مقالة منهجية

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

DOI:

10.3791/53478

⸱

يناير 20, 2016

 , 
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد الجزيئات المرتبطة بمناطق جينومية محددة ذات أهمية مطلوب لفهم آليات تنظيم وظائف هذه المناطق. يصف هذا البروتوكول إجراءات إجراء عدم الترسب الهندسي للكروماتين بوساطة جزيء ربط الحمض النووي (enChIP) لتحديد البروتينات والحمض النووي الريبي المرتبط بمنطقة جينومية معينة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد الجزيئات المرتبطة بمناطق جينومية محددة ذات أهمية مطلوب لفهم آليات تنظيم وظائف هذه المناطق. لتمكين التحديد غير المتحيز للجزيئات التي تتفاعل مع منطقة جينومية معينة ذات أهمية ، قمنا مؤخرا بتطوير تقنية الترسيب المناعي للكروماتين بوساطة جزيئات ربط الحمض النووي (enChIP). هنا ، نصف كيفية استخدام enChIP لعزل مناطق جينومية معينة وتحديد البروتينات والحمض النووي الريبي المرتبطة. أولا ، يتم تمييز منطقة الجينوم ذات الأهمية ببروتين يشبه منشط النسخ (TAL) أو مركب متكرر متسلسل قصير متبادر (CRISPR) يتكون من شكل غير نشط تحفيزيا من Cas9 ودليل الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، يتم ربط الكروماتين وتجزئته عن طريق الصوتنة. ثم يتم ترسيب الموضع الموسوم بالمناعة ويتم عكس التشابك. أخيرا ، تخضع البروتينات أو الحمض النووي الريبي المرتبطة بالكروماتين المعزول لتحليلات القياس الطيفي الكتلي أو تسلسل الحمض النووي الريبي ، على التوالي. يسمح هذا النهج بالتعرف الناجح على البروتينات والحمض النووي الريبي المرتبط بمنطقة جينومية ذات أهمية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مطلوب تحديد الجزيئات المرتبطة مناطق الجينوم محددة من الفائدة لفهم آليات تنظيم وظائف الجينوم مثل النسخ وتنظيم جينية. على الرغم من أن وضعت العديد من التقنيات لتحليل الكيمياء الحيوية من مناطق الجينوم محددة 1-7، لا يتم استخدامها على نطاق واسع في هذه المرحلة بسبب المشاكل الجوهرية من قبيل التطبيق المحدود (على سبيل المثال، فقط من أجل عالية نسخ مواضع عدد أو مواضع حيث تتكرر) و الكثير من الوقت والجهود المطلوبة.

من أجل إجراء تحليل كيميائي حيوي من مناطق الجينوم معينة بسهولة، وضعنا اثنين من موضع معين لونين مناعي (رقاقة) التكنولوجيات، وهي إقحامي رقاقة (iChIP) 13/08 وهندستها بوساطة جزيء رقاقة الحمض النووي ملزم (enChIP) 14-17 . في iChIP، ووضع علامة على موضع الاهتمام عن طريق إدراج تسلسل الاعتراف بروتين ملزمة الحمض النووي الخارجية مثل ليكسثم يتم عزل A. موضع كتبها تنقية تقارب باستخدام بروتين ملزمة DNA الموسومة. في enChIP وهندستها جزيئات الحمض النووي ملزم، مثل البروتينات والزنك الاصبع، النسخ الشبيهة المنشط (TAL) البروتينات، وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) المجمعات، وتستخدم لوضع علامة على موضع الاهتمام (الشكل 1). وفي وقت لاحق، تم عزل المنطقة الجينومية التي كتبها تنقية تقارب من جزيئات الحمض النووي ملزم المعلمة.

واحدة من مزايا enChIP على iChIP هو أن إدراج تسلسل الاعتراف بروتين ملزمة الحمض النووي الخارجية ليست ضرورية. استهداف مواضع باستخدام المجمعات كريسبر يتكون من شكل غير نشط حفاز من Cas9 (dCas9) ودليل الحمض النووي الريبي (gRNA) هو أسهل بكثير من استهداف هذه المناطق من قبل iChIP أو enChIP باستخدام TAL والزنك والبروتينات الإصبع. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لenChIP جنبا إلى جنب مع مطياف الكتلة وRNA تسلسل (RNA تسلسل) لتحديد مكان-لجمعياتالبروتينات تيد والرنا، على التوالي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم المهندسة جزيئات الحمض النووي ملزم إدراكا موضع الهدف

