Method Article

تحليل يستند الخلوي-Imaging- وتدفق الوظيفة خلية ودورة الخلية في 3D الميلانوما الأجسام الشبه الكروية

DOI:

10.3791/53486

⸱

December 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف طريقتين تكميليتين باستخدام مؤشر دورة الخلية في كل مكان (FUCCI) وتحليل الصور أو قياس التدفق الخلوي لتحديد وعزل الخلايا في المناطق الداخلية G1 المحتجزة والخارجية للكفيريات ثلاثية الأبعاد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم كرويات الورم ثلاثية الأبعاد (3D) في أبحاث السرطان كنموذج أكثر دقة للبيئة المكروية للورم في الجسم الحي ، مقارنة بزراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D). النموذج الكروي قادر على تقليد تأثيرات التفاعل بين الخلية والخلية ، ونقص الأكسجة والحرمان من المغذيات ، واختراق الأدوية. تتمثل إحدى سمات هذا النموذج في تطوير نواة نخرية ، محاطة بحلقة من الخلايا الموقوفة G1 ، مع خلايا متكاثرة على الطبقات الخارجية من الكروية. من المهم في مجال السرطان كيفية استجابة مناطق مختلفة من الكرة الكروية للعلاجات الدوائية وكذلك التلاعب الجيني أو البيئي. نصف هنا استخدام نظام مؤشر دورة الخلية في كل مكان (FUCCI) جنبا إلى جنب مع القياس الخلوي وتحليل الصور باستخدام البرامج التجارية لتوصيف حالة دورة الخلية للخلايا فيما يتعلق بموقعها داخل كرويات الورم الميلانيني. يمكن استخدام هذه الطرق لتتبع التغيرات في حالة دورة الخلية أو التعبير الجيني / البروتين أو قابلية الخلية للحياة في مناطق فرعية مختلفة من كرويات الورم بمرور الوقت وفي ظل ظروف مختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المعروف أن الكروية متعددة الخلايا 3D كنموذج الورم لعدة عقود، إلا أنه في الآونة الأخيرة فقط أنهم جاءوا إلى استخدام أكثر شيوعا نموذجا في المختبر لكثير من السرطانات الصلبة. ويتزايد استخدامها في الإنتاجية العالية شاشات اكتشاف الأدوية كمادة وسيطة بين المجمع ومكلفة والنماذج الحية تستغرق وقتا طويلا وبسيط، وانخفاض تكلفة 2D نموذج أحادي الطبقة 1-6. دراسات في الثقافة 2D غالبا ما تكون غير قادرة على تكرارها في الجسم الحي. نماذج كروي من أنواع عديدة من السرطان قادرة على محاكاة خصائص النمو، والحساسية المخدرات، واختراق المخدرات، والتفاعلات خلية خلية، وتوافر المقيد من الأوكسجين والمواد المغذية وت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. FUCCI تنبيغ والثقافة خلية

