الاستنساخ وظيفية باستخدام القيطم نظام التعبير البويضة

Carol Zygar Plautz; Hannah C. Williams; Robert M. Grainger

doi:10.3791/53518

Method Article

الاستنساخ وظيفية باستخدام القيطم نظام التعبير البويضة

DOI:

10.3791/53518

⸱

January 30th, 2016

Carol Zygar Plautz¹ , Hannah C. Williams¹ , Robert M. Grainger²

¹Department of Biology, Shepherd University, ²Department of Biology, University of Virginia

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بويضة Xenopus ونظام غطاء حيواني للتعبير عن استنساخ الجينات القادرة على إحداث استجابة في الأديم الظاهر المختص ، ونناقش تقنيات التحليل اللاحق لهذه الجينات. هذا النظام مفيد في التحديد الوظيفي لمجموعة واسعة من المنتجات الجينية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكل تحديد الجينات المسؤولة عن التحريض الجنيني عددا من التحديات ؛ على سبيل المثال لا الحصر ، قد تكون الجزيئات المفرزة ذات الأهمية منخفضة الوفرة ، وقد لا تفرز ولكنها مرتبطة بخلية (خليات) الإشارة ، أو قد تتطلب وجود شركاء ملزمين أو جزيئات تنظيمية منبع. وهكذا في البحث عن منتجات جينية قادرة على استنباط استجابة حثية مبكرة للعدسة في الأديم الظاهر المختص ، استخدمنا نظام استنساخ التعبير الذي من شأنه أن يسمح بتحديد عوامل paracrine أو juxtacrine بالإضافة إلى البروتينات النسخية أو غيرها من البروتينات التنظيمية. تم حقن برك من mRNA في بويضات Xenopus ، ووضعت الأنسجة المستجيبة مباشرة على البويضات وزراعتها بشكل مشترك. بعد الاستنساخ الوظيفي ل ldb1 من مكتبة (كدنا) لمرحلة اللوحة العصبية بناء على قدرتها على استنباط التعبير عن علامة اللويحة المبكرة للعدسة foxe3 في الأديم الظاهر لغطاء المختص بالعدسة ، قمنا بتمييز نمط تعبير mRNA ، وفحص التقدم التنموي بعد الإفراط في التعبير أو الضربة القاضية ل ldb1. هذا النظام مناسب في مجموعة متنوعة جدا من السياقات حيث يتم البحث عن محفز أو جزيئاته التنظيمية الأولية باستخدام استجابة وظيفية في الأنسجة المختصة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الأساليب الجينية الأمامية لتحديد الجينات ذات الأهمية من خلال وظيفتها أو فقدان الوظيفة^1،2 جزءا لا يتجزأ من فهم أحداث الزخرفة المعقدة في التطور. إلى جانب التقنيات الجينية العكسية القوية المتاحة لمجموعة متزايدة الاتساع من الأنظمة والباحثين^3-5 ، أصبح من الممكن الآن تحديد الجينات التي لها دور وظيفي رئيسي في المسار ثم توضيح هذه الوظيفة على المستوى الخلوي وفي التفاعل مع المنتجات الجينية الأخرى. أحد الأساليب لتحديد الجينات ذات الأهمية الوظيفية والتي أسفرت عن العديد من النتائج الرئيسية في الماضي هو استنساخ التعبير^6،7.

كان هدفنا الأخير⁸ هو تحديد العوامل الحثية المبكرة للعدسة ، حيث ثبت أن الخطوات الأولية في عملية حث العدسة الفقارية تحدث في وقت مبكر من مراحل المعدة. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمنا الأديم الظاهر^{ذو الغطاء} الحيواني 9 المختصين بالعدسة العابرة (المرحلة 11-11.5¹⁰) من أجنة Xenopus كنسيج مستجيب للحث ، والمرحلة السادسة Xenopus البويضة كمصدر لإنتاج العوامل المحفزة.

