مقالة منهجية

Radiolabeling والكمي لمستويات الخلايا من Phosphoinositides التي كتبها التلألؤ تدفق عالية الأداء اللوني السائل الديناميكي

DOI:

10.3791/53529

⸱

يناير 6, 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phosphoinositides محت الدهون التي تتغير بسرعة استجابة للمؤثرات المختلفة وفرة نسبية. توضح هذه المقالة طريقة لقياس وفرة phosphoinositides التي وصفها أيضي الخلايا مع 3 H- ميو -inositol، تليها استخراج وdeacylation. ثم يتم فصل استخراج glycero-inositides بواسطة عالية الأداء اللوني السائل وكميا بواسطة التلألؤ التدفق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phosphoinositides (PtdInsPs) هي إشارات أساسية للدهون المسؤولة عن تجنيد مؤثرات محددة ومنح عضيات ذات هوية جزيئية ووظيفة. يختلف كل من PtdInsPs السبعة في توزيعها ووفرة ، والتي يتم تنظيمها بإحكام بواسطة كينازات وفوسفاتيز محددة. يمكن أن تتغير وفرة PtdInsPs فجأة استجابة لأحداث الإشارات المختلفة أو اضطراب الآلية التنظيمية. لفهم كيف تؤدي هذه الأحداث إلى تغييرات في كمية PtdInsPs وتأثيرها الناتج ، من المهم تحديد مستويات PtdInsP قبل وبعد حدث الإشارات أو بين التحكم والظروف غير الطبيعية. ومع ذلك ، نظرا لقلة وفرة وتشابهها ، قد يكون تحديد الكميات النسبية لكل PtdInsP أمرا صعبا. توضح هذه المقالة طريقة لقياس مستويات PtdInsP عن طريق وضع العلامات الأيضية على الخلايا باستخدام 3H-myo-inositol ، والذي تم دمجه في PtdInsPs. ثم يتم ترسيب الدهون الفوسفورية وإزالة الأسيل. يتم استخراج 3H-glycero-inositides الناتجة عن طريق اللونيات السائلة عالية الأداء (HPLC) ، ويتم اكتشافها عن طريق تلألؤ التدفق. يتم وصف وضع العلامات على عينات الخميرة ومعالجتها بالتفصيل ، بالإضافة إلى الإعداد الآلي ل HPLC وميض التدفق. على الرغم من فقدان المعلومات الهيكلية المتعلقة بمحتوى سلسلة acyl ، إلا أن هذه الطريقة حساسة ويمكن تحسينها لتحديد جميع PtdInsPs السبعة في الخلايا بشكل متزامن.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phosphoinositides (PtdInsPs) هي إشارات فوسفوليبيدات مهمة تساعد في تنظيم مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية ، بما في ذلك نقل الإشارات والاتجار بالغشاء والتعبير الجيني ، والتي تعدل بعد ذلك سلوك الخلية ذات الترتيب الأعلى مثل انقسام الخلية وهوية العضية والنشاط الأيضي1-3. هناك سبعة أنواع من PtdInsPs المشتقة من فسفرة 3, 4, و / أو 5 مواقف من مجموعة رأس الإينوزيتول من فوسفاتيديلينوسيتول (PtdIns), الفوسفوليبيد الأم. الأهم من ذلك ، أن PtdInsPs السبعة موزعة بشكل غير متساو ويمكن أن يزيد التركيز المحلي لكل نوع من أنواع PtdInsP أو ينخفض في مواقع فرعية محددة حيث ترتبط بمجموعة مميزة من تأثيرات البروتين ، والتي تسمح معا لكل PtdInsP بالتحكم في هوية ووظيفة الغشاء المضيف3،4. بالإضافة إلى ذلك ، يجب التحكم بإحكام في مستويات كل PtdInsP لأن هذا يمكن أن يؤثر بشكل كبير على شدة الإشارة التي ينتجها PtdInsP. يعتمد توطين ومستويات كل PtdInsP على استهداف ونشاط العديد من كينازات الدهون والفوسفاتيز والفوسفوليباز التي تتوسط في تخليق ودوران كل PtdInsP3،4. وبالتالي ، فإن سوء تنظيم الآلية التنظيمية PtdInsP يمكن أن يزعج وظيفة الخلية ، مما يؤدي إلى أمراض مثل السرطان والأمراض التنكسية2،5،6. لفهم أدوار ووظائف PtdInsPs وآلياتها التنظيمية بشكل كامل ، تم تطوير كل من التقنيات القائمة على الفحص المجهري والقائمة على الكيمياء الحيوية لتتبع وقياس PtdInsPs.

