مقالة منهجية

تقييم مستو خلية-التقاطب الظواهر في Ciliopathy ماوس المسخ القوقعة

DOI:

10.3791/53559

⸱

فبراير 21, 2016

1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤثر الأهداب الأولية على مسارات الإشارات المختلفة. تعتبر قوقعة الثدييات مثالية لفحص إشارات قطبية الخلية المستوية (PCP). يؤثر الخلل الوظيفي الأهدبي على نمو القوقعة ، والزخرفة الخلوية واتجاه خلايا الشعر ، وقراءات PCP. هدفنا هو تحليل إشارات PCP في قوقعة الفأر عن طريق تحليل النمط الظاهري والكيمياء المناعية والفحص المجهري الإلكتروني الماسح.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة ، برزت الأهداب الأولية كمنظمين رئيسيين في التطور والمرض من خلال التأثير على العديد من مسارات الإشارات. كان أحد أقدم مسارات الإشارات التي ثبت أنها مرتبطة بالوظيفة الهدبية هو مسار إشارات Wnt غير المتعارف عليه ، والذي يشار إليه أيضا باسم إشارات قطبية الخلية المستوية (PCP). واحدة من أفضل الأماكن لدراسة تأثيرات إشارات قطبية الخلية المستوية (PCP) أثناء تطور الفقاريات هي قوقعة الثدييات. يعطل اضطراب إشارات PCP في قوقعة الفأر نمو القوقعة والزخرفة الخلوية واتجاه خلايا الشعر ، وكلها تتأثر بخلل الأهداب. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف تحليل إشارات PCP في قوقعة الثدييات النامية عن طريق تحليل النمط الظاهري والكيمياء المناعية والفحص المجهري الإلكتروني الماسح. تتجلى العيوب في التقارب والتمدد على أنها تقصير في قناة القوقعة و / أو التغيرات في الزخرفة الخلوية ، والتي يمكن قياسها بعد التشريح من طفرات الفئران النامية. يمكن ملاحظة التغييرات في اتجاه الحزمة الفراغية وطول الحركية أو تحديد موضعها كميا باستخدام التألق المناعي أو المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). تعد النظرة العميقة لدور البروتينات الهدبية في مسارات الإشارات الخلوية والظواهر البيولوجية الأخرى أمرا بالغ الأهمية لفهمنا للبيولوجيا الخلوية والتنموية ، وكذلك لتطوير استراتيجيات العلاج المستهدفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أهداب الابتدائية طويلة الزوائد القائم على أنيبيب التي تمتد من سطح معظم خلايا الثدييات. وغالبا ما يتم الخلط بين أهداب الابتدائي مع أهداب متحركة، التي يوجد منها دائما متعددة في كل خلية، والذي يهدف إلى نقل السوائل عبر أسطح الأغشية. أهداب الابتدائي، في المقابل، تعتمد الأدوار الحسية، وبالتالي المشار إليها أهداب كما الحسي أيضا. مرة واحدة فترة طويلة طي النسيان، وهذا عضية في الآونة الأخيرة 'اكتشاف' نتيجة لارتباطه مع العديد من الأمراض الوراثية البشرية 1. موقع مثالي كما عضية الإشارات، وقد تبين من هدب الأساسي لتنظيم العديد من مسارات إشارات، وكثير منها هي مهمة ليس فقط في توازن الأنسجة والمرض، ولكن أيضا خلال تطوير 2.