يعتمد البروتوكول التالي على بروتوكولات الاستنساخ واختيار الأخ لسميث وهارلاند^6،7 ، والتي استخدمها الآخرون أيضا بنجاح^11-13. في نظام التعبير عن البويضات الخاص بنا (الذي تم استخدامه لأول مرة لإنتاج العوامل المحفزة بواسطة Lustig و Kirschner¹⁴) ، يتم اختيار مجموعات من النصوص المحقونة القادرة على التسبب بشكل مباشر أو غير مباشر في إنتاج البويضات لعوامل تثير استجابة حثية للعدسة في الأديم الظاهر للغطاء الحيواني وتحديدها. نظرا لأن النظام مفيد للتعبير عن الجزيئات المحفزة المفرزة مباشرة (يتسبب INHBB mRNA المحقون بالبويضات في تحريض الأديم المتوسط في الأديم الظاهر ذو الغطاء الحيواني^{المختص بالأديم المتوسط 8}) ، فقد توقعنا في الأصل أن يكون إجراء الفحص مفيدا بشكل أساسي لتحديد عوامل paracrine. ومع ذلك ، نظرا لأننا حددنا عاملا نوويا في شاشتنا (ldb1⁸) ، فمن الواضح أنه يمكن استخدام النظام لتحديد مجموعة متنوعة من الجزيئات مثل العوامل التنظيمية النسخية أو الانتقالية ، أو miRNAs ، أو العوامل المساعدة ، أو العوامل المجاورة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية من جامعة فرجينيا رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام.

ملاحظة: يبين الشكل 1 عرضا عاما للإجراءات التجريبية.

1. إعداد البويضات

X. قبل رئيس المورق الإناث مع 150 U من الحوامل ماري المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) أسبوع واحد تقريبا في وقت مبكر من بويضة والعزلة. حقن 1 مل 150 U / مل PMSG في ظهري الليمفاوية الكيس مع 1 سم مكعب محقنة معقمة مع 29 G الإبرة.
إعداد الحلول لحقن البويضة والبويضة والحيوان قبعة الفحص.
1. إعداد كا ⁺⁺ / مغ ⁺⁺ خالية OR2 (OR2-): 82 مم كلوريد الصوديوم، و 2.5 ملي بوكل، 1.5 ملي _نا 2 هبو ₄ و 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.2.
2. إعداد OR2: OR2- زائد 1 ملم CaCl ₂ و 1 ملي MgCl _2.
3. إعداد OCM: 60٪ يبوفيتش L15، 0.4 ملغ / مل BSA، 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، ودرجة الحموضة 7.8.
4. قبلحلج 1X MBS: 88 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم بوكل، 0.7 ملي CaCl _2، 1 ملي MgSO _4، 5 ملي HEPES (درجة الحموضة 7.8)، و 2.5 ملي NaHCO _3.
5. إعداد 3٪ Ficoll في 1X MBS.
6. إعداد 1X حركة عدم الانحياز: 110 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 1 ملي كا (NO ₃₎ _2، 1 ملي MgSO _4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم NaHCO _3، 2 ملي نا ₃ PO _4، ودرجة الحموضة 7.4.
تخدير الأنثى في حل 0،03٪ من إيثيل الملح methanesulfonate 3-أمينوبنزوات (MS222) في 0.1X MBS (أولا حل 0.3 غرام MS222 في 10 مل 95٪ من الإيثانول، ثم تمييع في 1 L 0.1X MBS) عن طريق وضع الضفدع في حل ل 10-15 دقيقة أو حتى لا تستجيب.
1. تأكد من أن التخدير اكتمال التي تحول الضفدع تخدير على ظهرها للتأكد من أنه لا يستجيب (غير كامل الضفادع تخدير تتحرك أطرافه أو تحويل الجسم أكثر من ذلك).
عزل جراحيا شظايا المبيض عن طريق شق البطن خلال الجلد وجدار الجسم مع شفرة مشرط، عزل أنسجة المبيض مع ملقطوالمقص. وضع شظايا المبيض إلى OR2-. إغلاق جدار الجسم مع خياطة 3-0 الحرير على 24 ملم إبرة مقوسة وإغلاق الجلد بشكل منفصل مع نفس الغرز. السماح باستعادة الإناث في 1 غرام / لتر ماء الملح في الماء.
باستخدام ملقط غرامة، أنسجة المبيض المسيل للدموع إلى أقسام صغيرة (10-20 البويضات) قطع ونقل إلى OR2- الطازجة.
شظايا المبيض Defolliculate في 2.0 ملغ / مل كولاجيناز A في OR2- من خلال استثارة بلطف على شاكر لمدة 1 ساعة، ونقل إلى كولاجيناز الطازجة والتحريض على ساعة إضافية واحدة.
غسل البويضات 10 مرات في OR2 [التي تحتوي على الكالسيوم ⁺⁺ / مغ ^++]، ونبذ البويضات أصغر.
غسل البويضات في OCM مرتين ونقل إلى OCM الطازجة. عزل البويضات المرحلة السادسة من حيث الحجم على الفحص البصري وتجاهل غير ناضجة (أصغر) البويضات: البويضات المرحلة السادسة هي أكبر من البويضات غير الناضجة حتى مع تصبغ في نصف الكرة الحيوانية وما يقرب من 1،2-1،4 مم في القطر.
الحفاظ على البويضات في 18-20 ° C طن OCM قبل الحقن. ملاحظة: يمكن استخدام أطباق بتري الاغاروز المغلفة لتقليل التصاق البويضات إلى طبق.