  1. لenChIP باستخدام المجمعات كريسبر، استخدم أداة على شبكة الإنترنت CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) لتحديد تسلسل المرشح gRNA المستهدفة في المنطقة الجينومية من الفائدة كما هو موضح سابقا (18). هذه الأداة الويب ترجع 23 سنة مضت المواقع الجينومية من النموذج 5'-N 20 NGG-3 "في المنطقة المستهدفة.
  2. توليف gBlock بما في ذلك U6 تسلسل المروج وتسلسل 5'-N 20 في 5'-N 20 NGG-3 "استخدام خدمات تجارية (انظر الشكل 2) 19،20. لأغراض subcloning، وتشمل مواقع انزيم تقييد المناسبة خارج gBlock.
  3. إدراج gBlock إلى ناقلات المناسب كما هو موضح سابقا (16). هي عدة ناقلات فيروسات لgBlocks المتاحة (انظر المواد).
  4. لenChIP باستخدام بروتينات TAL، تصميم البروتينات TAL الاعتراف TARGوآخرون مواضع. توليد البلازميدات ترميز البروتينات TAL باستخدام الخدمات التجارية. توليد ناقلات التعبير التي تحتوي على البروتينات TAL تنصهر مع واحد أو أكثر العلامات مثل 3 × FLAG كما هو موضح سابقا (15).

إنشاء 2. خلايا لتحليل enChIP

  1. التعبير عن 3 × FLAG-dCas9 وgRNA (الإجراء القائم على كريسبر) أو 3 × FLAG التل (TAL الداخلي القائم على البروتين) في الخلايا لتحليلها كما هو موضح سابقا 14-17.
    1. استخدام ترنسفكأيشن عابرة اذا كانت كفاءة ترنسفكأيشن عالية. متجه التعبير التي تحتوي على 3 × FLAG-dCas9 والمروج CMV يتوفر (انظر المواد).
    2. النظر في إنشاء transformants مستقرة استخدام الأساليب التقليدية إذا كفاءة ترنسفكأيشن عابرة منخفضة. بالإضافة إلى ناقلات فيروسات المذكورة أعلاه لgBlock، هي ناقلات فيروسات من 3 × FLAG-dCas9 المتاحة (انظر المواد).
  2. تأكيد التعبير عن 3xFLAG-dCas9 أو البروتين 3xFLAG التل في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عن طريق تحليل طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة FLAG (أب) كما هو موضح سابقا 14-17.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تأكيد التعبير عن هذه البروتينات تصفها تلطيخ الخلايا مع anti-FLAG-FITC وتحليل FACS لاحق. بروتوكول لتلطيخ الخلايا يمكن تحميلها من موقعنا (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
  3. تأكيد تعبير عن gRNA عن طريق معيار تقنية RT-PCR.
  4. لتحديد كمية البروتينات التفاعل مع المنطقة الجينومية من الاهتمام، والنظر في استخدام العلامات النظائر المستقرة التي كتبها الأحماض الأمينية في الثقافة الخلية (SILAC) تحليل جنبا إلى جنب مع enChIP (enChIP-SILAC).
    ملاحظة: وسائل الإعلام لتحليل SILAC يمكن شراؤها من البائعين التجارية. SILAC هو قوي في الكشف عن التفاعلات محددة.
    1. خلايا الثقافة في SILAC المتوسطة الثقيلة. إعداد الخلايا cultuأحمر في ضوء SILAC المتوسطة كوسيلة لمراقبة سلبية. استخدام 5 × 10 7 خلايا على الاقل لكل المتوسطة SILAC (الثقيلة أو الخفيفة). لوضع العلامات كفاءة، إضافة كل L-ليسين-2HCl، 13 C 6 و L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك، 13 C 6، 15 N 4 في وسائل الإعلام SILAC الثقيلة. ملاحظة: لا يقل عن خمسة انقسامات الخلية ضرورية للبروتينات التسمية.
      1. على سبيل المثال، ثقافة خلايا ليفية HT1080 الإنسان التعبير عن ثابت 3xFLAG-dCas9 وgRNA عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في وسائل الاعلام DMEM لSILAC ومدال مصل بقري جنيني مع يسين-2HCl بالإضافة إلى L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك (فاتح متوسط) أو 13 C 6 L-ليسين-2HCl بالإضافة إلى 13 C 6 15 N 4 L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك (المتوسطة الثقيلة) (انظر المواد) 16. إضافة 50 ملغ من ضوء أو الثقيلة L-ليسين-2HCl وL-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك في 500 مل من المتوسط.
      2. خلايا يعرض للتريبسين وreplate قبل أن تصبح متموجة بحيث تحافظ على خلايا growt الأسيح.

