Method Article

بناء وحدات صفائح هيدروجيل لتحجيم الكلي Micropatterned 3D الخلوية العمارة

DOI:

10.3791/53475

⸱

January 11th, 2016

 ,  , 
1Department of Bio and Brain Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف تصنيع صفائح الهيدروجيل الدقيقة باستخدام عملية بسيطة ، والتي يمكن تجميعها ومعالجتها في شكل قائم بذاته. باستخدام صفائح الهيدروجيل المعيارية هذه ، يمكن إنشاء نظام ثقافة خلية ثلاثي الأبعاد بسيط بمقياس كبير باستخدام بيئة مكروية خلوية خاضعة للرقابة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن نمط الهلاميات المائية على النطاق الصغير باستخدام تقنيات الموائع الدقيقة أو micropatterning إلى توفير في الجسم الحي تشبه الهندسة ثلاثية الأبعاد (3D) الأنسجة. وقد أدخلت الناتجة يبني على أساس هيدروجيل 3D الخلوية كبديل للالتجارب على الحيوانات للدراسات البيولوجية المتقدمة، المقايسات الدوائية والتطبيقات زرع الأعضاء. على الرغم من أن الجزيئات على أساس هيدروجيل والألياف يمكن أن تكون ملفقة بسهولة، فمن الصعب التلاعب بها لإعادة بناء الأنسجة. في هذا الفيديو، ونحن تصف طريقة لتصنيع صفائح الجينات هيدروجيل micropatterned، جنبا إلى جنب مع التجمع لتشكيل خلية نظام الثقافة 3D الماكرو النطاق مع المكروية الخلوية التي تسيطر عليها. باستخدام نموذج ضباب وكيل التبلور الكالسيوم، يتم إنشاء ورقة هيدروجيل رقيقة بسهولة مع سمك في حدود 100-200 ميكرون، ومع micropatterns دقيق. ويمكن بعد ذلك مثقف الخلايا مع التوجيه الهندسي للأوراق هيدروجيل فيشروط قائما بذاته. وعلاوة على ذلك، فإن ورقة هيدروجيل يمكن التلاعب بها بسهولة باستخدام micropipette مع تلميح نهاية المعالم، ويمكن تجميعها في هياكل متعددة الطبقات بتكويمهم باستخدام polydimethylsiloxane نمط (PDMS) الإطار. هذه الأوراق هيدروجيل وحدات، والتي يمكن أن تكون ملفقة باستخدام عملية السطحية، لها تطبيقات محتملة في المختبر فحوصات المخدرات والدراسات البيولوجية، بما في ذلك الدراسات الفنية الدقيقة وmacrostructure وإعادة الإعمار الأنسجة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهلاميات المائية بشكل خاص الحيوية واعدة، ويتوقع أن تكون مهمة في البيولوجيا الأساسية، المقايسات الدوائية والطب. وقد اقترح 1 Biofabrication من بنيات الخلوية القائم على هيدروجيل للحد من استخدام التجارب على الحيوانات، 2،3 استبدال أنسجة للزرع و 4 و تحسين المقايسات خلية القاعدة. 5،6 التي تحتوي على المياه (الكهرومائية) المواد اللزجة (الهلام) تسمح لعدد كبير من الخلايا لتكون مغلفة وصيانتها في بنية سقالة للسيطرة على المكروية الخلوية 3D. في تركيبة مع توجيه التكنولوجيات ميكروفلويديك أو micropatterning، الهندسة للبنيات هيدروجيل يمكن التحكم بدقة في نطاق الخلوية. حتى الآن، ومجموعة متنوعة من الأشكال من الهلاميات المائية، بما في ذلك الجزيئات، 7-9 الألياف، 10-12 ووريقات 13-15 وقد استخدمت وحدات البناء في APPRO من أسفل إلى أعلىأوجاع لتصنيع الماكرو النطاق أبنية متعددة الخلايا.

وكانت كل من الجسيمات القائم على هيدروجيل والألياف ملفقة بسهولة وبسرعة لتطبيقات عن البيئات الخلوية الصغيرة الحجم، مع وجود ضوابط الموائعية باستخدام أجهزة ميكروفلويديك. لكن، وكما الوحدات الأساسية للأنسجة هندسيا، سيكون معقدا لإعادة ترتيبها وتكبير حجمها كما يبني المستوى الكلي. 16 ومن الأصعب لتحقيق بنيات الكلية تحجيمها من لإنتاج وحدات الأساسية ميكرون الحجم. وحدات ورقة مثل من يبني على أساس هيدروجيل يمكن استخدامها لزيادة حجم السقالات عن طريق عملية التجميع بسيطة. ويترتب على ذلك طبقات مكدسة من الأوراق هيدروجيل توفر ليس فقط زيادة الحجمية ولكن أيضا تمديد هندسية في الفضاء 3D.