2. حقن مكتبة النصوص

إعداد مكتبة [كدنا اتجاهي ¹⁵ باستخدام الحمض النووي الريبي المستخرج في مرحلة مناسبة للتنمية (على سبيل المثال، لوحة العصبية المرحلة 14 ^10). شراء مكتبة كدنا] أو إنشاء واحد باستخدام مجموعة تجارية في نظرة عامة في الخطوات الأربع التالية.
1. عزل ما يقرب من 5 ميكروغرام مرنا باستخدام منتج لإثراء للبولي (A) + RNA (انظر الجدول المواد) وبعد تعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: النصوص المستخدمة في إنتاج مكتبة [كدنا يجوز تقييد إلى الأنسجة حمل (مثل لوحة العصبية، بعد تسليخ مجهري من النسيج المطلوب)، أو قد تكون من أجنة كاملة في مرحلة معينة.
2. إنتاج كدنا] مع مجموعة تجارية، في أعقاب توجيهات المصنع.
3. Ligate ما يقرب من 20 نانوغرام [كدنا إلى vectoص تضمينها مع مجموعة تجارية أو ناقلات أخرى مناسبة. يتضمن ناقلات البلازميد المناسب تسلسل للاستقرار مرنا مثل 5 "β-غلوبين و 3 بولي (A) تسلسل (pCS2 +، pTnT، pCS105).
4. تحويل ربط إلى الخلايا البكتيرية المختصة باستخدام بروتوكول المورد الموصى بها للتحول الصدمة الحرارية.
  ملاحظة: بدلا من ذلك، مجموعة من إطار القراءة المفتوح (ORFeome) استنساخ متاح تجاريا، ويمكن استخدامه لتوليد النصوص للحقن.
إعداد 10 برك من البلازميدات من ^¹⁰ مارس - 10 أبريل التعقيد ^⁽¹⁰ أبريل - 10 مايو الكلي التعقيد). وهذا يمثل 10 مع لوحات 1000 - 10000 المستعمرات لكل منهما.
1. مكتبة وحة الثقافة على 10 لوحات 15 سم LB-الأمبيسلين، وتنمو 12-18 ساعة عند 37 ج، وجمع المستعمرات من كل بواسطة ضغط لطيف مع رش الزجاج في 7 مل LB.
2. إعداد المخزون الجلسرين من 0.5 مل (إضافة إلى 0.2 مل الجلسرين العقيمة وتخزينها في -20 &# 730؛ C)، واستخدم مل 6.5 المتبقية لإعداد DNA مع المعايير المتاحة تجاريا عدة DNA miniprep التالية توجيهات المصنع.
خطي DNA البلازميد المجمعة (1،0-2،0 ميكروغرام) مع تقييد انزيم الهضم المناسب ¹⁶ في 37 مئوية لمدة 1-1،5 ساعة. عزل DNA خطي مع استخراج الفينول / كلوروفورم تليها هطول الأمطار الإيثانول وإعادة تعليق في الماء فقا لمواصفات عدة RNA البلمرة المستخدمة. توليف الشعور RNA مع مجموعة RNA البلمرة التجارية التالية توجيهات المصنع.
تعد الإبر ل microinjection (باستخدام إبرة مجتذب مع أنابيب الزجاج الشعرية) ما يقرب من 20 ميكرون قطر. قياس نصائح إبرة في المجهر المركب مع ميكرومتر بصري معايرة. ملاحظة: يجب أن تكون إعدادات مجتذب إبرة العزم تجريبيا لإنتاج إبرة مع طرف ما يرام بحيث عندما كسر مع ملقط غرامة تعطي حجم غيض المطلوب.
استعد (دفع الطين إلىطبقة موحدة على الجزء السفلي من طبق) 35 × 10 مم أطباق بتري مع الأخاديد موازية لعقد البويضات في المكان خلال microinjection مبطنة الطين. إنتاج الأخاديد مع لجنة التحقيق مول أو ماصة باستير تنصهر في الطرف في اللهب. كبديل للطين، وإعداد أطباق الاغاروز مما يجعل المسافات البادئة مع قالب المطاط الصناعي ^17. نقل البويضات مع ماصة واسعة الجوف إلى 3٪ Ficoll في 1X MBS (حوالي 2 مل) في الصفوف في أطباق مبطنة الطين.
باستخدام microinjector، وملء إبرة مع 1 نانوغرام / RNA نيكولا لانغ وضبط التوازن لإنتاج ضغط إيجابي طفيف (لمنع وضع بويضة من السيتوبلازم).
حقن البويضات مع ما يقرب من 20 RNA نيكولا لانغ في المنطقة الاستوائية. السماح 1 ساعة لحقن البويضات للبقاء في Ficoll MBS-ثم نقل بلطف ل1X MBS. احتضان لمدة 8-24 ساعة عند 20 درجة مئوية قبل الغطاء الحيواني الفحص.