كان واحدا من مسارات الإشارات الأولى تبين أن تترافق مع ضعف أهداب وغير متعارف عليه مسار إشارات Wnt، المعروف أيضا باسم قطبية خلية مستو (PCP) مسار > 3. هذه سلسلة الإشارات التي تم تحديدها في البداية في ذبابة الفاكهة، هو أمر حاسم لمرحلة التطور الجنيني. ولا سيما بالنسبة للعمليات التقارب والإرشاد والتوجيه الصحيح من الخلايا في الطائرة من ظهائر 4. إشارات متتابعة من مجموعة أساسية من البروتينات التنظيمية تترجم الإشارات الاتجاه الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى إعادة ترتيب هيكل الخلية ويؤدي إلى الاستقطاب منسق الخلايا الظهارية في طائرة 5. مطلوب عملية التقارب والإرشاد للغاية لقناة القوقعة إلى استطال والصحيحة الزخرفة الخلوية 6. وبما أن هذا التنظيم عبر تفعيل المسار حزب المؤتمر الشعبي، واحدة من الظواهر الأكثر لفتا للطفرات PCP القوقعة هي القناة قوقعة تقصير مع غير منظمة ظهائر الحسية 7. وبالمثل، المسوخ الماوس، والتي تفتقر أهداب، كما يحمل هذا التقارب والإرشاد النمط الظاهري 8،9، على الرغم من بالضبط كيف ينظم يبقى أن توضيح.

ve_content "> لأن عمليات التقارب والإرشاد حاسمة للنمو من القناة القوقعة، والزخرفة الخلوية من ظهائر الحسية داخل القناة القوقعة، القوقعة النامية جهازا مثاليا لدراسة PCP الإشارات خلال تطوير الفقاريات.، وجهاز ويطلق على كورتي، مصطلح يطلق على ظهارة حسية متخصصة خطوط القناة قوقعة الأذن، ويتكون من خلايا دعم غير الحسية وخلايا الشعر ميكانيكية حسية التي يجب موحد الموجهة للالقوقعة للعمل 10. وخلايا الشعر ميكانيكية حسية ذلك بسبب حزم stereociliary التي تمتد من لوحة جليدية (السطح القمي) من كل خلية الشعر الحسية (11). وهذه بمثابة محولات الطاقة الأولية من mechanosensation وعلى الرغم من التسميات على النحو أهداب ساكنة، وتتألف في الواقع من الزغيبات الصغيرة المعتمدة على خيوط الأكتين المعدلة. وفي كل الشعر على شكل شيفرون حزمة، ويتم تنظيم ثلاثة صفوف من أهداب ساكنة في السلطة الفلسطينية أمر غاية والعاديةttern في درج بطريقة حالة شبيهة. ريال مدريد أهداب القائم على أنيبيب، الأهداب المحركة تسميته، مطلوبة من أجل تطوير وتوجيه حزم stereociliary 12. على كل خلية الشعر، ويرد الهدب المحرك واحد فعليا إلى حزمة أهداب ساكنة، ويقع بالقرب مركزيا لأطول صف من أهداب ساكنة. وظيفة دقيقة من الهدب المحرك غير واضحة، وفرضية واحدة هي أن الهدب المحرك "تسحب" على أهداب ساكنة في الشكل لأنها ناضجة من الزغيبات الصغيرة 12. في الفقاريات، الأهداب المحركة في القوقعة هي فقط موجودة عابر وتتراجع عن خلايا الشعر في الفئران قبل بداية سماع 11،13،14.

فقدان كامل للأهداب في تطوير النتائج القوقعة في القنوات قوقعة تقصير شديد، والخطأ في تشكيل وحزم stereociliary، وكذلك الهيئات القاعدية وضعه سوء 8،9 سوء المنحى. لا يشتمل هدب وظيفية فقط من الخيط المحوري الهدبية. العديد من البروتينات المرتبطة أهدابتحدث وظيفة في المجمعات المحلية لالنطاقات الفرعية ذات الصلة أهداب مثل الجسم القاعدية، منطقة انتقالية، أو الهدبية الخيط المحوري 15. الجسم القاعدية، والمستمدة من المركزيه أم جسيم مركزي، هو أيضا مركزا لتنظيم أنيبيب لميكروتثبول مد بعيدا عن هدب في خلايا الجسم، ويمكن تنظيم الاتجار داخل الخلايا وكذلك الاتجار الهدبية. المنطقة الهدبية الانتقالية منطقة أخرى حيث يتم تنظيم وظيفة الهدبية من حيث تنظيم استيراد وتصدير مركبات الهدبية 16.