في كثير من الحالات ، ترتبط PtdInsPs بمؤثرات البروتين الخاصة بها عبر مجال بروتيني معين7-9. غالبا ما تحتفظ وحدات البروتين هذه بخصائص التعرف على الدهون والطية المناسبة عند التعبير عنها بشكل منفصل عن البروتين بأكمله. أدى هذا إلى ظهور مجسات PtdInsP عن طريق دمج مجال بروتين محدد مرتبط ب PtdInsP مع بروتين فلوري (FP) مثل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) للكشف عن الخلايا الفرعية ل PtdInsPs عن طريق الفحص المجهري. في الواقع ، استخدمت العديد من الدراسات وحدات البروتين المرتبطة ب PtdInsP المدمجة FP لتحديد توطين وديناميكيات أنواع معينة من PtdInsP عن طريق تصوير الخلايا الحية1،10. على سبيل المثال ، يتعرف مجال تماثل Pleckstrin (PH) للفوسفوليباز C δ1 (PLCδ1) المدمجة في GFP على وجه التحديد على فوسفاتيديلينوسيتول-4،5-ثنائي الفوسفات [PtdIns (4،5) P2] على غشاء البلازما ، في حين تم استخدام نسخ ترادفية من مجال FYVE لمستضد الجسيم الداخلي المبكر 1 (EEA1) لتتبع فوسفاتيديلينوسيتول-3-فوسفات (PtdIns3P) على الجسيماتالداخلية 10-13. بشكل عام ، تعد التقنيات القائمة على الفحص المجهري رائعة لتصور توطين وديناميكيات PtdInsP ، ولكن هناك العديد من المحاذير بما في ذلك أن مجالات ربط PtdInsP قد تتفاعل أيضا مع عوامل إضافية بخلاف أنواع PtdInsP المستهدفة وأنها لا تستطيع اكتشاف التغييرات أسفل التألق العصاري الخلوي لمجسات FP.

يمكن أيضا استخدام تقنيات

بما في ذلك كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة وقياس الطيف الكتلي ووضع العلامات على النظائر المشعة لتوصيف وتحديد مستويات كل PtdInsP14-16. تتطلب هذه الطرق عزل الدهون للكشف عن المستويات الخلوية ل PtdInsPs. يمكن استخدام قياس الطيف الكتلي لتوصيف الدهون الفوسفورية من مستخلصات الدهون وهو لا يقدر بثمن لتحديد تكوين سلسلة الأسيل ل PtdInsPs14،17. ومع ذلك ، فإن قياس الطيف الكتلي هو في الغالب شبه كمي ولا يزال من الصعب حل أنواع PtdInsP من نفس الوزن الجزيئي14،17 وتحديدها بشكل متزامن. وبالمقارنة ، فإن وضع العلامات على النظائر المشعة ل PtdInsPs متبوعا بتلألؤ التدفق المقترن بالكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) مفيد للفصل والقياس الكمي المتزامن لجميع الأنواع السبعة من PtdInsPs18. يحقق استخدام HPLC مع عمود تبادل أنيون قوي (SAX) الفصل بناء على الوزن الجزيئي والشحنة والشكل ، وبالتالي تجزئة PtdInsPs منزوعة الأسيلة (Gro-InsPs) حتى من نفس الوزن الجزيئي والشحنة. يؤدي اقتران مادة HPLC إلى وميض التدفق بعد ذلك إلى إنشاء قمم إشارة مشعة لكل نوع من أنواع Gro-InsPs بالنسبة إلى الجلسرين والإينوزيتول الأصلي الأصلي (Gro-Ins) 18. هذا يتوافق في النهاية مع المستويات النسبية ل PtdInsPs في الخلايا.