3. الحيوان كاب الفحص

إعداد 3 / 4X حركة عدم الانحياز والحصول على ملقط غرامة، حلقة الشعر، شظايا ساترة المنحنية، ديس مبطنة الطين[هس مع المسافات البادئة على شكل كوب لعقد البويضات. جعل شظايا ساترة المنحنية التي تفكك coverslips الزجاج إلى أجزاء صغيرة (حوالي 1-2 مم × 2-4 ملم) ومرورا اللهب حتى حواف البولندية وتدلى، وتنتج قطعة المنحني.
تسميد X. المورق البيض ¹⁸ في المختبر من خلال التزاوج أو الطبيعي والثقافة لالمعيدة مراحل (10-11 ساعة بعد الإخصاب في RT) في 0.1X MBS قبل الفرز حسب المرحلة؛ جمع منتصف المعيدة (المرحلة 11-11،5) ¹⁰ الأجنة.
ونقل الأجنة إلى طبق بتري ما يقرب من نصف كامل مع 3 / 4X حركة عدم الانحياز. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، وإزالة الإخصاب (المحي) غشاء من gastrulae.
نقل البويضات إلى 3 / 4X NAM (حوالي 2 مل) في أطباق مبطنة الطين وشل في عدد مرات الظهور الفردية في الطين، وإنتاج الانطباعات لاستيعاب الأجنة الفردية كما وصفت الأخاديد أعلاه.
ونقل الأجنة إلى أطباق مبطنة الطين وقطع القبعات الحيوان ز قبالةastrulae باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة. احرص على عزل سقف الأديم الظاهر الحيوانية فقط وليس الأنسجة الاستوائية ^18.
وضع الغطاء الحيواني في نصف الكرة الحيوانات من كل بويضة مع السطح الداخلي للغطاء الحيوان الاتصال البويضة. عقد recombinants معا من خلال تطبيق الزجاج المنحني ساترة جزء والضغط النزولي على الزجاج، تسطيح الأديم الظاهر مثل الاتصالات ساترة الطين (القبعات الحيوان يمكن أن تظل مفتوحة مع الطبقة الداخلية تتعرض لسطح البويضة ل6-8 ساعة أو أكثر ).
ملاحظة: بدلا من ذلك، ضع الغطاء الحيواني الى تسنن الطين مع سطحه الداخلي التي تواجه صعودا ووضع البويضة على الغطاء. تأمين المؤتلف مع ملحقات صغيرة من الطين.
الثقافة عند 20 درجة مئوية حتى الأجنة السيطرة تصل إلى المستوى المطلوب للمرحلة الفحص.
المؤتلف منفصل عن طريق إزالة ساترة / الطين وعزل الأديم الظاهر مع ملقط وحلقة الشعر.
إصلاح شظايا الأدمة لمدة 1 ساعة في MEMFA (3.8٪الفورمالديهايد في MEM [0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.4، 2 مم EGTA، و 1 ملي MgSO _4]).
شظايا نقل (والأجنة السيطرة) من MEMFA إلى إيثانول وتخزينها في -20 مئوية.

4. تحليل الاستجابة في الأدمة من قبل في الموقع التهجين (ISH)