وقد حددت الدراسات متعددة اتصال بين أهداب وWNT غير متعارف عليه (PCP الإشارات)، على الرغم من أن الآلية الدقيقة غير واضحة (17). التكرار من الجينات الهدبية وحزب المؤتمر الشعبي وحساسية قطبية الخلية إلى التغيرات الخلوية المعمم، تجعل من الصعب ربط مباشرة طفرة إلى العجز في حزب المؤتمر الشعبي محددة. واحدة من الرافضة قراءة في إشارة PCP هو تحديد المواقع من الجسم القاعدية وPRIMARذ هدب، وبالتالي فصل المرحلة الابتدائية من العيوب الثانوية يمثل تحديا. وقد اقترحت بعض الدراسات في الزرد والفأر المسوخ لا علاقة بين أهداب وإشارات Wnt 18-20. قد تعكس تناقضات في البيانات الأنواع، الأنسجة، أو الاختلافات الزمنية التي تعتمد في المساهمات الهدبية نحو إشارات WNT. وعلاوة على ذلك، قد يتم الاحتفاظ الاستجابة WNT العادية إذا بقيت الهيئات القاعدية وظيفية. وفهم أعمق لدور البروتينات الهدبية في مسارات الإشارات الخلوية والظواهر البيولوجية الأخرى أمر حاسم لفهمنا لعلم الأحياء الخلوي والتنموي، فضلا عن تطوير استراتيجيات العلاج المستهدفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام والموت ببطء كل الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية والحكومية، والأكثر شيوعا عبر CO 2 الاستنشاق وخلع عنق الرحم.

1. إعداد الكواشف

ملاحظة: قبل بداية، وإعداد جميع الكواشف استخدام المواد الكيميائية الصف التحليلية. جعل الحلول باستخدام الصف الجزيئية المقطر والماء منزوع الأيونات ما لم ينص على خلاف ذلك.