3. يشابك من الخلايا مع الفورمالديهايد

  1. للخلايا في الثقافة تعليق، ونقل 2 × 10 7 الخلايا معربا عن البروتينات 3xFLAG التل أو 3xFLAG-dCas9 بالإضافة إلى gRNA وتعليق في 30 مل من مستنبت منتظمة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. عندما تستخدم المزيد من الخلايا، وزيادة كميات وكميات من الكواشف نسبيا. للتجارب SILAC، مزيج من الخلايا المستزرعة في المتوسط ​​الثقيلة أو المتوسطة الخفيفة (5 × 10 7 خلايا لكل منهما) وتقسيم مجموعه 1 × 10 8 خلايا إلى 5 أنابيب تحتوي على 2 × 10 7 الخلايا.
  2. إضافة 810 ميكرولتر من 37٪ الفورمالديهايد إلى 30 مل من تعليق خلية (تركيز النهائي 1٪)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. لخلايا ملتصقة، إصلاح الخلايا مباشرة في أطباق الثقافة من خلال إضافة 810 ميكرولتر من 37٪ الفورمالديهايد إلى 30 مل من مستنبت.
  3. وقف يشابك بإضافة 3.1 مل من 1،25 M الجلايسين الحل (تركيز النهائي 127 ملم)، وفي احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
  4. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية). تجاهل بعناية طاف بما في ذلك الفورمالديهايد وتخزينه في زجاجة النفايات المناسبة.
    1. لخلايا ملتصقة، فصل الخلايا مع مكشطة الخلية والحصاد في أنبوب 50 مل، وجمع الخلايا كما هو موضح في هذه الخطوة.
    2. للتجارب SILAC، مزج خلايا منفصلة مثقف في المتوسط ​​الثقيلة أو المتوسطة الخفيفة (5 × 10 7 خلية لكل منهما)، تقسيم مجموعه 1 × 10 8 خلايا إلى 5 أنابيب تحتوي على 2 × 10 7 خلايا، وجمع الخلايا كما هو موضح في هذه خطوة.
  5. غسل الخلية بيليه مع 30 مل من برنامج تلفزيوني مرتين في أنبوب. تجاهل بعناية طاف بما في ذلك الفورمالديهايد وتخزينها في النفايات المناسبة bottle.Handle النفايات الفورمالديهايد وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية. الخلايا الثابتة يمكن تجميد وتخزين في -80 ° C.

4. إعداد لونين (في 2 × 107 الخلايا)

  1. تعليق الخلايا الثابتة في 10 مل من العازلة تحلل الخلية (10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 ملم EDTA، 0.5٪ IGEPAL CA-630، و 1 × مثبطات الأنزيم البروتيني)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  2. الطرد المركزي العينة (830 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق) وتجاهل طاف بعناية.
  3. تعليق بيليه في 10 مل من تحلل العازلة النووي (10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 ملم EDTA، 0.5 M كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100، و 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، و 0.5٪ lauroylsarcosine، ومثبطات الأنزيم البروتيني 1X). احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة ودوامة كل 2-3 دقيقة.
  4. الطرد المركزي العينة (830 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق) وتجاهل طاف بعناية.
  5. يغسل بيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني. بيليه (لونين جزء) يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية بعد تجميد فوري في النيتروجين السائل.

5. صوتنة من لونين (في 2 × 10 7 خلايا)

  1. تعليق جزء لونين في 800 ميكرولتر منتعديل العازلة تحلل 3 (10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 ملم EDTA، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ SDS، و1X مثبطات الأنزيم البروتيني) ونقل في أنبوب 1.5 مل.
  2. يصوتن لونين باستخدام sonicator (انظر المواد) والشروط التالية: الإخراج: 3؛ واجب: 100٪ (مستمر)؛ والوقت: مجانا. أداء 10-18 دورات صوتنة لمدة 10 ثانية والتبريد على الجليد لمدة 20 ثانية. لتجنب الإفراط في التدفئة، واحتضان العينات على الجليد لمدة 2 دقيقة كل 5-6 دورات. لتجنب رغوة، والحفاظ على موقف غيض من التحقيق صوتنة 0.5 سم فوق الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. أجهزة الطرد المركزي في العينة (16000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة) ونقل طاف في أنبوب 1.5 مل. يمكن تخزينها لونين sonicated في -80 درجة مئوية بعد تجميد فوري في النيتروجين السائل.

6. تقييم لونين تجزئة

  1. مزيج 10 ميكرولتر من لونين مجزأة مع 85 ميكرولتر من الماء المقطر.
  2. إضافة 4 ميكرولترمن 5 M كلوريد الصوديوم واحتضان عند 65 درجة CO / N.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز ألف واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  4. إضافة 2 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 4 ميكرولتر من 1 M تريس (الرقم الهيدروجيني 6.8)، و 1 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين كاف، ثم احتضان عند 45 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  5. منفصلة 10 ميكرولتر من العينة الكهربائي في هلام الاغاروز 1٪ لا يحتوي على تلطيخ الأصباغ مثل SYBR الأخضر.
  6. وصمة عار الجل لتقييم توزيع أطوال لونين مجزأة. ينصح الظروف التي تولد متوسط ​​طول 0.5-2 KBP (مجموعة من 0،2-4 KBP).
  7. تنقية الحمض النووي من العينات المتبقية عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم أو باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي (انظر المواد). الحمض النووي المنقى يمكن استخدام DNA المدخلات لتقدير غلة التحليلات enChIP (انظر 8.11).