إعداد الحلول لISH.
1. إعداد برنامج تلفزيوني 1X: 0.01 M الفوسفات مخزنة المالحة، كلوريد الصوديوم 0.138 M، ودرجة الحموضة 7.4
2. إعداد برنامج تلفزيوني توين (PTW) ما يلي: 1X PBS، 0.1٪ توين-20
3. يعد حل 100X Denhart في: 2٪ BSA، 2٪ بوفيدون، 2٪ Ficoll
4. إعداد التهجين العازلة: 50٪ الفورماميد، 5X SSC، 1 ملغ / مل بالمستخفيات الخميرة RNA، 1 ميكروغرام / مل الهيبارين، والحل 1X Denhart، وبنسبة 0.1٪ 0.1٪ CHAPS، 10 ملي EDTA توين-20، DEPC-H _{2 O}
5. إعداد حمض المالئيك العازلة (MAB): 100 ملم حمض الماليك، 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5
6. إعداد MAB + كتلة: MAB، 2٪ عرقلة كاشف (الحرارة إلى 60 مئوية إلى حل)
7. إعداد الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) العازلة: 100 ملي تريسدرجة الحموضة 9.5، 50 ملي MgCl _2، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ توين، درهم _{2 O}
إعداد RNA التحقيق.
1. استخدام عدة RNA البلمرة التجارية وحفر-NTP المزيج، إضافة إلى أنبوب 1.5 مل (50 ميكرولتر رد فعل): 25.5 ميكرولتر DEPC-H ₂ O، 10 ميكرولتر 5X النسخ الاحتياطي، 2.5 ميكرولتر 10X حفر-NTP المزيج، 5 ميكرولتر 100 ملي DTT، 2 ميكرولتر RNAsin، 2 ميكرولتر قالب DNA خطي (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر)، 3 ميكرولتر RNA البلمرة واحتضان 37 مئوية لمدة 90 دقيقة.
2. إضافة 2 ميكرولتر RNA البلمرة واحتضان 37 مئوية لمدة 60 دقيقة.
3. تحقق 2 ميكرولتر من رد فعل على 1٪ agarose هلام.
4. إضافة 1 ميكرولتر RQ1-ريبونوكلياز مجانا الدناز واحتضان 37 مئوية لمدة 20 دقيقة.
5. يعجل التحقيق بإضافة 50 ميكرولتر DEPC-H ₂ O، 25 ميكرولتر 10 M الأمونيوم خلات و 313 ميكرولتر الايثانول. مخزن في -20 مئوية خلال الليل (يا / N) ثم استعادة RNA بواسطة الطرد المركزي في 13800 x ج لمدة 20 دقيقة. يغسل مع 500 ميكرولتر الايثانول 75٪، وتدور لفترة وجيزة، وإزالةالإيثانول والسماح بيليه الهواء الجاف. إضافة 50 ميكرولتر DEPC-H ₂ O.
6. إضافة التهجين العازلة للتركيز النهائي من ~ 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
إعداد الأنسجة لالتهجين. ما لم يذكر خلاف ذلك، وملء قارورة إلى الأعلى مع كل تغيير الحل هو موضح (حوالي 4 مل).
1. إزالة الإيثانول من قوارير ونقل الأجنة إلى 75٪ من الإيثانول / PTW، ثم 50٪ من الإيثانول / PTW لمدة 10 دقيقة لكل منهما، أفقيا على الروك.
2. يغسل ثلاث مرات في PTW لمدة 5 دقائق كل يوم الروك.
3. نقل إلى 10 ميكروغرام / ميكرولتر بروتين K العلاج في PTW. أنابيب الصخور عموديا 15 دقيقة.