لقد ذكرت سابقا وسيلة لافتعال صحائف هيدروجيل micropatterned، 13-15 جنبا إلى جنب مع تجميع هذه الجزيئات متعددة تسريحأبنية الخلوية الدو. تقنية تمكن micropatterning معقدة وتصميم وحدات من البنى الخلوية عن طريق عملية زرع هياكل متعددة الطبقات. من خلال تلفيق مكدسة ورقة هيدروجيل وحدات، والتي micropatterned، نظام زراعة الخلايا 3D مع المكروية الخلوية المستوى الكلي التي تسيطر عليها لا يمكن أن تتحقق. يصف هذا البروتوكول فيديو طريقة تصنيع بسيطة لكنها قوية والتي يمكن استخدامها لبناء وحدات صفائح هيدروجيل، استنادا إلى الكبد البشري خط خلية سرطان (HepG2). علينا أن نبرهن تلاعب بسيط هنا من هذه الأوراق هيدروجيل حدات منقوشة، وتجميعها في هيكل متعدد الطبقات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد Micropatterned قوالب والهلاميات المائية

  1. إنتاج المطلوب أنماط الصغيرة الحجم باستخدام SU-8 مقاومة للضوء على سطح رقاقة السيليكون عن طريق معيار من خطوتين تقنية ضوئيه 15،17 لقوالب الصب PDMS. على سبيل المثال أظهرت يستخدم نمط شبكة تشبه فصيص الكبد (الشكل 1).
  2. تزن خارج PDMS وحل كيل علاج مع نسبة 1: 5 (أي 12.5 غرام من PDMS و 2.5 غرام من وكيل علاج).
  3. مزج 15 غراما من حل شامل، ديغا فقاعات في فراغ الغرفة، وانتشرت بعد ذلك في حل مختلطة على سطح micropatterned من رقاقة السيليكون بالتساوي داخل طبق احباط الصب.
  4. وضع رقاقة السيليكون على طبق من ذهب 65 درجة مئوية ساخنة لمدة 90 دقيقة على سطح مستو لعلاج PDMS.
  5. إزالة PDMS الشفاء من الطبق الصب ورقاقة السيليكون.
  6. قطع حواف PDMS وضعه على طبق بتري 100 ملم قطرها معالجانب حتى micropatterned.
  7. غسل PDMS الشفاء micropatterned على طبق بتري باستخدام 70٪ من الإيثانول والماء المقطر لمدة التعقيم الابتدائي. ثم، وتجفيفها تماما لمدة 10 دقيقة في فرن عند 65 درجة مئوية.
  8. حل وتخلط O / N 3 غرام من السطحي غير أيوني المجفف في 100 مل من الماء المقطر، وخلق 3٪ (ث / ت) حل الطلاء.
  9. ضع PDMS قوالب micropatterned في نظافة البلازما وتنظيفها لمدة 1 دقيقة (85 W، 0.73 ملي بار) لإنشاء سطح ماء، لتسهيل إضافة السوائل المائية. ثم، ومعطف سطح PDMS مع حل 100 مل السطحي لا يقل عن 3 ساعة (أورو / N) باستخدام الروك المختبر.
  10. غسل الحل السطحي من قوالب PDMS وتجفيفها تماما في فرن عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم، وتعقيم كل قالب micropatterned عن التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) الأشعة أكثر من 30 دقيقة.

2. إعداد تعليق خلية في هيدروجيل السلائف

  1. إلىإعداد هيدروجيل السلائف، حل 0.1 غرام من مسحوق الجينات الصوديوم في 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وخلق 1٪ (ث / ت) السلائف الجينات. لإذابة مسحوق تماما، واحتضان ومزجها O / N.
  2. مرشح الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون متصلة حقنة 1 مل.
  3. ثقافة الخلايا HepG2 في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين الستربتومايسين على طبق نسيج الثقافة التقليدية حتى 70٪ - 80٪ التقاء في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية .
  4. غسل خلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني، ثم يعرض للتريبسين لهم عن طريق إضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA لمدة 4 دقائق في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية. الطرد المركزي الخلايا التي تحصد من الطبق الثقافة في 250 x ج لمدة 3 دقائق و resuspend باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني بعد إزالة طاف.
  5. حساب عدد الخلايا وحيدة الموزعة في PBS باستخدام خلية الآليالعداد.
  6. بعد الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 3 دقائق وإزالة PBS، إضافة 1 مل من 1٪ (ث / ت) من حل الجينات الصوديوم إلى الخلية بيليه المتبقية ومزجها برفق باستخدام pipetting ل. يجب أن تكون كثافة البذر النهائية للخلايا 5 × 10 يونيو - 10 يوليو خلية / مل. احتضان تعليق خلية / هيدروجيل في حاضنة ترطيب 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.