7. إعداد Dynabeads مترافق مع الأجسام المضادة (في 2 × 10 7 خلايا)

  1. قبلحلج اثنين من 1.5 مل أنابيب، واحد لمرحلة ما قبل المقاصة باستخدام مفتش الفأر العادي والآخر للحضانة مع المضادة للFLAG أب. إضافة 150 ميكرولتر من البروتين G مترافق الخرز المغناطيسي (انظر المواد) إلى كل أنبوب.
  2. وضع أنابيب على موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف قبل pipetting.
  3. تعليق الخرز في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.01٪ توين-20 (PBS-T). وضع أنابيب على الوقوف المغناطيسي وانتظر لمدة 2 دقيقة. تجاهل طاف قبل pipetting، ثم كرر هذه الخطوة.
  4. تعليق الخرز في 1 مل من التي تحتوي على 0.1٪ BSA PBS-T.
  5. إضافة 15 ميكروغرام من مفتش الماوس العادي أو مكافحة FLAG أب وتناوب على 4 درجات CO / N.
  6. تدور باستمرار لفترة وجيزة، ثم وضع أنابيب على موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف قبل pipetting.
  7. تعليق الخرز في 1 مل من PBS-T. عكس العينة عدة مرات، وتدور باستمرار لفترة وجيزة. وضع أنابيب على موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق، ثم تجاهل طاف قبل pipetting. تكرار غسلأكثر مرتين مع PBS-T (ما مجموعه ثلاث خطوات غسل).

8. مناعي لونين (في 2 × 10 7 خلايا)

  1. مزج لونين مجزأة أعد في 5.3) (حوالي 800 ميكرولتر) مع خمس من حجم (حوالي 200 ميكرولتر) المعدلة العازلة تحلل 3 تحتوي على 5٪ تريتون X-100 (تركيز النهائي من 1٪ تريتون X-100).
  2. إضافة حل لونين للأنبوب الذي تم إعداد حبات مغناطيسية بروتين G-مترافق مترافق مع الماوس العادي مفتش. تناوب على 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. وضع أنبوب في موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق.
  4. نقل طاف في أنبوب التي أعد حبات مغناطيسية بروتين G-مترافق مترافق مع مكافحة FLAG أب. تناوب على 4 درجات CO / N.
  5. وضع أنبوب في موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف قبل pipetting.
  6. تعليق الخرز في 1 مل من العازلة الملح منخفضة (20 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 2 مم EDTA، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ تريطن X-100، 0.1٪ SDS، و1X مثبطات الأنزيم البروتيني)، وتناوب على 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. وضع أنبوب في موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف قبل pipetting وكرر الخطوة غسل.
  7. تغسل حبات مع العازلة الملح العالية (20 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 2 مم EDTA، 500 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS، و1X مثبطات الأنزيم البروتيني) مرتين.
  8. تغسل حبات مع LiCl العازلة (10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 ملم EDTA، 250 ملي LiCl، و 0.5٪ IGEPAL CA-630، و 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، ومثبطات الأنزيم البروتيني 1X) مرتين.
  9. تغسل حبات مع TBS-IGEPAL CA-630 (50 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ IGEPAL CA-630، و1X مثبطات الأنزيم البروتيني) مرة واحدة.
  10. تعليق الخرز في 200 ميكرولتر من شطف العازلة (50 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ IGEPAL CA-630، مثبطات الأنزيم البروتيني 1X، و 500 ميكروغرام / مل 3 × FLAG الببتيد)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. وضع أنبوب في موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. نقل طاف في أنبوب جديد 1.5 مل وكرر elutايون خطوة.
  11. تنقية DNA من جزء صغير (على سبيل المثال، 5٪) من شطافة عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم أو باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي (انظر المواد). الحمض النووي المنقى يمكن استخدامها لPCR مع التمهيدي معين يحدد لتقدير غلة enChIP يحلل بمقارنة مع الحمض النووي المدخلات التي أعدت في الخطوة 6.7 كما هو موضح سابقا 14،16.