  1. FUCCI تنبيغ
    1. إنشاء خطوط الخلايا معربا عن ستابلي FUCCI يبني mKO2-hCdt1 (30-120) وMAG-hGem (1-100) 15 باستخدام الفيروسة البطيئة المشارك تنبيغ كما هو موضح سابقا 7.
      ملاحظة: نظام FUCCI هو الآن متاحة تجاريا.
    2. توليد الحيوانات المستنسخة الفرعية مع مضان مشرق من خلال الفرز وحيدة الخلية. خلايا النوع احدة إيجابية لكلا AG وKO (الأصفر) من خلال مضان خلية تنشيط ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك عدة طرق لإنتاج الأجسام الشبه الكروية الورم، ويستخدم هذا البروتوكول طريقة نمو غير ملتصقة، حيث يتم استزراع الخلايا على أجار أو 3،7،9 الاغاروز الشكل يظهر 1 مثال على كروي C8161 سرطان الجلد بعد 3 أيام على أجار. الكروية C8161 شكل الكروية العادية الحجم التي يبلغ قطرها 500-600 ميكرون (يعني = 565، SD = 19، ن = 3) بعد 3 أيام. خطوط الخلايا سرطان الجلد الأخرى التي ستشكل الكروية وتشمل: WM793، WM983C، WM983B، WM164، 1205lu (الكروية شكلت مع هذا ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حدد تحليل الصور الآلي شبه والداخلية G1 القبض المنطقة كروي، وتنتشر الطبقات الخارجية. هذه الطريقة يمكن أن تستخدم في الكروية الحية باستخدام الجزء البصري، أو في أقسام كروي ثابت، لتحديد التغييرات ليس فقط في دورة الخلية ولكن علامة التعبير (عن طريق المناعي)، موت الخلايا، أو مورفولوجيا الخلايا في هذه المناطق المختلفة. الحركة خلية داخل المناطق كروي مختلفة أيضا أن يكون كميا - إذا تم إضافة الحية متحد البؤر وقت التصوير انقضاء جنبا إلى جنب مع خطوة تحليل الصور تتبع الخلية. حاسمة لتحليل الصور هي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ساهم PerkinElmer في تكاليف النشر.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر السيدة Danae Sharp والسيدة Sheena Daignault على المساعدة الفنية. نشكر الدكتور أتسوشي مياواكي ، RIKEN ، مدينة واكو ، اليابان ، على توفير تركيبات FUCCI ، والدكتورة مينهارد هيرلين والسيدة باتريشيا برافورد ، معهد ويستار ، فيلادلفيا ، لتوفير خطوط الخلايا ، ومرفق التصوير وقياس التدفق الخلوي في معهد Centenary للدعم الفني المتميز. نشكر السيد كريس جونسون والدكتور أندرو بارلو على الدعم الفني لبرامج Volocity. N.K.H. هو زميل كاميرون في معهد أبحاث سرطان الجلد وسرطان الجلد ، أستراليا. K.A.B. هو زميل في معهد السرطان في نيو ساوث ويلز (13 / ECF / 1-39). دبليو دبليو هو زميل في معهد السرطان في نيو ساوث ويلز (11 / CDF / 3-39). تم دعم هذا العمل من خلال منح المشروع RG 09-08 و RG 13-06....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
agarose نقطة انصهار منخفضةLife Technologies16520-050لتقسيم
أجار نبيل   ؛سيجماA5431لصنع الكرويات
الاغاروز للأكروياتفيشر ScientificBP1356-100لصنع الأكروية
0.05٪ تريبسين / EDTALife Technologies25300-054
HBSSLife Technologies14175-103
10٪ فورمالينسيجماHT5014-1CSتحذير: ضار ، أكال. استخدام معدات الحماية الشخصية ، قم & nbsp ؛ لا أبخرة التنفس (افتح في خزانة الدخان).
يعيش / ميتا بالقرب من IRLife TechnologiesL10119
اهتزازالمنتجات التقنية الدولية ، Inc
كوب كولتورThermo-Fisher ScientificSIE936قالب لتقسيم
الدمالكروي SigmaZ359629
لوحة ثقافة الأنسجة 96 جيداInvitroFAL353072
كولاجينازسيجماC5138 
مجهر متحد البؤرLeicaTCS SP5
محلل مقياس التدفق الخلويBecton DickinsonLSRFortessa
volocityPerkinElmerبرنامج التصوير
flowjoقياس التدفقالخلوي Tree Star
Vacuum GreaseSigmaZ273554
MountingMedia Vector مختبراتH1000
FUCCI (المنشآت التجارية) LifeTechnologiesP36238تعداء عابر فقط
مصفاة الخلية 70 &# 956 ؛ مفي المختبرFAL352350
أنابيب مستديرة القاع 5 مل (معقمة)في المختبرFAL352003
أنابيب مستديرة القاع 5 مل (غير معقمة)في المختبرFAL352008
مقياس برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Health....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Melanoma SpheroidsCell Cycle AnalysisFlow CytometryFUCCI SystemConfocal ImagingImage AnalysisCell Position TrackingSpheroid SectioningNecrotic CoreProliferating Cells

Related Articles