يعد وضع العلامات الراديوية ل PtdInsPs وميض التدفق المقترن ب HPLC أداة مفيدة للتحقيق في تنظيم ووظيفة الفوسفاتيديلينوسيتول 3،5-ثنائي الفوسفات [PtdIns (3،5) P2] ، وهو PtdInsP الذي يشكل فقط ~ 0.1-0.3٪ من PtdIns16،19،20. يتم إجراء تخليق PtdIns (3،5) P2 بواسطة PtdIns3P 5-kinase المسمى Fab1 في الخميرة و PIKfyve في الثدييات21. يتم مواجهة هذا التفاعل بواسطة PtdIns (3،5) P2 5-phosphatase يسمى Fig4 في الخميرة أو mFig4 / Sac3 في الثدييات22-24. ومن المثير للاهتمام ، أن كلا من PIKfyve / Fab1 و mFig4 / Fig4 / Sac3 موجودان في مجمع واحد ويتم تنظيمهما بواسطة بروتين محول السقالات ، Vac14 في الخميرة أو mVac14 / ArPIKfyve في الثدييات25،26. في خلايا الخميرة المحذوفة من VAC14 ، لا يعمل Fab1 بكفاءة مما يؤدي إلى انخفاض بنسبة 90٪ في مستويات PtdIns (3،5) P2 27،28. من ناحية أخرى ، Atg18 هو بروتين مستجيب PtdIns (3،5) P2 قد يتحكم في الانشطار الفراغي 29. Atg18 هو أيضا منظم سلبي ل PtdIns (3،5) P2 نظرا لأن حذف جيناته ، ATG18 ، يتسبب في زيادة 10 إلى 20 ضعفا في مستويات PtdIns (3،5) P2 29،30. بشكل عام ، تؤثر التغييرات في مستويات PtdIns (3،5) P2 بشدة على وظيفة فجوة الخميرة وجسيمات الحالة للثدييات ، وبالتالي تؤثر على عمليات مثل الاتجار بالغشية ، ونضج البلعمة ، والالتهام الذاتي ونقل الأيونات 6،19،21،31.

تصف هذه المقالة عملية وضع العلامات على النظائر المشعة ل PtdInsPs مع 3H-myo-inositol في الخميرة للكشف عن المستويات النسبية ل PtdIns (3،5) P2 في سلالات الخميرة من النوع البري ، vac14Δ و atg18Δ. باستخدام هذا كمثال ، يتم عرض قدرات حل HPLC لفصل PtdInsPs الفردية بالإضافة إلى حساسية تلألؤ التدفق للكشف عن كمية ضئيلة من 3H-myo-inositol. نوضح أيضا كيف يمكن للمرء تحسين منهجية وضع العلامات على 3 PtdInsPs المسمى H وفصلها عن خلايا الثدييات ، والتي تميل عيناتها إلى أن تكون أكثر تعقيدا لأن هذه الخلايا تمتلك جميع أنواع PtdInsP السبعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يصف النص أدناه بالتفصيل طريقة لقياس PtdInsPs في الخميرة. لأنها توفر تفاصيل التجريبية لخلايا وضع العلامات الخميرة مع 3 H- ميو -inositol، واستخراج وdeacylating الدهون وبروتوكول HPLC-شطف إلى يجزئ وتحديد PtdInsPs deacylated. يرجى ملاحظة أن وضع العلامات، وdeacylation، القرار النوعي والكمي لPtdInsPs في خلايا الثدييات تتطلب التحسين وأطول ملامح HPLC-شطف. هذه التفاصيل يمكن العثور عليها في أي مكان آخر، على الرغم من أننا نناقش بعض الجوانب في مناقشة. وعموما، فإن منهجية لاستخراج الدهون، deacylate واستخراج للذوبان في الماء غرو-InsPs من تعطى الخميرة وهو موضح في الشكل 1.