9. SDS-PAGE، تلطيخ، وتحليل كتلة الطيف

  1. مزيج شطافة (400 ميكرولتر) مع 1 مل من 2 بروبانول، 50 ميكرولتر من 3M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2)، و 5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الجليكوجين. ترسيب لونين في -20 درجة CO / N.
  2. الطرد المركزي العينة (16000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) وتجاهل طاف. شطف بيليه مع 1 مل من الايثانول 70٪ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى (16000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة). تجاهل طاف تماما من قبل pipetting.
  3. تعليق بيليه في 40 ميكرولتر من عينة العازلة 2X (125 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 10٪ 2-الحائزاتaptoethanol، 4٪ SDS، و 10٪ سكروز، و0.004٪ برموفينول الأزرق). دوامة لمدة 5 دقائق لإذابة بيليه تماما، ثم احتضان عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتفسد البروتينات وعكس يشابك.
  4. لSDS-PAGE، تشغيل 40 ميكرولتر من العينة على هلام حتى يصل الصبغة 1 سم تحت البئر. ملاحظة: نحن عادة استخدام المواد الهلامية 4-20٪ التدرج، ولكن المواد الهلامية الأخرى٪ يمكن استخدامها.
  5. وصمة عار الجل مع Coomassie بريليانت الأزرق أو الفضة وصمة عار.
  6. قطع هلام إلى خمس قطع (2 ملم الارتفاع).
  7. أداء في الهضم جل والتحليل الطيفي الشامل كما هو موضح سابقا 13-16.
  8. للتجارب SILAC مع 5 × 10 7 خلايا كل (ما مجموعه 1 × 10 8 خلايا)، تعليق بيليه من الأنابيب الخمسة الأولى في 40 ميكرولتر من عينة العازلة 2X (أنه ليس من الضروري لزيادة).

10. تنقية RNA وRNA تسلسل تحليل

  1. لتنقية RNA بعد enChIP، إضافة 5 U / مل من ريبونوكلياز المانع (SEمواد ه) لجميع الحلول العازلة، باستثناء تعديل العازلة تحلل 3 وشطف العازلة، التي تضيف 40 U / مل من ريبونوكلياز المانع.
  2. مزيج شطافة (400 ميكرولتر) مع 16 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  3. إضافة 1 مل من كاشف أساس حمض guanidinium الفينول (انظر المواد) للعينة. دوامة لمدة 15 ثانية ثم في احتضان RT ل5-15 دقيقة. الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة في 12000 × ز وRT.
  4. نقل طاف لأنبوب جديد 1.5 مل وإضافة 5 ميكرولتر من ف bromoanisole. دوامة لمدة 15 ثانية ثم في احتضان RT لمدة 3-5 دقيقة. الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة في 12000 × ز وRT.
  5. نقل طاف (حوالي 1 مل) في أنبوب جديد 2 مل وإضافة 1 مل من 2 بروبانول. عكس الأنبوب واحتضان في RT لمدة 10 دقيقة. تحميل الخليط على عمود في عدة تنقية RNA (انظر المواد). أجهزة الطرد المركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 12000 × ز وRT.
  6. غسلالعمود مع 400 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي غسل العازلة في عدة تنقية RNA (انظر المواد).
  7. إضافة 80 ميكرولتر من الدناز I كوكتيل (مزيج من 5 ميكرولتر من الدناز I (1 U / ميكرولتر)، 8 ميكرولتر من 10 × الدناز I رد فعل مؤقت، 3 ميكرولتر من الدناز / ريبونوكلياز خالية من المياه، و 64 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي غسل العازلة في طقم تنقية الحمض النووي الريبي (انظر المواد)) إلى العمود. احتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 12000 × ز وRT.
  8. غسل العمود مع 400 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي PreWash العازلة في عدة تنقية RNA (انظر المواد) مرتين.
  9. أزل الحمض النووي الريبي مع 50 ميكرولتر من الدناز / ريبونوكلياز خالية من المياه. الحمض النووي الريبي مزال يمكن استخدامها لRNA التسلسل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عموما، يمكن تنقيته 1-30٪ من مناطق الجينوم الهدف باستخدام enChIP الشكل 3 يتضمن بيانات تمثيلية تبين غلة enChIP تحليلات تستهدف التيلوميرات ومروج للفيروسات (IFN) التنظيمي عامل 1 (IRF-1) الجينات. كأمثلة على نتائج نموذجية، يورد الجدول 1 البروتينات المرتبطة المروج IRF-1 بطريقة IFNγ معينة حددها enChIP-SILAC، الجدول 2 قوائم البروتينات ملزم التيلومير التي حددها enChIP جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي (enChIP-MS) ويتضمن الجدول 3 الرنا المرتبطة التيلومير التي حددها enChIP-RNA تسلسل.

figure-results-1
الشكل 1. نظرة عامة على enChIP. enChIP باستخدام كريسبر (A، B) وTAL (C، D، E قوية>) هو مبين. تم وضع علامة على موضع الاهتمام مع المهندسة جزيئات الحمض النووي ملزم مثل البروتين TAL أو نظام كريسبر يتكون من شكل غير نشط حفاز من Cas9 (dCas) وتوجيه RNA (gRNA). يتم إصلاحها التفاعلات الجزيئية مع الفورمالديهايد أو crosslinkers أخرى، إذا لزم الأمر. وفي وقت لاحق، تم تجزئة لونين الثابتة صوتنة أو الهضم الأنزيمي. يتم تنقيته المناطق الجينومية تصفها تنقية تقارب. وأخيرا، يتم عكس يشابك، ويتم تحديد الجزيئات المتفاعلة (المناطق الجينومية، الرنا، والبروتينات) باستخدام الجيل القادم التسلسل ومطياف الكتلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. تسلسل gBlock. المروج U6 (باللون الأسود)، وG النوكليوتيدات بefore تسلسل دليل (باللون الأزرق)، يتم عرض تسلسل دليل (gRNA هل) (باللون الأحمر)، وتسلسل سقالة (باللون الأخضر)، وتسلسل فاصل (باللون البرتقالي).