4. شطف مرتين كل 10 دقيقة في 0.1 M ترايثولامين درجة الحموضة 7.8 - أنابيب الصخور عموديا.
5. إضافة 12.5 ميكرولتر أنهيدريد الخل إلى أنابيب والصخور عموديا 5 دقائق. كرر مع إضافي 12.5 ميكرولتر أنهيدريد الخل لمدة 5 دقائق.
6. يغسل في PTW 5 دقائق عموديا على الروك.
7. Refix في 4٪ امتصاص العرق 20 دقيقة على الروك. الحرارة التهجين العازلةإلى 60 مئوية.
8. يغسل ثلاث مرات في PTW لمدة 5 دقائق كل يوم الروك.
9. إزالة كافة ولكن ~ 1 مل من PTW من كل أنبوب وإضافة 250 ميكرولتر HYB العازلة. دوامة بلطف أنابيب لخلط. أنابيب الصخور عموديا 5 دقائق.
10. استبدال 60 ج HYB العازلة (0.5 مل)، وتستنهض الهمم بلطف في 60 ج 10 دقيقة. استبدال الطازجة HYB العازلة وتستنهض الهمم في 60 ج سنتين إلى 4 ساعات.
11. مسبار الحرارة (1 مل عند 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر في HYB الواق) إلى 60 ج (3 دقائق). إزالة HYB العازلة وإضافة التحقيق لأنابيب. تستنهض الهمم بلطف O / N عند 60 مئوية.
إعداد الأنسجة لجسم.
1. دافئ HYB العازلة و2X SSC + 0.1٪ توين-20 حلول ل60 مئوية.
2. استبدال حل التحقيق مع HYB العازلة (حفظ تحقيقات في -20 مئوية لمدة 2 - 3X إعادة الاستخدام). يغسل في 60 مئوية لمدة 10 دقيقة.
3. يغسل ثلاث مرات في 60 مئوية في 2X SSC-توين (20 دقيقة لكل منهما مع الإثارة).
4. يغسل ثلاث مرات في 60 مئوية في 0.2x SSC-توين (20 دقيقة لكل منهما مع الإثارة).
5. يغسل مرتين في MAB (RT) لمدة 15 دقيقة لكل منهما أفقيا على الروك.
6. إضافة 1 مل MAB + كتلة. غسل 2 ساعة عموديا على الروك.
7. نقل إلى 1 مل MAB + كتلة تحتوي على 1/2000 لمكافحة digoxygenin-AP. صخرة عموديا في 4 CO / N.
إعداد الأنسجة لاللون الكاشف.
1. استبدال حل الأجسام المضادة مع MAB؛ يغسل ثلاث مرات في MAB 5 دقائق كل أفقيا على الروك.
2. يغسل ثلاث مرات في MAB 1 ساعة كل أفقيا على الروك.
3. يغسل مرتين في AP العازلة 10 دقيقة كل أفقيا على الروك.
4. نقل الأنسجة لعدة جيدا علبة من البلاستيك، وإزالة AP العازلة وإضافة BM كاشف الأرجواني (~ 1 مل). السماح رد فعل على المضي قدما في الظلام 5 دقائق لO / N.
5. عندما يتحقق تلطيخ المناسب، ونقل الأنسجة إلى قارورة من PTW. غسل مرتين كل 10 دقيقة في PTW على الروك.
6. إصلاح في حل بوان في 4 CO / N على الروك.
7. تغسل في بوين مع ثلاثة الايثانول 70٪ / 30٪ PTW يغسل في RT. المضي قدما رس التقاط الصور باستخدام برنامج التحصين الموسع في الإضاءة والكاميرا محمولة على المجهر، وتبيض إذا لزم الأمر ^18.