1. بروتوكول لوصفها وتحليل PtdInsPs في الخميرة

  1. زراعة الخلايا وradiolabeling
    1. تنمو 20 مل ثقافة السائل من SEY6210 سلالة الخميرة في 30 درجة مئوية مع الهز المستمر في تركيبية كاملةوسائل الإعلام إلى مرحلة سجل منتصف أو الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من حوالي 0،6-0،7.
      ملاحظة: لا تستخدم وسائل الإعلام YPD لأن هذا قد يؤثر على 3 H- ميو -inositol التأسيس. يجب أن هذا الحجم ثقافة توفر مادة كافية لمدة 2-3 أشواط HPLC.
    2. بيليه ما مجموعه 10-14 OD من خلايا الخميرة (لاحظ أن 1 مل الثقافة مع OD 600 = 1 يحتوي ~ 1X10 7 الخلايا) بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق في 12 مل أنبوب الجولة القاع. و resuspend مع 2 مل خالية من إينوزيتول الوسائط (IFM) (انظر الجدول رقم 1 لتكوين IFM).
    3. كرر الطرد المركزي ونضح وسائل الإعلام. resuspend الكرية مع 440 ميكرولتر من IFM واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة.
    4. إضافة 60 ميكرولتر من 3 H- ميو -inositol (1 ميكرولتر = 1 μCi) لكل عينة ويحضن في درجة حرارة متزايدة من 30 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعة مع الهز المستمر.
      الحذر: 3 H- ميو -inositol هي رفيقة المشعالريال التي ينبغي التعامل معها بعد التدريب المناسب. بالإضافة إلى ذلك، جميع المواد الاستهلاكية التي تجعل الاتصال مع 3-H التي تحتوي على مواد يجب التخلص بشكل مناسب وتعيين كنفايات مشعة.
      ملاحظة: يمكن تغيير درجة حرارة النمو كما هو مطلوب طالما كل سلالات يمكن مقارنة تزرع في نفس درجة الحرارة.
    5. نقل تعليق الخلية (500 ميكرولتر) إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على 500 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 9٪ و 200 ميكرولتر من حمض غسلها الخرز الزجاجي. مزيج من قبل قلب واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
    6. دوامة العينة في سرعة قصوى لمدة 10 دقيقة ونقل لست] إلى أنبوب microcentrifuge جديدة باستخدام طرف جل التحميل لتجنب الخرز الزجاجي.
    7. بيليه العينة في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونضح طاف.
    8. resuspend الكرية التي كتبها حمام صوتنة في 1 مل من الجليد الباردة 100 ملم EDTA. بيليه مرة أخرى كما كان من قبل.
  2. Deacylation واستخراج
  3. طازجة إعداد 5.0 مل من كاشف deacylation من خلال الجمع بين 2.3 مل من الميثانول، 1.3 مل من 40٪ ميثيل، 0.55 مل من 1-بيوتانول و0.80 مل من الماء. عكس إلى المزيج.
  4. نضح EDTA ويصوتن بيليه في 50 ميكرولتر من الماء.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من كاشف deacylation ويصوتن لخلط. في احتضان RT لمدة 20 دقيقة.
  6. الدهون الحرارة لمدة 50 دقيقة في 53 درجة مئوية في كتلة الحرارة. تجفيف العينات تماما من فراغ الطرد المركزي أكثر من 3 ساعات أو O / N.
    1. تأكد من تركيب مصيدة الكيميائية بين فراغ الطرد المركزي ومضخة فراغ لمنع الأبخرة من دخول الهواء.
  7. resuspend الكرية مع 300 ميكرولتر من الماء عن طريق حمام صوتنة واحتضانها في RT لمدة 20 دقيقة. تجفيف العينات التي كتبها فراغ الطرد المركزي لمدة 3 ساعات أو O / N. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  8. يصوتن بيليه مع 450 ميكرولتر من الماء. هذه هي المرحلة المائية أثناء الاستخراج.
  9. طازجة إعداد 10 مل من extractioن كاشف عن طريق إضافة 8.0 مل من 1-بيوتانول، 1.6 مل من الأثير إيثيل و 0.40 مل من اثيل فورمات. عكس إلى المزيج.
  10. إضافة 300 ميكرولتر من كاشف استخراج إلى المرحلة المائية. دوامة الخليط في سرعة قصوى لمدة 5 دقائق وفصل طبقات بواسطة الطرد المركزي في سرعة قصوى (18000 x ج) لمدة 2 دقيقة.
  11. جمع طبقة مائية أسفل في أنبوب microfuge جديدة مع تجنب الطبقة العليا العضوية، واجهة، وبيليه. كرر استخراج المرحلة المائية مرتين أكثر مع كاشف استخراج الطازجة.
  12. تماما تجف الطبقة المائية التي جمعتها فراغ الطرد المركزي. تفريق بيليه في 50 ميكرولتر من الماء عن طريق حمام صوتنة.
  13. إضافة 2 ميكرولتر من كل عينة إلى 4 مل من السائل التلألؤ في 6 مل البولي ايثيلين التلألؤ القارورة. تحديد عدد من التهم (في CPM) في كل عينة عن طريق التلألؤ السائل باستخدام نافذة مفتوحة.
  14. تخزين العينات في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للHPLC.
  • فصل3 H-glycero inositides من قبل HPLC
    1. إعداد العازلة A من خلال تصفية 1 لتر من الماء عالى النقاء مع زجاجة كبار مرشح 0.22 ميكرون فراغ، تليها التفريغ.
    2. إعداد العازلة B بجعل حل 1 لتر من 1 M فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة (APS، MW 132.06) في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 3.8 مع حمض الفوسفوريك. تصفية فوسفات الأمونيوم مع زجاجة كبار مرشح 0.22 ميكرون فراغ، تليها التفريغ.
    3. تجميع قنينة حقن عن طريق تجهيز 2 مل قارورة مع 250 ميكرولتر حجم صغير إدراج بنابض. تحميل 10 ملايين CPM وإضافة الماء لإجمالي حجم 55 ميكرولتر. إعداد قارورة فارغة مع 55 ميكرولتر من الماء.
    4. سقف قارورة مع قبعات المسمار تجهيزه مع حواجز PTFE / سيليكون (تواجه الجانب الأحمر داخل القارورة). وضع كل قارورة في صينية أخذ العينات السيارات من HPLC، بدءا من قارورة فارغة.
    5. استخدام HPLC والبرامج المرتبطة بها والتي تسيطر على تدفق العازلة، degasses مخازن والضوابط عينة injectiعلى. استخدام ماض تدفق الانترنت والبرامج المرتبطة به لتنظيم معدل التدفق scintillant ورصد إشارة 3 H-الاضمحلال.
      1. استخدام ساكس العمود اللوني السائل مع أبعاد 250 ملم × 4.6 ملم وتحتوي على 5 ميكرون الراتنج السيليكا في HPLC. تجهيز العمود مع حارس عمود لمنع حقن من الملوثات.
      2. تثبيت 3 H-متوافقة 500 ميكرولتر خلية تدفق في ماض التدفق.
        ويمكن أن يتم تجزئة مع نظام سلسلة لا نهاية HPLC اجيلنت 1200 التي تسيطر عليها البرنامج لل ChemStation أو مع غيرها من نظم HPLC المتاحة تجاريا: ملاحظة. ويمكن أن يتم التلألؤ تدفق شاطف HPLC مع ماض تدفق β-RAM التي تسيطر عليها البرنامج لورا أو ماض تدفق المتاحة تجاريا آخر أو برنامج متوافق.
    6. تهيئة المضخة الرباعية بمعدل تدفق 1.0 مل / دقيقة مع 100٪ عازلة A.