figure-results-3
الشكل 3. العائد من تحليلات enChIP ممثل. المدخلات (A) النسبة المئوية لهدف IRF-1 موضع وغير المستهدفة Sox2 مكان. المدخلات (B) النسبة المئوية للالتيلوميرات المستهدفة وغير المستهدفة γ-الأقمار الصناعية. تم تعديل الأرقام وتعديلها من المنشورات السابقة 15،16.

أقسام البروتينات
نسخ DDX1، PARP1، CKAP4، Pescadillo homolog، PURβ،
تنشيط البلمرة RNA II النسخي المنشط P15،
BTF3، MYB ملزمالبروتين 1A
deacetylation هيستون،
مكونات تميم الكاظمة 		RBBP4، PA2G4، TBL3
أسيتيل أرجينين البروتين N-ناقلة ميثيل 1
DNA topoisomerase DNA topoisomerase 2α
الهستونات هيستون H2A.Z، هيستون H3.2

الجدول 1: أمثلة من البروتينات المرتبطة IRF-1 منطقة المروج الإنسان بطريقة IFNγ معينة حددها enChIP-SILAC تم تكييفها الجدول من منشور السابق 16.

أقسام البروتينات
البروتينات ملزم التيلومير الثدييات حزب الرابطة الاسلامية، الجيش الوطني الرواندي، CDK1، PARP1، PCBP1
التيلومير ثنائيةالاكتشاف البروتينات في الخميرة
أو الكائنات الحية الأخرى 		IMP4
البروتينات التفاعل مع التيلومير ملزمة
البروتينات [بروتين يرتبط ملزم التيلومير] 		البلمرة DNA α (POLA1) [Cdc13p]،
ARMC6 [TRF2]، CTBP1 [FOXP2-POT1]،
exportin-5 [TERT]، GNL3L [TRF1]،
exportin-1 [TERT]، 14-3-3 [TERT]
البروتينات توطين لالمغاير BEND3
البروتينات التي تنظم علامات جينية KDM5C
البروتينات التي تؤثر على وظيفة التيلومير الطفرات α البلمرة DNA (POLA1)، HAT1، Nup133،
CDK7، DPOE1، PRDX1، TYSY،
الغلوتامات السيستين يغاز، glutaredoxin، SMRC1

الجدول 2: أمثلة من البروتينات المرتبطة التيلوميرات الماوس التي تحددها enChIP-MS وكان جدول adapteد من منشور السابق 15.

أقسام الرنا
مكونات التيلوميراز TERC، Rmrp
Telomeric الرنا تراسات
scaRNAs Scarna6، Scarna10، Scarna13، Scarna2
H / ACA snoRNAs Snora23، Snora74a، Snora73b، Snora73a
C / D snoRNAs Snord17، Snord15a، Snord118
lncRNA Neat1

الجدول 3: أمثلة من الرنا المرتبطة التيلوميرات الماوس التي تحددها-RNA تسلسل enChIP وقد تم تعديل الجدول من منشور السابق 17.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف تنقية مناطق جينومية معينة باستخدام جزيئات ربط الحمض النووي الهندسية مثل نظام كريسبر وبروتينات TAL ، وتحديد البروتينات والحمض النووي الريبي المرتبطة بهذه المناطق الجينومية. قد يؤثر ارتباط جزيئات ربط الحمض النووي المصممة هندسيا بالجينوم على بنية الكروماتين ، بما في ذلك تحديد موضع النيوكليوسوم ، وقد يلغي الوظائف الجينومية ، كما هو موضح في تجارب تداخل كريسبر21. لتجنب هذه التأثيرات الشاذة المحتملة ، نقترح إرشادات محددة لاختيار المناطق الجينومية المستهدفة. أولا ، لتجنب التثبيط المحتمل لتوظيف بوليميرات الحمض النووي الريبي وعوامل النسخ ، بالإضافة إلى تعطيل موضع النيوكليوسوم حول موقع بدء النسخ ، يجب أن تكون المناطق المستهدفة لتحليلات مناطق المروج عدة مئات من أزواج القواعد في اتجاه المنبع (5 بوصات إلى) موقع بدء النسخ. على النقيض من ذلك ، عند تحليل المناطق الجينومية ذات الحدود المميزة ، مثل المعززات وكواتم الصوت ، يمكن استهداف المناطق الجينومية التي يتم وضعها مباشرة جنبا إلى جنب مع هذه المناطق لأنه من غير المرجح أن يؤثر ارتباط جزيئات ربط الحمض النووي المهندسة على وظائفها. علاوة على ذلك ، من الأفضل تجنب استخدام المناطق المستهدفة المحفوظة بين الأنواع المختلفة ، لأن جزيئات ربط الحمض النووي المهمة غالبا ما ترتبط بالمناطق المحفوظة تطوريا وقد يؤدي تثبيط ارتباطها إلى تعطيل وظائف المناطق الجينومية المستهدفة. في هذا الصدد ، من الضروري دائما التحقق من الحفاظ على وظيفة المنطقة الجينومية المستهدفة في الخلايا القائمة المستخدمة في تحليلات enChIP. نظرا لأنه يمكن اختبار gRNAs المتعددة بسهولة ومن الممل والمكلف توليد إصدارات متعددة من بروتينات TAL أو بروتينات إصبع الزنك التي تتعرف على المناطق الجينومية المستهدفة المختلفة ، فإن enChIP باستخدام CRISPR أكثر فائدة من enChIP باستخدام بروتينات أخرى.

لقد ثبت أن dCas9 يرتبط بالمواقع غير المستهدفة على الرغم من أن التقارب مع تلك المواقع قد يكون أضعف من ذلك مع المواقع المستهدفة22-25. هناك عدة طرق لإدارة تلوث الجزيئات المرتبطة بتلك المواقع غير المستهدفة. أولا ، يوصى باستخدام العديد من gRNAs المختلفة ، على الأقل اثنين. تلك الجزيئات التي يتم ملاحظتها بشكل شائع في enChIP باستخدام gRNAs المميزة ستكون إيجابيات حقيقية. ثانيا ، ستكون المقارنة بين الظروف المختلفة ل enChIP فعالة في إلغاء تلوث الجزيئات والجزيئات غير المحددة المرتبطة بالمواقع غير المستهدفة. ومن الأمثلة على مجموعات المقارنة هذه (أنا) التحفيز (-) و (+) ، أو (ثانيا) أنواع مختلفة من الخلايا مثل الخلايا التائية مقابل الخلايا البائية. أخيرا ، يجب إجراء تحليل كمي لارتباط الجزيئات المرشحة لتأكيد ارتباطها المحدد بالمواقع المستهدفة. يفضل تحضير الخلايا التي تعبر عن dCas9 فقط ولكن ليس gRNA كعنصر تحكم سلبي.

باستخدام تحليلات enChIP ، تمكنا من تحديد عدد من الجزيئات المعروفة والجديدة التي تتفاعل مع مناطق جينومية محددة بنجاح (الجداول 1-3) 14-17. ومع ذلك ، فشلت هذه التقنية في اكتشاف بعض البروتينات الأخرى المعروفة التي تتفاعل مع هذه المناطق. على سبيل المثال ، يقال إن STAT1 يرتبط بمحفز IRF-1 عند تحفيز IFNγ8 ، لكن تحليل enChIP-SILAC الخاص بنا لم يكتشف STAT1 كبروتين مستحث للتفاعل مع هذه المنطقة الجينومية16. بالإضافة إلى ذلك ، في تحليل enChIP-MS للتيلوميرات ، لم نكتشف المأوى في البروتينات التي تتكون من TRF-1 و TRF-215 ، والتي ثبت أنها تتفاعل مع التيلوميرات26. هناك بعض الأسباب المحتملة لهذه التناقضات. أولا ، قد يكون القياس المتكافئ لربط Stat1 بمحفز IRF-1 منخفضا جدا. من المعقول أن enChIP-MS ، بما في ذلك enChIP-SILAC ، يكتشف البروتينات التي ترتبط بكثرة بالمناطق الجينومية المستهدفة. وبالتالي ، قد يكون تحليل المزيد من الخلايا ضروريا للكشف عن هذه البروتينات. من شأن الزيادات في حساسيات أدوات التصلب العصبي المتعدد أن تساهم أيضا في الكشف الفعال عن البروتينات ذات الارتباط المتكافئ المنخفض. ثانيا ، قد تكون بعض البروتينات ، بما في ذلك Stat1 والملاجئ ، أهدافا صعبة لتحليلات التصلب المتعدد. ثالثا ، في تحليلنا للبروتينات المرتبطة بالتيلومير15 ، ربما تكون بروتينات 3×FLAG-TAL التي تتعرف على التيلوميرات (3×FN-Tel-TAL) قد منعت ارتباط الملاجئ بالتيلوميرات بطريقة تنافسية.