5. السيب اختيار والاستنساخ

حدد التجمع مع أعلى نشاط (أعظم استجابة في أنسجة الأدمة).
عاير (تمييع مع LB الكثافة المناسبة) الأسهم الجلسرين لتجمع وفقا لأعلى نشاط ولوحة من لوحات عشر الجديدة مع ما يقرب من واحد على عشرة المستعمرات من الخطوة السابقة (باستخدام الجزء 2 في بروتوكول أعلاه).
تقليل حجم تجمع حتى يتم تتبع النشاط إلى مستعمرة واحدة.
الحصول على تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات القياسية في ناقلات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ردا على التعبير مرنا حقنها في البويضات، والاستجابة الأنسجة الغطاء الحيواني ويعاير للتعبير عن otx2 بواسطة التهجين الموضعي (الشكل 2 والجدول 1) في؛ وأعرب otx2 في الأديم الظاهر عدسة الظني (PLE) من العصبية إغلاق الأنبوب من خلال عدسة اللوحاء سماكة ^19. ومع ذلك، منذ يتم التعبير عن otx2 أيضا في الأديم الظاهر العصبي الأمامي وكذلك غير العصبي رئيس الأديم الظاهر خارج PLE، ويرتبط ذلك مع كل ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة الموضحة هنا لاستنساخ وظيفي من الجينات قادرة على إحداث استجابة في الأديم الظاهر المختصة يمكن أن تستخدم لتحديد مجموعة واسعة من المنتجات الجينات. توسع هذه الطريقة على عمل في الماضي من خلال الجمع بين المقايسات الذي يحفز الأنسجة مع تقنيات الاستنساخ التعبير. نحن الاستفادة من المسارات الأيضية من البويضة القيطم كمصدر للإنتاج يحفز عوامل، بشكل مباشر أو غير مباشر، بعد حقن الحمض النووي الريبي. هذا، جنبا إلى جنب مع استخدام الأساليب التي أنشئت لاستنساخ الجينات في المصالح ^6...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة التطوير المهني ل C.Z.P. من مؤسسة جامعة الراعي. يود المؤلفون أن يشكروا بريت زيركل وماليا ديسهوتيل على المناقشات المفيدة حول البروتوكولات ، والدكتورة كارول هورني على المساعدة السخية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 دراسات نمو الأجسام المضادة	بنك الورم الهجين	12/101	الجسم المضاد أحادي النسيلة للكشف عن الأنسجة العضلية
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	ل
ISH أنهيدريد الخليك	Sigma	A6404	ل ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	ل ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	تنقية الحمض النووي البلازميد
كاشف حجب	Roche	11096176001	ل ISH
BM Purple	Roche	11442074001
لفرن تهجين ISH Boekel	فيشر Scientific	13-245-121	لحل
ISH Bouin Sigma		HT10132	ل ISH
BSA	Sigma	A9647	ل OCM
CHAPS	Sigma	C3023	ل ISH
كولاجيناز 10103578001	Roche		إزالة البويضات
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly الأجنة
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	ل ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	لمجسات