    7. إعداد ملف تعريف موازنة على HPLCللسيطرة على التدرج من المخازن A و B (نسمي هذا "البروتوكول موازنة"): 1٪ B الاحتياطي لمدة 5 دقائق، 1-100٪ B لمدة 5 دقائق، و 100٪ B لمدة 5 دقائق، 100-1٪ B لمدة 5 دقيقة، 1٪ B لمدة 20 دقيقة. تعيين الحد ضغط 400 بار، 1.0 مل / دقيقة معدل التدفق، و 30 دقيقة وقت التشغيل.
    8. إعداد ملف تعريف شطف (الشكل 2) على HPLC للسيطرة على التدرج من المخازن A و B (نسمي هذا "البروتوكول A"): 1٪ B لمدة 5 دقائق، 1-20٪ B لمدة 40 دقيقة، 20-100٪ B لمدة 10 دقيقة، و 100٪ B لمدة 5 دقائق، 100-1٪ B لمدة 20 دقيقة، 1٪ B لمدة 10 دقيقة. تعيين الحد ضغط 400 بار، 1.0 مل / دقيقة معدل التدفق، و 90 دقيقة وقت التشغيل.
    9. إعداد بروتوكول الكشف على ماض تدفق (نسمي هذا "البروتوكول كشف") لتشغيل لمدة 60 دقيقة، مع التلألؤ السائل معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة وزمن السكون 8.57 ثانية.
    10. برنامج تسلسل حقن الآلي على HPLC لتبدأ المياه فارغة على "بروتوكول A موازنة"، ثم عن طريق البريدمنظمة العمل ضد الجوع radiolabelled العينة على "البروتوكول". تهيئة تسلسل عندما تصبح جاهزة.
    11. في حين المدى لا يزال على بروتوكول موازنة، وخلق دفعة على ماض تدفق لقياس كل من العينات مع "بروتوكول A الكشف." فإن حقن كل عينة جديدة تهيئة "بروتوكول A" على HPLC في حين اثار على ماض تدفق لبدء "بروتوكول A الكشف."
    12. عند الانتهاء من جميع أشواط، تدفق HPLC، العمود وتدفق ماض مع 100٪ العازلة A لمدة 30 دقيقة في 1.0 مل / دقيقة معدل التدفق.
  • تحليل البيانات
    1. استخدام البرمجيات لورا أو أي برامج أخرى التي يمكن قياس أطياف اللوني. وصفت الخطوات الموضحة في هذا القسم في الشكل (3).
    2. فتح الملفات عن طريق النقر على "ملف"، "فتح"، وحدد ملف البيانات الخام لكل عينة.
    3. في "الاستشرابية" علامة التبويب، زويام في لتمتد كل واحدة من قمم أقل (حوالي 1000 التهم [المحور ص]) مع الإبقاء على قرار الوقت. التكبير في كل قمة الفردية إذا لزم الأمر.
    4. تسليط الضوء على كل من قمم للتحليل باستخدام "إضافة ROI" أداة. تحديد القمم التي كتبها وقت شطف: الأبوية غرو الإضافية في 10 دقيقة، وغرو-Ins3P في 18 دقيقة، وغرو-Ins4P في 20 دقيقة، وغرو الإضافية (3،5) P 2 في 29 دقيقة، وغرو الإضافية (4،5 ) P 2 في 32 دقيقة.
    5. في "المناطق الجداول" علامة التبويب، تسجيل "منطقة (التهم)" كل الذروة. لاحظ "بدء (MM: SS)" مرة و "النهاية (MM: SS)" الوقت من كل الذروة.
    6. لالطرح الخلفية، تسليط الضوء على المنطقة المحاذية للالذروة التي تمتد على نفس المقدار من الوقت. طرح عدد من التهم من ذروة المقابلة.
    7. تطبيع مساحة كل ذروة ضد الأبوية غرو الإضافية (التعبير عن "٪ من إجمالي PtdIns"). ثم، وتطبيع كل من قمم في كل حالة تجريبية ضد حالة التحكم (معبرا عنها "نزيادة أضعاف مقارنة للسيطرة على ").
      ملاحظة: يمكن أيضا تطبيع كل قمة أن يتم مقابل مجموع التهم ولكن منذ الأبوية غرو الإضافية هو أكثر وفرة من كل PtdInsPs البعض النتائج تميل إلى أن تكون مماثلة.
    8. تصدير البيانات لتحليل اللون عن طريق الضغط على "ملف"، "حفظ باسم ..."، ثم اختر "CSV (مفصولة بفواصل)" تنسيق الملف. رسم البيانات في جدول وتقديم الضرورة.

    • الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    باستخدام هذا الأسلوب، وصفت PtdInsPs الخميرة عملية الأيض مع 3 H- ميو -inositol. بعد وضع العلامات، وعجلت الدهون الفوسفاتية مع حمض البيركلوريك، تليها deacylation فوسفورية واستخراج غرو-InsPs للذوبان في الماء (الشكل 1). في هذه المرحلة، فمن الأهمية بمكان تقدير مجموع إشارة المشعة المرتبطة استخراج غرو-InsPs التي كتبها التلألؤ السائل لضمان نسبة كافية لPtdInsPs المنخفضة جدا وفرة مثل PtdIns إشارة إلى الضوضاء (3،5) P 2...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    تفاصيل هذه المقالة بروتوكول تجريبي اللازمة لقياس مستويات الخلايا من PtdnsPs كل جانب HPLC تدفق التلألؤ من الخميرة. منهجية تمكن من وضع العلامات الأيضية من PtdInsPs مع 3 H- ميو -inositol، تليها معالجة الدهون واستخراج للذوبان في الماء 3 H-غرو-InsPs، تجزئة HPLC والتحليل. باستخدام هذا الأسلوب، والمستويات النسبية للPtdInsPs في الخلايا تحت مختلف الظروف يمكن كميا، كما هو مبين لPtdIns (3،5) P 2 في البرية من نوع، vac14 D وatg18 D خل...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    C.Y.H. مدعومة بمنحة أونتاريو للخريجين من حكومة أونتاريو. أصبحت هذه المقالة ممكنة بفضل التمويل الذي عقده R.J.B. من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسية وبرنامج كراسي الأبحاث الكندية وجامعة رايرسون.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    1-البيوتانولالبيوبازيكBC1800كاشف الصف
    فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدةBioshopAPD001ACS الصف
    كبريتات الأمونيومالبيوbasicADB0060فائقة النقاء
    الصف AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 سلسلة إنفينيتي
    بيوتينسيجماB4501
    حمض البوريكالبيوبياسيكBB0044البيولوجيا الجزيئية الصف
    كلوريد الكالسيومالبيوبازيكCT1330المائي ، الصف الصناعي
    بانتوثينات الكالسيومسيجماC8731
    كبريتات النحاس (II)سيجما451657اللامائي
    D-الجلوكوزالبيوبياسيكGB0219اللامائي ، تعديل Dulbecco من الدرجة الحيوية
    Eagle's MediumLife11995-065مع 4.5 جم / لتر جلوكوز ، 110 مجم / لتر بيروات ، L-glutamine
    تعديل Dulbecco للطب الحيوي Eagle's MediumMP0916429 مع 4.5 جم / لتر جلوكوز ، بدون L-gluatmine ، بدون إينوزيتول
    EDTABiobasicEB0107خال من الأحماض ، درجة نقاء
    فائقة الإيثيل الأثيرمختبرات كاليدون1/10/4700لامائي ، كاشف فورمات
    إيثيلسيجما112682درجة كاشف
    مصل بقري الجنينWisent080-450من أصل أمريكي ، جودة عالية ،
    مصل بقري الجنين معطل بالحرارة ، حياة غسيلالكلى 26400044الولايات المتحدة المنشأ
    FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05سائل التلألؤ لتلألؤ التدفق   ؛
    حمض الفوليكالبيوبازيكFB0466USP الصف
    HEPES محلول عازلةالحياة156300801 م محلول
    إينوزيتول ، ميو- [2-3H (N)]بيركينإلمر NET114005MC9: 1 الإيثانول إلى الماء
    الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانولامينالحياة51500056محلول 100x
    الحديد (III) كلوريدسيجما157740كاشف الصف
    لورا - برنامج جمع وتحليل بيانات الكروماتوغرافياLabLogic Systems Ltdالإصدار 4.2.1.18برنامج وميض التدفق
    L-glutamineSigmaG7513200  ملي مولار ، محلول ، مفلتر معقم ، BioXtra ، مناسب لزراعة الخلايا
    كلوريد المغنيسيومسيجماM8266
    كبريتات المنغنيزالبيوبازيكMB0334أحادي الهيدرات ،
    الميثانولكاليدون6701-7-40من الدرجة HPLC
    سيجما42646640٪ (حجم / حجم)
    فوسفاتأحادي البوتاسيومبيوبياسيكPB0445لامائي ، ACS
    الصف حمض النيكوتينيكالبيوبياسيكNB0660كاشف الصف
    OpenLAB CSD ChemStation   ؛AgilentRev. C.01.03 برنامج HPLC
    حمض p-aminobenzoic (PABA)BioshopPAB001.100حمض خال
    من البنسلين ستربتومايسينسيجماP4333100X ، سائل ، مستقر ، مفلتر معقم ، تم اختبار ثقافة الخلايا
    حمض البيركلوريكسيجما244252كاشف ACS ، 70٪
    عمود PhenoSpher SAXPhenomenex00G-315-E05 & micro ؛ م ، 80 & Aring ؛ 250 × 4.6 مم
    حمض الفوسفوريكمختبرات كاليدون1/29/8425كاشف درجة
    كلوريد البوتاسيومالبيوبازيكPB0440ACS درجة
    يوديد البوتاسيومالبيوبياسيومPB0443ACS درجة
    البيريدوكسين هيدروكلوريدسيجماP9755
    رباعيةAgilentG1311CAgilent 1260 سلسلة إنفينيتي
    ريبوفلافينبيوشوبRIB333.100USP الصف
    كلوريد الصوديومالبيوبيسكDB0483الحيوية
    الصف موليبدات الصوديومسيجما243655
    مقصورة عمود ترموستاتAgilentG1316AAgilent 1260 سلسلة إنفينيتي
    ثيامين هيدروكلوريدSigmaT4625درجة الكاشف جعل حل 0.02٪ (وزن / حجم) ، يشكل تعليقا. امزج وتجميد aliquots
    Ultima GoldPerkin Elmer6013321Cocintillation Coctail للتلألؤ السائل عد
    كبريتات الزنكالبيوbasicZB2906Heptahydrate ، درجة الكاشف
    & - RAM 4في / الولايات المتحدة أنظمةنموذج 4Flow Wescintillator - 500 & micro ؛ ل خلية التدفق محلل وميض التدفق الإشعاعي البديل بواسطة Perkin Elmer 
    اللامائية مختبرات من الدرجة ACS محلول ميثيل أمين مضخة التكنولوجيا

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
    2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
    3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
    4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
    5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
    6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
    7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
    8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
    9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
    10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
    11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
    12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
    13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
    14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
    15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
    16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
    17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
    18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
    19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
    20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
    21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
    22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
    23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
    24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
    25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
    26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
    27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
    28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
    29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
    30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
    31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
    32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
    33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
    34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
    35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
    36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
    37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
    38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
    39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
    40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
    41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
    42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
    43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    Phosphoinositide QuantificationHPLC Flow ScintillationTritium LabelingYeast Cell AnalysisPhospholipid ExtractionDeacylation ProcedureRadioactive DetectionGradient ElutionPeak IntegrationData Normalization

    مقالات ذات صلة