على عكس الصعوبة النسبية في اكتشاف عوامل النسخ المرتبطة بمناطق جينومية معينة باستخدام enChIP ، نجحنا في تحديد المنظمين اللاجينيين مثل إنزيمات تعديل هيستون باستخدام تحليلات enChIP. قد يرجع نجاح هذه التقنية إلى حقيقة أن المنظمين اللاجينيين يرتبطون بمجموعة واسعة من المناطق الجينومية. وبالتالي ، يتوفر المزيد من البروتينات لكل منطقة جينومية للتصلب المتعدد. نظرا لأن المنظمين اللاجينيين معترف بهم بشكل متزايد كأهداف مهمة للأدوية ضد الأمراض المستعصية مثل السرطان ، فإن enChIP سيكون أداة مفيدة لتحديد أهداف الأدوية اللاجينية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدم المؤلفون براءة اختراع على enChIP (اسم براءة الاختراع: "طريقة عزل مناطق جينومية معينة باستخدام جزيئات ربط الحمض النووي التي تتعرف على تسلسل الحمض النووي الداخلي" ؛ رقم براءة الاختراع: PCT/JP2013/74107). H.F. هو عضو في المجلس الاستشاري لشركة Addgene.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم تاكيدا (TF)؛ مؤسسة الزجاج أساهي؛ مؤسسة ميموريال أوهارا (HF)؛ وكوراتا التذكارية هيتاشي علوم والتكنولوجيا (TF وHF)؛ منح في المعونة للعلماء الشباب (B) (# 25830131)، منحة في والمعونة للبحوث العلمية (C) (# 15K06895) (TF)؛ ومنحة في والمعونة للبحوث العلمية في "النسخ الدراجات المجالات المبتكرة (# 25118512 & # 15H01354)، منحة في والمعونة للبحوث العلمية (B) (# 15H04329)، منحة في والمعونة للبحوث الاستكشافية ( # 26650059) و "دعم الجينوم '(# 221S0002) (HF) من وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خدمة توليف gBlockتقنيات الحياةتخليق الجينات بواسطة GeneArt
خدمة توليف gBlockIDT (تقنيات الحمض النووي المتكاملة) gBlocksشظايا
pSIR-neoAddgene51128
pSIR-GFPAddgene51134
pSIR-DsRed-Express2Addgene51135
pSIR-hCD2Addgene51143
TAL خدمة التوليفLife TechnologiesGeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9 / pCMV-7.1Addgene47948
3 & times ؛ FLAG-dCas9 / pMXs-puroAddgene51240
3 & مرات ؛ FLAG-dCas9 / pMXs-IGAddgene51258
3 & مرات ؛ FLAG-dCas9 / pMXs-I2Addgene51259
3 & مرات ؛ FLAG-dCas9 / pMXs-neoAddgene51260
anti-FLAG M2 AbSigma-AldrichF1804
FITC المترافق المضاد ل FLAG M2Sigma-AldrichF4049
DMEM وسيط ل SILACLife Technologies89985يمكن شراء وسيط آخر من Life Technologies
Dialyzed FBS ل SILACLife Technologies89986
L-Lysine-2HCl لتقنيات SILACLife89987للضوء المتوسط
L-Arginine-HCl لتقنيات SILACLife89989للخفيف المتوسط
L-Lysine-2HCl ، 13C6 ل SILACLife Technologies89988للثقيلة المتوسطة
L-Arginine-HCl ، 13C6 ، 15N4 ل SILACLife Technologies89990للثقيلة المتوسطة
الكاملة ، صغيرة ، Rocheالخالي من
تعطيل بالموجات فوق الصوتية UD-201Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & amp المكثفZymo ResearchD5205
Dynabeads-Protein GLife TechnologiesDB10004
RNasin Plus RNase InhibitorPromegaN2611
Isogen IINippon Gene311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050
LTQ Orbitrap VelosThermo Fisher Scientificأحد مكونات نظام nanoLC-MS / MS لتحليل التصلب العصبي المتعدد
nanoLCAdvance ، Michrom Bioresourcesمكون من نظام nanoLC-MS / MS لتحليل MS
HTC-PAL autosamplerتحليلات CTCأحد مكونات نظام nanoLC-MS / MS لتحليل التصلب العصبي المتعدد
الجينات تشخيص EDTA 4693159

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
  2. Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
  3. Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
  4. Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
  5. Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
  6. Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
  7. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  8. Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
  9. Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109(2011).
  10. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
  11. Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273(2013).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26(2014).
  13. Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
  14. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
  15. Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171(2013).
  16. Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084(2014).
  17. Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387(2015).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
  19. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  20. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
  21. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  22. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
  23. Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
  24. Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213(2014).
  25. O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
  26. de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

enChIP TechniqueGenomic Region IsolationCRISPR dCas9 ComplexTAL Protein TaggingChromatin ImmunoprecipitationMass Spectrometry AnalysisRNA Sequencing AnalysisFormaldehyde CrosslinkingSonication FragmentationAnti FLAG Immunoprecipitation

مقالات ذات صلة