ISH Dumont # 5 ملقط	World Precision	Instruments 500233	لمغلف Vitelline إزالة
إيثيل 3-أمينوبنزوات	سيجما	A5040	MS222 مخدر
فيكول PM 400	سيجما	F4375	لوسائط الحقن
فورماميد	سيجما	F9037	ل ISH
كبريتات الجنتاميسين	سيجما	G1914
للشعيرات الدموية الزجاجية	أدوات الدقة العالمية	4878	3.5 بوصة طويلة ، I ، D ، 0.530 مم
قوارير عينة زجاجية	فيشر Scientific	06-408B	ل ISH
حلقة			الملصقة في ماصة باستور للتلاعب بالأنسجة
الصوديوم الهيبارين	Sigma	H4784	لحاقن ISH
Nanoliter 2010	أدوات الدقة العالمية	Nanoliter 2010	حاقن دقيق يتم التحكم فيه بواسطة المعالج
الدقيق Instant Ocean	ملح حوض السمك Carolina	972433	لاستعادة الضفدع
IRBG XGC Xenopus تم التحقق من كام كامل الطول cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	مكتبة cDNA
ألواح LB Agar مع 100 & micro ؛ جم / مل أمبيسلين	Teknova	L5004	150 مم ألواح LB-Amp مسببة مسبقا لاختيار الأخت
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB لجمع المستعمرات في اختيار الأخ من الألواح وتخفيف الثقافات
طقم عزل الحمض النووي الريبي المرسال المغناطيسي	New England BioLabs	S1550S	لعزل حمض الماليك الحمض النووي الريبي المخصب بالبولي (A)
	Sigma	M0375	ل ISH
يدوي Microfil Micromanipulator	العالم أدوات الدقة	M3310R	دليل micromanipulator
خلاط الجوز	فيشر العلمي	22-363-152	الروك ل ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay للحقن وتشريح أطباق
الفوسفات المخزنة الملحية	Sigma	P5368	ل ISH
PMSG	Sigma	G4877	لتحفيز نمو البويضات
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	ل ISH
مجتذب قابل للبرمجة	أدوات الدقة العالمية	PUL-1000	مجتذب إبرة ماصة
دقيقة Proteinase K	Sigma	P6556	ل ISH
pTnT ناقلات	Promega	L5610	مكتبة cDNA بناء
Riboprobe نظام الجمع بين	Promega	P1450	في المختبر النسخ
فوق الطول كامل الطول مكتبة cDNA بناء كيت	تقنيات الحياة	18248013	كيت لبناء مكتبة (كدنا
) خيوط ، 3-0 حرير	فيشر العلمي	19-037-516	خيط وخيط خياطة لإزالة ما بعد البويضات
Torula RNA	Sigma	R3629	ل ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	ل ISH
Tween 20	Sigma	P9416	ل ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis	Promega	C4360	مجموعة بديلة لبناء مكتبة (كدنا
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultra Efficiency Cells	Agilent Technologies	200150	الخلايا لتحويل (كدنا) مكتبة

OCM الشعر ملح System )

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).
Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

الاستنساخ وظيفية باستخدام القيطم نظام التعبير البويضة

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles