخروج إلى كشف، وزيادة حساسية أكبر نحو 2.5 مرة من شكل العمود التقليدي عند استخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) كشف ^16، وحتى أكبر عند استخدام الكشف الطيفي الشامل ^6.

هي مناسبة الأعمدة CF مثالي لعينات التركيز المنخفض، حيث تزداد حساسية الكشف. وعلاوة على ذلك، فهي مثالية عندما يقترن إلى معدل التدفق للكشف عن محدودة، مثل مطياف الكتلة (MS) ^6. [أالعمود FT في شكل معرف 4.6 مم، على سبيل المثال يمكن ضبطها لتقديم نفس الحجم من المذيب لكشف باعتباره 2.1 ملم عمود شكل معيار الهوية عندما كانت تعمل في نفس السرعات الخطية، من خلال تعديل الخروج تدفق المركزي إلى 21٪. وبالمثل العمود الخلف كما يمكن ضبطها لتسليم نفسه تحميل الصوت إلى جهاز الكشف عن كعمود معرف 3.0 ملم، من خلال تعديل الخروج تدفق المركزي إلى 43٪. في الواقع يمكن أن تنتج أي شكل عمود "التقديرية" لتتناسب مع متطلبات التحليلي ^6،18،22. باستخدام هذه نهاية التجهيزات المصممة خصيصا في مدخل ومخرج يضمن أن يتم إنشاء عمود صحيح الجدار أقل.

هناك طريقتان لإعداد نظام تسليم المذيبات إلى موانئ المركزية والطرفية للمدخل: نظام تقسيم تدفق ⁶ واثنين من ^6،7 نظام مضخة الشكل 3 يوضح كل من هذه المجموعة المنبثقة نظام CF.

نظام تقسيم التدفق

أناغ نظام تقسيم التدفق (الشكل 3A) تدفق المضخة مما يؤدي إلى حاقن منقسمون ما قبل حاقن باستخدام ميت الصفر حجم T-قطعة، حيث يتم توصيل تيار تدفق واحد من الطور المتحرك لحاقن، وهو بعد ذلك متصلا ميناء المركزي للمدخل نهاية تركيب العمود. تيار تدفق الثاني من المرحلة المتنقلة، يمر حاقن ويرتبط إلى ميناء الطرفية على مدخل العمود. خلال تقسيم التدفق، ويتم تعديل نسبة تدفق تدفق إلى 40:60 (مركز: الطرفية) قبل أن يتم توصيل خطوط العمود، أي من حاقن لمركز ومضخة لالطرفية.

نظام ثنائي مضخة

يتطلب العمود CF تيارين التدفق في مدخل نهاية تركيب العمود. اعتمادا على نوع من الاوتوماتيكى / حاقن للHPLC أداة، وانقسام تدفق اقامة قد لا يكون من الممكن، وهكذا CF ويمكن بعد ذلك أن يتحقق من خلال 2 مضخات (الشكل 3B ²¹⁾. يخصص لكل مضخة وتوصيلها الى ميناء المركزي أو الطرفي ويتم تعيين معدل التدفق لتمثيل 40٪ من تدفق لميناء المركزي و 60٪ لميناء الطرفية. على سبيل المثال، إذا كان معدل تدفق 1.0 مل دقيقة ^-1، يتم تعيين معدل تدفق ضخ المركزي إلى 0.4 مل دقيقة ^-1 ويتم تعيين مضخة الطرفية إلى 0.6 مل دقيقة ^-1.

واختيار أي طريقة عملها يعتمد إلى حد كبير على أجهزة HPLC ووضع الكروماتوغرافي من العملية. على سبيل المثال في بعض autosamplers تغيير في الضغط بين عينة موقف الحمل وعينة حقن قد يحدث موقف تعطيل نسبة الانقسام التدفق وبالتالي في هذه الحالة مضخة مزدوجة انشاء أن يكون الموصى بها لأداء CF الأمثل. بغض النظر عن نظام تسليم المذيبات اقامة المختار للمدخل العمود CF، ومنفذ الأمثل CF لا يزال هو نفسه. ويرد ميناء المركزي منفذ العمود CF إلى كاشف الأشعة فوق البنفسجية-مرئي (أشعة فوق البنفسجية فيس) مع األصغرخشية أن حجم ممكن من الأنابيب للحد من آثار ما بعد العمود حجم القتلى. منذ ذلك الحين، أعمدة CF محاكاة أعمدة ضيقة الجوف، حجم القتلى بين منفذ عمود وكاشف هو ضار لأداء فصل العمود CF. فمن الأهمية بمكان لضمان أقل قدر من حجم أنابيب بين ميناء المركزي وكاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس للحد من آثار حجم القتلى مثل توسيع النطاق، وفقدان الكفاءة وحساسية. وبالتالي، ينصح استخدام أنابيب تتحمل الضيق (0.1 ملم معرف) للسماح بسهولة التعديلات الضغط دون إضافة حجم القتلى غير مناسب. ويرد الأنابيب أيضا إلى ميناء الطرفية وإخراج سدى. على منفذ العمود CF، نسبة تجزئة يمكن تعديلها في أي النسبة التي تناسب الغرض من المحللين. عند استخدام معرف CF 4.6 مم، على سبيل المثال، غالبا ما يكون ملائم لتعيين نسبة إما 43:57 أو 21:79 (مركز: الطرفية) لمضاهاة "الظاهري" 3.0 ملم عمود الهوية أو 2.1 ملم عمود الهوية،باحترام. بهذه الطريقة أداء الانفصال بسهولة بعلامات مقاعد البدلاء. يتم قياس نسبة تجزئة وزنها عن طريق كمية تدفق الخروج من الكشف الذي يتم توصيله بمنفذ المركزي وتدفق الخروج من ميناء الطرفية خلال فترة زمنية. تدفق مئوية خلال كل منفذ يمكن بعد ذلك يتم تحديد ونسب يمكن تعديلها عن طريق تغيير طول الأنبوب المرفقة أو باستخدام الأنابيب التي يبلغ قطرها الداخلي مختلفة (معرف).

تفاصيل هذا البروتوكول الفيديو إجراءات عملية والاستغلال الأمثل للعمود CF من أجل تحسين الأداء الكروماتوغرافي.

البروتوكول

تنبيه: يرجى الرجوع إلى بيانات سلامة المواد (MSDS) لجميع المواد والكواشف قبل الاستخدام (أي، MSDS من الميثانول). ضمان استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند التعامل مع المذيبات وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) شاطف. ضمان الاستخدام الملائم للضوابط هندسية من HPLC والتحليلية التوازن وكشف عن الأجهزة، وضمان استخدام معدات الوقاية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، كامل طول السراويل، وأحذية مغلقة اصبع القدم).

ملاحظة: هذا البروتوكول يحتوي على تعليمات حول كيفية استخدام عمود CF على نظام HPLC إلى جانب وجود كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس. لقد كتب البروتوكول على افتراض أن القارئ لديه معرفة الأساسية والخبرة في اللوني.

1. إعداد من HPLC صك

ملاحظة: هذا القسم يمكن تغيير لتتناسب مع احتياجات المحللين، أي اختيار المذيبات، للكشف عن الطول الموجي ومعدل التدفق الذيهي مناسبة لعينة من الفائدة.

1. إعداد الصك HPLC مع 100٪ الماء عالى النقاء (على سبيل المثال، ميلي-Q الماء) لمدة ألف خط والميثانول بنسبة 100٪ لخط B كما الطور المتحرك وتطهير المضخات وفقا لمتطلبات الشركة المصنعة.
2. تعيين كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس إلى 254 نانومتر.
3. اختيار إما قبل حقن وضع تدفق انقسام انشاء، أو مزدوج تدفق مضخة انشاء. لطريقة تقسيم تدفق انتقل إلى الخطوة 2، لوضع مضخة مزدوجة انتقل إلى الخطوة 3.

إعداد النظام 2. تقسيم التدفق

1. قطع خط ضخ من صمام محقن لصناعة السيارات في العينات.
2. إرفاق T-قطعة من خط الضخ.
3. نعلق قطعة 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب إلى كل منفذ من T-قطعة.
4. وربط أنبوب واحد من T-قطعة لحاقن صمام لصناعة السيارات في العينات.
5. ضبط مضخة إلى 1.0 مل دقيقة ^-1.
6. قبل توصيل خطوط مضخة إلى مدخل العمود CF، ضبط نسبة تقسيم تدفق إلى 40٪: 6 0٪ (خط الوسط: خط محيطي) على النحو التالي في الخطوة 2.7.
7. ضبط نسبة مدخل CF على نظام تقسيم التدفق
   1. قياس كتلة سفينتين جمع فارغة باستخدام الميزان التحليلي وتسمية السفينة مجموعة واحدة المركزية وغيرها من واحد المحيطي (واحد للخط من السيارات العينات إلى مركز الميناء واحد للخط من T-قطعة إلى ميناء الطرفية) .
   2. ل1.0 دقيقة، وجمع الطور المتحرك الخروج من خط القادمة من حاقن (في النقطة التي سوف تكون متصلا عمود) في الإناء جمع، التي تم قياسها في 2.7.1 كتلة.
   3. إعادة تزن السفينة المجموعة على نطاق والتحليلي وتحديد كتلة مرحلة النقالة التي تم جمعها.
   4. كرر الخطوات من 2.7.2 إلى 2.7.3 للشاطف الخروج من خط من T-قطعة المراد توصيله بمنفذ الطرفية.
   5. تحديد نسبة تدفق (مل دقيقة ^-1) من كل سطر من تدفق وفقا لمعادلات التالية:
      1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/>
   6. ضبط نسبة تدفق إلى 40٪: 60٪ (± 2٪) (خط من حاقن إلى ميناء المركزي: خط من T-قطعة إلى ميناء الطرفية). إذا كان الخط من حاقن إلى نسبة تدفق الساحلية بوسط فوق 40٪، وزيادة هبوط الضغط عن طريق تقليل القطر الداخلي للأنابيب، أو زيادة طوله. إذا كان الخط من حاقن إلى نسبة تدفق الساحلية بوسط أقل من 40٪، وزيادة القطر الداخلي للأنابيب أو تقليل طول الأنبوب.
   7. مرة واحدة يتم ضبطها نسب تدفق تشغيل المضخة تدفق قبالة.
   8. قم بتوصيل خط من حاقن إلى ميناء المركزي للمدخل عمود وخط من T-قطعة إلى ميناء الطرفية من مدخل عمود.
   9. المنحدر ببطء معدل التدفق إلى 1.0 مل دقيقة ^-1 في 100٪ خط B.
   10. تتوازن العمود (4.6 ملم طول معرف × 100 مم) من خلال السماح لل100٪ ميثانول (خط B) الطور المتحرك بالتدفق من خلال عمود في 1.0 مل دقيقة ^-1 لمدة 10 دقيقة. يتم تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
   11. لضبط للمخرج CF انتقل إلى الخطوة 4. "ضبط تدفق منفذ CF".

الإعداد 3. المزدوج نظام مضخة

1. توصيل مضخة نظام HPLC لحاقن ثم قم بتوصيل خط من حاقن لمدخل الميناء الرئيسي للعمود.
2. توصيل مضخة إضافية مباشرة إلى ميناء الطرفية مدخل العمود. لاحظ أن هذه المضخة الثانية، يمر حاقن.
3. المنحدر معدل تدفق مضخة نظام الملحقة بالميناء المركزي إلى 0.4 مل دقيقة ^-1 (ممثل 40٪ من معدل التدفق الكلي 1.0 مل دقيقة ^-1) في الميثانول٪ 100 (خط B).
4. في نفس الوقت الخطوة 3.3، المنحدر معدل تدفق المضخة المحيطية إلى 0.6 مل دقيقة ^-1 (ممثل 60٪ من معدل التدفق الكلي لل1.0 مل دقيقة ^-1) في الميثانول٪ 100 (خط B).
5. تتوازن العمود (4.6 ملم طول معرف × 100 مم) من خلال السماح للميثانول٪ 100 (خط B) الطور المتحرك في التدفق من خلال عمود في 1.0 مل دقيقة ^-1 لمدة 10 دقيقة. يتم تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
6. لضبط للمخرج CF انتقل إلى الخطوة 4. "ضبط تدفق منفذ CF".

4. ضبط من CF المخرج تدفق

1. ربط ميناء منفذ المركزي للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام قطعة 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
2. ربط قطعة 15 سم من 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء منفذ طرفي العمود CF.
3. تزن كتلة سفينتين جمع فارغة على الميزان التحليلي وتسمية سفينة واحدة مركزية والأخرى هامشية.
4. ل1.0 دقيقة، وجمع الطور المتحرك الخروج من مجسات (تدفق المركزي) أشعة فوق البنفسجية فيس في تسمية السفينة جمع المركزية، التي تم قياسها في 4.2 كتلة.
5. إعادة تزن السفينة مجموعة تحتوي على شاطف التي تم جمعها على نطاق والتحليلي وتحديد كتلة مرحلة النقالة التي تم جمعها.
6. كرر الخطوات من 4،4-4،5 لشاطف الخروج من خط من ميناء منفذ الطرفية.
7. تحديد نسبة تدفق من كل سطر من تدفق وفقا لمعادلات التالية:
   
8. ضبط نسبة تدفق إلى 21٪: 79٪ (± 2٪) (تدفق منفذ المركزي من الأشعة فوق البنفسجية فيس: تدفق منفذ الطرفية من خط). وإذا كانت نسبة تدفق المركزية من الأشعة فوق البنفسجية فيس فوق 21٪، وزيادة هبوط الضغط من خلال خفض القطر الداخلي للأنابيب المرفقة للخروج من كاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس، أو زيادة طوله. إذا كانت نسبة تدفق المركزية من الأشعة فوق البنفسجية فيس أقل من 21٪، وزيادة القطر الداخلي للأنابيب المرفقة للخروج من كاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس، أو تقليل طول الأنبوب. في كل مرة تم تغيير طول الأنبوب، كررالخطوات 4،3-4،7.
   ملاحظة: عمود CF في 2.1 مم وضع معرف "الظاهري" جاهز للتحليل.

النتائج

وقد وضعت أعمدة AFT باستخدام تصميم فريت المتخصصة (الشكل 1) في العمود متعدد المنافذ نهاية التجهيزات للتغلب على عدم التجانس السرير العمود وتحسين الأداء الانفصال. وقد أجريت دراسة بين المختبرات على أداء الفصل بين الأعمدة اللوني التليف الكيسي (الشكل 2) خارجا مع نظام مضخة مزدوجة انشاء (الشكل 3B) كما هو موضح في المادة 3 من هذا البروتوكول ^23. تم تحليل خليط ثلاثة اختبار مكون تحت عبر معرف 2.1 مم "ا...

المناقشة

وشملت هذه الدراسة تحليل بين المختبرات الأعمدة اللوني CF لاختبار الأداء التحليلي من حيث الكفاءة والحساسية. تم تعيين عمود CF مع نظام الضخ المزدوج كما هو موضح في قسم "3. تعيين نظام مضخة مزدوجة تصل إلى تحقيق نسبة تدفق 40:60 (مركز: الطرفية) على مدخل العمود CF. وقد تحقق نسبة التدفق من خلال تحديد معدل تدفق كل مضخة إلى القيمة التي تمثل 40٪ و 60٪ من إجمالي معدل التدفق، على التوالي: و40:60 (هامشية في الوسط). تم ضبطها منفذ العمود CF إلى عمود "الظاهري" مع معرف من 2.1 ملم باتباع...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مضخة إضافية
مطلوبة إذا تم استخدام 2 مضخة نظام CF تم إعداده.
تدفق الستار عمود HPLC	Thermo Fisher Scientific	لم يتم	تعريفه قريبا ليتم تسويقه
الميثانول	أي علامة تجارية		HPLC الصف
PEEK	الأنابيب أي علامة تجارية		أطوال مختلفة و معرف   ؛
نظرة خاطفة أنبوب القاطع	أي علامة تجارية
ميزان تحليلي	أي علامة تجارية
توقف ووتش	أي علامة تجارية
Eluent جمع السفن	استخدام أي علامة تجارية		1-2 مل قوارير عينة كأوعية تجميع مواد ميزئة
T-piece	أي علامة تجارية