3. تحميل وعبر ربط خلية / هيدروجيل تعليق

  1. حل 1.47 غرام من كلوريد الكالسيوم يذوى في 100 مل من ده 2 O لإنتاج كاشف عبر ربط (أي 100 ملي CaCl 2 · 2H 2 O في ده 2 O).
  2. التشطيف داخل المرطب مع محول بالموجات فوق الصوتية باستخدام الايثانول 70٪، وملء مع 200 مل من كاشف عبر ربط. المرطب هو 110 ملم واسعة، 300 مم طويل و 170 ملم العميق (أي 110 مم × 300 مم × 170 مم (W خ ح خ د)).
  3. ضع PDMS micropatternedقوالب في نظافة البلازما وتنظيفها لمدة 1 دقيقة في 85 W لخلق سطح ماء.
  4. باطراد تحميل 7.2 ميكرولتر للتمتزج جيدا خلية / هيدروجيل تعليق على حافة micropattern في القالب. على سبيل المثال أظهرت يستخدم نمط شبكة تشبه فصيص الكبد (الشكل 1). حجم تعليق يعتمد على نمط الطبوغرافية.
  5. لتحقيق دبق لتعليق الخلية / هيدروجيل، بدوره على المرطب والتحقق من أن تنتج المرطب رذاذ كاشف عبر ربط. رش كاشف عبر ربط على السلائف هيدروجيل لمدة 5 دقائق، والتي تغطي سطح الطبوغرافية من قوالب PDMS ضمن نطاق 5 سم.
    ملاحظة: لمسافات أطول وأقصر من 5 سم يمكن أن يسبب دبق غير مكتملة وغير متكافئ، على التوالي. ضمان المرطب لديها معدل الرش من 250 مل / ساعة، وتنتج 20 مل من ضباب كاشف عبر ربط في 5 دقائق.
  6. في أعقاب عملية عبر ربط، إيقاف المرطب وملء مو PDMSلدس مع برنامج تلفزيوني.

4. التعامل مع ورقة واحدة وحدات هيدروجيل

  1. فصل كل ورقة هيدروجيل صلابة من قوالب micropatterned عبر pipetting لPBS بلطف حول ورقة هيدروجيل باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  2. التقاط كل ورقة هيدروجيل العائمة باستخدام 1000 ميكرولتر نهاية ماصة قطع نهاية. كل ورقة هيدروجيل شبكة تشبه فصيص الكبد لديها أبعاد 8 مم × 8.7 مم، وتكون 100-200 ميكرون سميكة.
  3. نقل طبقة واحدة من ورقة هيدروجيل إلى 1 مل من DMEM في لوحة 12-جيدا، والثقافة الخلايا في المختبر بطريقة العائمة باستخدام هيدروجيل بناء كمكون الوحدة في 12 لوحة جيدا أكثر من أسبوع في 5 ٪ CO 2 مرطب حاضنة عند 37 درجة مئوية. تبادل مستنبت كل يوم.

5. الجمعية من متعدد الطبقات صفائح هيدروجيل

  1. كرر الخطوات من 1،1-1،5 لإنتاج إطار PDMS مع أبعاد 18 مم × 18 مم × 4 ملم (العرض ×ح خ د)، والذي يحتوي على هياكل دعامة 170 ميكرون عالية على السطح السفلي. استخدام 42 غرام من مزيج من PDMS وكيل علاج، مع نفس النسبة كما في الخطوة 1.2. وضع قالب البولي المتخصصة على رقاقة السيليكون للإطار PDMS لخلق إطار الداخلية مع أبعاد 8 مم × 9 مم × 2 مم (W خ ح خ د).
  2. تعقيم إطار PDMS و 180 ميكرون مسام أوراق الترشيح النايلون المغمورة في الماء المقطر وملاقط في الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
  3. ضع PDMS إطار تعقيمها على ربع قطعة من ورق الترشيح النايلون (بقطر 5 سم) في 60 ملم طبق بتري قطر.
  4. نقل ورقة هيدروجيل وحدات في المناطق الداخلية من الإطار PDMS باستخدام 1000 ميكرولتر ماصة قطع نهاية. وينبغي مثقف الأوراق هيدروجيل تستخدم للتجميع على الأقل يوميا بعد أن كانت ملفقة.
  5. محاذاة حافة كل ورقة هيدروجيل حدات مع الإطار PDMS باستخدام فارغة 200 ميكرولتر ماصة.
  6. كرر الخطوات من 5.4 و 5.5 باستخدام أوراق هيدروجيل حدات لتشكيل كومة من 4-6 طبقات.
  7. إزالة مستنبت التي تتدفق بها من خلال الهياكل عمود في الجزء السفلي من الإطار PDMS. ثم إضافة 2 ميكرولتر من محلول الجينات (2٪ ث / ت) في ركن من أركان بناء متعدد الطبقات.
  8. رش رذاذ كاشف عبر ربط لمدة 30 ثانية على بناء متعدد الطبقات إرفاق حواف كل طبقة مع نظيرتها في بلد آخر. استخدام 2 مل من ضباب كاشف عبر ربط (بمعدل رش 250 مل / ساعة).
  9. شطف بناء متعدد الطبقات بلطف مع 400 ميكرولتر DMEM وإزالة الإطار PDMS باستخدام الملقط.
  10. فصل بناء متعدد الطبقات من ورقة الترشيح عن طريق المسح برفق مع خلية رافع بعد إضافة 4 مل من DMEM.
  11. نقل بناء لوحة 6 جيدا تحتوي على 3 مل من DMEM استعمال ورق الترشيح، والثقافة الخلايا في المختبر بطريقة عائمة، مع هيدروجيل بناء كما متعددة الطبقاتسقالة الخلوية متعددة النطاق في لوحة 6 جيدا أكثر من أسبوع في حاضنة ترطيب 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. تبادل مستنبت كل يوم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفناها تصنيع والتلاعب قائما بذاته ورقة هيدروجيل الخلوية. كما هو مبين في الشكل 1، ونحن ملفقة PDMS قوالب micropatterned، وكانت محملة هيدروجيل التي تحتوي على الخلايا على سطح ماء من هذه القوالب وعبر المرتبطة باستخدام المرطب لتوليد ضباب على هيئة إيروسولات من التبلور وكيل. بعد إطلاق سراحه من القوالب، وكانت الخلايا المستزرعة في HepG2 قائما بذاته ورقة هيدروجيل مع مختلف أنماط (الشكل 2). وهكذا، قدمت ورقة هي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة لافتعال صحائف هيدروجيل وحدات، وتجميع لهم لتشكيل السقالات الخلوية 3D.

لبناء واضحة الهياكل الجينات منقوشة في وقت قصير، يجب أن نحدد عملية عبر ربط التي يمكن أن تخلق هياكل جامدة بما فيه الكفاية للحفاظ على micropatterns معقدة من القالب، وكذلك الحفاظ على سلامة الخلية والتمثيل الغذائي. قمنا بتطوير عملية عبر ربط، بما في ذلك الانتقال سول-جل، للرش كاشف عبر ربط باستخدام المرطب على شكل ضباب. بد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج مختبر أبحاث وطني رائد (منحة NRF-2013R1A2A1A05006378) من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي. يعترف المؤلفون أيضا ببرنامج الرعاية الصحية لأنظمة KAIST.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 سيليكون المطاط الصناعي كيتداو كورنينج كوربوريشن000000000001064291
بلورونيك F-127سيجما ألدريتشP2443مسحوق الفاعل بالسطح غير الأيوني  
ملح الصوديوم بحمض الألجنيك ، لزوجة منخفضةAlfa AesarB25266
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيومSigma-AldrichC7902
ترطيب بالموجات فوق الصوتيةMediHeimMH-2800معدات معدلة ، أقصى معدل للرش: 250 مل / ساعة
مرشح نايلون صافي مائي ، 180 مو ؛ mEMD MilliporeNY8H04700
قالبكربونات قالب مخصص لتصنيع نمط إطار PDMS
جهاز البولي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).
  2. Lan, S., Starly, B. Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities. Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).
  3. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
  4. Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210 (4472), 908-910 (1980).
  5. Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays. Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).
  6. Xu, Y., et al. A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions. Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).
  7. Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel. Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).
  8. Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks. Biomicrofluidics. 5 (3), 034117(2011).
  9. Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules. Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).
  10. Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking. Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).
  11. Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
  12. Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).
  13. Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures. 12 (1), 14-18 (2011).
  14. Lee, W., et al. Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction. Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).
  15. Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters. Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).
  16. Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip. Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).
  17. Choi, S., Park, J. K. Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels. Biomicrofluidics. 4 (4), 046503(2010).
  18. Lee, B. R., et al. In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids. Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).
  19. Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. A microfluidic biomaterial. J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).
  20. Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. Microfluidic scaffolds for tissue engineering. Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).
  21. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modular Hydrogel SheetsMicropatterned Hydrogel SheetsHydrogel Sheet FabricationAlginate Hydrogel SheetsPDMS Mold PreparationHydrogel Sheet Assembly3D Cell Culture SystemHydrogel Sheet ManipulationMicropatterned PDMS FrameHydrogel Cross linking Mist

Related Articles