  1. الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني 1X): إصنع 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1X بحل 8G كلوريد الصوديوم، 0.2g بوكل، 1.44g نا 2 هبو 4 و 0.24g KH 2 PO 4 في 1 لتر من H 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. برنامج تلفزيوني لا تحتاج إلى أن تكون معقمة ويمكن تخزينها في RT. لاحظ أن يتم هذا المخزن المؤقت دون CaCl 2 أو MgCl 2.
  2. بارافورمالدهيد (4٪ PFA): إعداد حل 4٪ من منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1X في غطاء الدخان التهوية. إضافة 40G مسحوق امتصاص العرق إلى 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1X. حل، وإثارة وحرارة إلى حوالي 60 درجة مئوية،وإضافة ببطء هيدروكسيد الصوديوم قطرة من الحكمة أن رفع درجة الحموضة. مرة واحدة قد حلت مسحوق، إعادة ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. تصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر وتجميد قسامات. تذويب قسامة جديدة لكل تجربة.
  3. عازلة تريتون: إعداد 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 0.15 م كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100 حل عن طريق إذابة 8.77 جم كلوريد الصوديوم في 1 لتر من 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة). إضافة 1 مل تريتون X-100. يحرك المزيج حتى يذوب. عازلة تريتون مخزن في RT.
  4. تريتون كتلة: إعداد 10٪ مصل الماعز في المخزن تريتون بإضافة 1 مل من مصل الماعز إلى 9 مل من العازلة تريتون. تخزينها في 4 درجات مئوية. إذا باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الماوس، إضافة الماعز المضادة للماوس مفتش فاب شظايا في التخفيف من 1 في 200 إلى كتلة تريتون للخطوة الحجب.
    ملاحظة: إذا كنت تخطط لاستخدام عينات للفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM)، وإعداد الكواشف إضافية على النحو المبين أدناه.
  5. هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم: إصنع 1X حل HBSS عن طريق تمييع من محلول المخزونفي المعقم المقطر H 2 O. كما هو معقد عازلة HBSS لتقديم وهناك المخاطر التي تنطوي عليها، فإنه من المستحسن أن تأمر حل 10X الأسهم ولم يضف. التركيز النهائي من HBBS المخزن المؤقت تستخدم بشكل روتيني هو: 1.26 ملي CaCl 2، 0.49 ملي MgCl 2 -6H2O، 0.41 ملي MgSO 4 -7H2O، 5.33 ملي بوكل، 0.44 ملي KH 2 PO 4، 4.17 ملم NaHCO 3، 137.93 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.34 ملي نا 2 هبو 4، 5.56 ملي سكر العنب.
  6. HEPES العازلة: يعد حل 0.1 M HEPES في 1X HBSS، عن طريق تذويب 23.8 غرام HEPES في 1 العازلة L 1X HBSS.
  7. المجهر الإلكتروني تثبيتي (SEM فيكس): إعداد تثبيتي لوزارة شؤون المرأة عن طريق تمييع الإلكترون المجهري الصف غلوتارالدهيد (2.5٪)، وامتصاص العرق (4٪) في HEPES العازلة. إضافة CaCl 2 إلى تركيز النهائي من 10 ملم.
  8. 1٪ الأزميوم رباعي أكسيد (أوسو 4) في HEPES العازلة. 1٪ الأزميوم رباعي أكسيد في الماء: تمييع الحل الأسهم من رباعي أكسيد الأوزميوم في HEPES العازلة، وseparatelذ في عقيمة المقطر H 2 O، إلى تركيز النهائي من 1٪. رباعي أكسيد الأوزميوم عالية السمية ويباع الأكثر شيوعا كحل 4٪.
  9. 1٪ (ث / ت) وحامض التانيك: حل 0.5 غرام حمض التانيك في 50 مل العقيمة H 2 O. المقطر فلتر تعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حجم 0.45 المسام.
  10. متدرج الإيثانول حل سلسلة: تمييع 200 الإيثانول واقية مع العقيمة H 2 O المقطر لجعل حلول 30، 50، 70، 90 و 95٪ من الإيثانول. ليشطف الإيثانول النهائية، مطلوب الإيثانول بنسبة 100٪ 200 دليل. استخدام زجاجة افتتح حديثا من 200 الإيثانول واقية لليشطف النهائية.

2. اختيار الأنسجة

  1. من الناحية المثالية، فحص الأجنة أو الجراء الصغار الذين تتراوح أعمارهم بين يوم الجنينية 16.5 (E16.5) ويوم ما بعد الولادة 3 (P3).
    ملاحظة: التعظم من المتاهة العظمية والعظام الزمنية يجعل تشريح تدريجيا أكثر صعوبة عندما تنضج الفئران. أيضا الأهداب المحركة، وجد صحيحا هدب القائم على أنيبيب الوحيد على خلايا الشعر قوقعة،تتراجع خلال التنمية ولم تعد موجودة في فئران بالغة.
  2. بعد التثبيت، ويزيل الكلس القوقعي الكبار. مكان تشريح (انظر القسم 3) المتاهات عظمي، في 2 مل EDTA (4.13٪ في برنامج تلفزيوني)، ودرجة الحموضة 7.3، في أنبوب microcentrifuge لمدة 3 - 4 أيام مع دوران. تجديد EDTA يوميا. بعد الأنسجة خففا، وشطف في 1.5 مل أو أكثر من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق على nutator مع زيادة الإثارة.

3. القوقعة تشريح

  1. euthanization بعد عن طريق خلع عنق الرحم أو CO 2 الاستنشاق (100٪ CO 2)، وإزالة الرأس. استخدام شفرة مشرط أو زوج من مقص صغير، اعتمادا على حجم الحيوان، لتشريح الرأس على طول خط منتصف سهمي ابتداء من الأنف وتوسيع caudally. إزالة الدماغ من كل شوط من الجمجمة مع زوج من الملقط. تحديد العظام الزمنية، والتي تحتوي على المتاهات العظمية النامية في الأذن الداخلية (انظر السهم في الشكل 1A).
  2. استخدام زوج من لالفطر الابيض لعزل بعناية متاهات عظمي من الجمجمة (عظم صدغي). هل هذا تحت المجهر تشريح. PRISE بعيدا الأنسجة العظمية من الجمجمة عن طريق تشغيل ملقط بلطف تحت المتاهات عظمي. في الحيوانات حتى P4 متاهات عظمي لا تزال الغضروفية، ويمكن إزالتها بسهولة دون كسر.
  3. وبعد تشريح، استخدم غيض من ملقط تشريح لمسح البيضاوي والنوافذ المستديرة وجعل ثقب صغير في قمة القوقعة الحلزونية. إصلاح المتاهات العظمية قبل مزيد من تشريح القناة القوقعة. للسماح لسهولة إزالة الغشاء السقفي (انظر 3.7)، وتحديد المتاهات عظمي في 1.5 مل PFA 4٪ لمدة 5 دقائق على الجليد.
    ملاحظة: إذا لم يكن مطلوبا إزالة الغشاء السقفي، وينصح تثبيت أطول (انظر 4،1-4،3). تثبيت وجيزة من العظام الزمنية قبل تشريح القناة قوقعة الأذن يساعد في عملية تشريح وإزالة الغشاء السقفي. تشريح ما بعد والتعرض للجهاز كورتي، furtمطلوب تثبيت لها.
  4. وعلاوة على ذلك تشريح المتاهات عظمي لفضح ظهارة حسية قوقعة على النحو التالي. وضع المتاهات عظمي في سيليكون أسود المغلفة الاستومر طبق تشريح تحتوي على برنامج تلفزيوني لتسهيل تشريح. استخدام الدبابيس minutien لشل حركة الأنسجة إذا لزم الأمر. لاستخدام الدبابيس minutien، ووضعها من خلال الجزء الدهليزي من المتاهات عظمي مع الجانب البطني من القوقعة الحلزونية التي تواجه صعودا.
    ملاحظة: أسود سيليكون طبق الاستومر: مزيج سيليكون مكون أساسي الاستومر مع مسحوق الفحم للحصول على اللون الأسود معتم. إضافة كيل علاج وتصب في واحد أو أكثر من أطباق بتري (الزجاج أو البلاستيك). الجاف في ظل فراغ لإزالة فقاعات الهواء المحاصرين. أطباق الجافة قبل تماما للاستخدام.
  5. استخدام ملقط غرامة (رقم 5) لإزالة الغضروف الخارجي تعريض القناة القوقعة. تبدأ في النافذة البيضوية. إدراج طرف السفلي من ملقط في إطار بيضاوي ونقب بلطف فتح الغضروف، تتحرك ببطء صعودا نحوقمة.
  6. بعد تعرض القناة القوقعة، وإزالة السطح البطني، غشاء رايسنر. استخدام زوج جيد من ملقط لقرصة غشاء رايسنر في قاعدة القناة القوقعة وقشر تشغيله في حركة تصاعدية. تصور الجانب الظهري للقناة القوقعة، بما في ذلك ظهارة حسية.
  7. إزالة الغشاء السقفي كما هو موضح أدناه (اختياري). لSEM أو المناعية من الهدب المحرك أو حزم stereociliary إزالة الغشاء السقفي.
  8. استخدام زوج جيد جدا من الملقط (رقم 55 أو أدق) لقرصة الغشاء السقفي في قاعدة القوقعة وقشر صعودا نحو قمة.
    ملاحظة: الغشاء السقفي هو بصريا واضح مما يجعل من الصعب التعرف عليها. في كثير من الأحيان لا غشاء يأتي قبالة في قطعة واحدة، وعلى الرغم من أنها لا تصور بسهولة، ويمكن للمرء أن يشعر المقاومة كما يتم سحبها تشغيله من الجهاز يتعرض كورتي.
  9. بعد تعريض جهاز كورتي، ومواصلة إصلاح الأنسجة كما دescribed أدناه. الإبقاء على المنطقة الدهليزي لمساعدة المزيد من إعداد الأنسجة.

4. التثبيت

  1. لالمناعية العادية إصلاح المتاهات العظمية تشريح في 1.5 مل PFA 4٪ في 4 درجات مئوية على nutator لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: نظرا لحساسية الأجسام المضادة ومولدات المضادات، والاختلافات اختلاف في طول وتكوين التثبيت قد تكون مطلوبة ويجب أن يكون الأمثل لكل الأجسام المضادة.
  2. بعد التثبيت، وغسل العينات من قبل الشطف في 1.5 مل أو أكثر من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق على nutator مع زيادة الإثارة. عينات يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع قبل المعالجة.
  3. إذا إعداد عينات للوزارة شؤون المرأة، وتحديد تشريح عظم صدغي في الإصلاح ووزارة شؤون المرأة (انظر 1.7) لمدة 2 ساعة على RT. غسل الشطف في 1.5 مل أو أكثر HEPES العازلة 3 مرات لمدة 5 دقائق على nutator مع زيادة الإثارة. مخزن في المخزن HEPES في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة. التخزين لمدة أطول من بضعة أسابيعلا ينصح الصورة.

5. المناعية

  1. أداء المناعية على عينات تشريح في بئر واحدة من 96 لوحة جيدا مسطحة القاع. بدلا من ذلك، استخدام PCR أو أنبوب microcentrifuge. فإنه من المستحسن أن الإبقاء على جزء الدهليزي من المتاهة عظمي لتسهيل المعالجة.
  2. Permeabilize الأنسجة التي يحتضنها في 1.5 مل العازلة تريتون لمدة 1 ساعة على RT على nutator مع الإثارة لطيف.
  3. منع الأنسجة التي يحتضنها في 0.5 مل كتلة تريتون مدة لا تقل عن 1 ساعة على RT. إذا باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الماوس، إضافة شظايا المضادة للماوس مفتش فاب للكتلة في التخفيف من 1 في 200 (انظر القسم 1.4). هذا يقلل إلى حد كبير غير محددة ملزمة المضادة للمفتش الماوس إلى الأنسجة الماوس.
  4. احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في تريتون كتلة O / N عند 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف. تخفيف الأجسام المضادة يعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة (انظر القسم 6.1). وبدلا من احتضان antibodie الأساسيالصورة لمدة 2 ساعة على RT. من الناحية المثالية استخدام حجم الحد الأدنى من 0.5 مل تمييع الأجسام المضادة الأولية. إذا الأجسام المضادة لعدد محدود من استخدام أصغر حجم التخفيف الأجسام المضادة التي تحيط تماما الأنسجة.
  5. غسل الأنسجة بشطفها في 1.5 مل أو أكثر تريتون العازلة، ما لا يقل عن 3 مرات لمدة 15 دقيقة، على nutator مع زيادة الإثارة.
  6. احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الثانوية صبغ مترافق فلوري المخفف على الشركات المصنعة للتركيز موصى بها (عادة 1: 200-1: 1000) في كتلة تريتون لمدة 1 ساعة على RT على nutator. استخدام حجم الحد الأدنى من 0.5 مل التخفيف الضد الثانوية.
    1. أجهزة الطرد المركزي الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 13000 x ج لمدة 3 دقائق قبل استخدامها للحد غير محددة وملزمة من المجاميع الضد الثانوية. حماية الأنسجة من الضوء من هذه الخطوة فصاعدا لتجنب photobleaching من الأصباغ الفلورية.
  7. كما في الخطوة 5.5، وغسل الأنسجة بشطفها في 1.5 مل أو أكثر عازلة تريتون، ما لا يقل عن 3 مرات لمدة 15 دقيقة، علىnutator مع زيادة الإثارة. تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للتحميل.

6. الأجسام المضادة اختيار

ملاحظة: مصدر الأجسام المضادة الموصى بها والتخفيفات التي يتم سردها في جدول المواد المحددة والمعدات. أداء حضانات الضد كما هو موضح في المادة 5.

  1. لتصور الهدب المحرك القائم على أنيبيب، واستخدام الخيط المحوري الهدبية علامة مثل مكافحة Arl13b (1: 1000) أو مكافحة الأسيتيل-α تويولين (1: 800). تصور الجسم القاعدية باستخدام الأجسام المضادة ضد γ تويولين (1: 200) أو أي علامة centrosomal أخرى.
  2. لتصور الأكتين خيوط غنية حزم stereociliary، إضافة phalloidin (1: 300 - 1000) مترافق إلى واحدة من عدة fluorophores مختلفة لحضانة الأجسام المضادة الثانوية. أيضا تسميات Phalloidin هياكل الأكتين الخيطية أخرى بما في ذلك خيوط الأكتين القشرية المحيطة محيط كل خلية الشعر الظهارية. وهذا مفيد في تحديدالخطوط العريضة للكل خلية الشعر. استخدام علامة غشاء بديلة مثل مكافحة زوي-1 (1: 500) إذا لزم الأمر.
  3. تسمية خلايا الشعر قوقعة باستخدام أجسام مضادة ضد الميوسين السادس (1: 1000) أو الميوسين السابع-أ (1: 1000). ويمكن استخدام هذه إذا تقييم طول القوقعة.

ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة الفلورسنت المناسبة صبغ مترافق الثانوية الأمثل لمتطلبات المجهر.

7. تركيب والتصوير

  1. وضع العينة في طبق سيليكون الاستومر السوداء تحتوي على برنامج تلفزيوني. باستخدام ملقط غرامة، وإزالة المنطقة الدهليزي من القوقعة الحلزونية.
  2. جدا إزالة بعناية الغضروف الأساسي واللحمة المتوسطة من القوقعة الحلزونية. تحتوي القوقعة الحلزونية المتبقية تلم الداخلي، جهاز كورتي وتلم الخارجي.
  3. نقل القوقعة الحلزونية إلى قطرة من برنامج تلفزيوني وضعها على شريحة المجهر. إذا رغبت في ذلك، فصل القوقعة الحلزونية إلى قطع أي ما يعادل واحد بدوره. هذه الخطوة ليست ضرورية ولكن، ويمكن أن تؤدي إلى lتابعنا من الأنسجة. السطح القمي (الجانب أهداب ساكنة) من خلايا الشعر القوقعة يجب أن تواجه صعودا نحو ساترة.
  4. الفتيل بعيدا برنامج تلفزيوني مع الأنسجة مكثف أو قطعة من ورق الترشيح وبلطف إعادة القوقعة الحلزونية إذا فقد تحول ظهائر والتداخلات على نفسها.
  5. إضافة قطرة من وسائل الاعلام تركيب مباشرة على العينة القوقعة ووضع بلطف ساترة على القمة، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء. وهناك حاجة إلى الفواصل. وضع ساترة مباشرة على العينة. ويوصى، غير الاستشعاع للذوبان في الماء، المتوسطة المتزايدة شبه الدائمة التي لا تتطلب خطوات إضافية لعقد ساترة في المكان. تركيب وسائل الإعلام وسمك ساترة ينبغي أن تكون مطابقة لمواصفات المجهر.
  6. استخدام المجهر epifluorescent أو الليزر مسح متحد البؤر مجهزة التكبير عالية (63 - 100X)، وارتفاع الفتحة العددية (1،2-1،4) أهداف لالتقاط الصور من سطح قمية للخلية الشعر القوقعة. استخدام الصغرىأهداف ور (5 - 20X) لاتخاذ تداخل الصور من القوقعة الحلزونية لتحديد طول القناة القوقعة. الليزر الإثارة مباراة والمرشحات الانبعاثات إلى fluorophores استخدام الأجسام المضادة الثانوية.

8. المجهر الإلكتروني

  1. تواصل من القسم 4.3. بعد غسل عينات SEM الثابتة في HEPES العازلة، نفذ الخطوات التالية تحت التهوية. بروتوكول التالية يعمل بشكل جيد للأنسجة القوقعة والابتعاد عن استخدام طلاء بالرش مع معدن موصل.
  2. ما بعد الإصلاح في 1٪ أوسو 4 في HEPES العازلة لمدة 1 ساعة، تليها 3 غسلات مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما. وينبغي استخدام أصغر حجم أوسو 4 التي تحيط تماما الأنسجة للتقليل من النفايات السامة. لا يلزم الانفعالات.
  3. احتضان عينات في RT في كل من الحلول التالية لمدة 1 ساعة مع 3 يغسل مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق في كل من بين الخطوات التالية: حمض التانيك 1٪ طازجة في الماء وفيلمحله قبل استخدامها. 1٪ أوسو 4 في الماء، حمض التانيك 1٪ في الماء، 1٪ أوسو 4 في الماء.
  4. يذوى العينات من خلال سلسلة الإيثانول متدرج من الحضانة لمدة 10 دقيقة في كل من التخفيفات التالية: 30، 50، 70، 90، و 95٪. لا يلزم الانفعالات.
  5. بنقل العينات من خلال ثلاثة تغييرات، 5 دقائق لكل منهما، من الإيثانول بنسبة 100٪ (من زجاجة افتتح حديثا من 200 الإيثانول برهان).
  6. تشغيل عينات على الرغم من أكثر جفافا نقطة حرجة بعد تعليمات الشركة الصانعة.
  7. تركيب العينات باستخدام لاصق الكربون موصل على قمة كعب SEM قبل التصوير على المجهر الالكتروني. تحت مجهر تشريحي، استخدام زوج من ملقط غرامة والفرشاة لوضع بلطف العينة مع ظهائر قوقعة مواجهة. استخدام الجزء الدهليزي من العينة إلى 'مرساة' الأنسجة للقاعدة. تخزين العينات في مجفف حتى التصوير. أداء SEM التصوير كما هو موضح في جونز (2012) 21.

9.تحديد الكمية

  1. بعد إعداد المناعية، والحصول على الصور باستخدام epifluorescent أو الليزر مسح متحد البؤر المجهر. بعد إعداد لوزارة شؤون المرأة، واستخدام المجهر الإلكتروني لصورة العينات. صورة السطح القمي من جهاز كورتي مع خلايا الشعر قوقعة المكشوفة وخلايا الدعم مقحم.
  2. تحديد مواقع معينة على طول القناة القوقعة، مثل 25، 50، و 75٪ من القاعدة واستخدام هذه لمقارنة المناطق القوقعة بين عينات متحولة والسيطرة. تحليل ومقارنة المسوخ أهداب مع الضوابط littermate، وعن الاختلافات في الخلفية الوراثية يمكن تعديل النمط الظاهري القوقعة.
    ملاحظة: جهاز كورتي يتطور في التدرج الذي يمتد من منتصف القاعدة تجاه كل قمة وقاعدة. في الماوس، والتنمية ليست كاملة حتى P14، ولذلك فمن المهم للمقارنة بين المناطق في مراحل ومواقف التنموية مماثلة.
  3. التقاط الصور باستخدام برنامج المرافقة المجهر أن ألوث لتقدير حجم النمط الظاهري معين كما هو مطلوب (أنظر أدناه). استخدام صورة برامج التحليل مثل J صورة أو البرامج المصاحبة المجهر لقياس الأطوال، عد الخلايا وتحديد توطين البروتين كما هو موضح أدناه. الرسم البياني هذه البيانات كما هو مخطط بار، مؤامرة مبعثر، مربع لطخة أو الرسم البياني، مقارنة السيطرة مقابل متحولة.
  4. يبلغ طول القناة القوقعة (الشكل 3A):
    1. باستخدام علامة الخلية الشعر أو phalloidin، (الذي يصادف حزم stereociliary)، وتحديد وقياس حيث تبدأ الظهارة الحسية والغايات. في كثير من الأحيان تقصير طول القناة القوقعة في المسوخ أهداب.
  5. تشوهات حزمة Stereociliary (الشكل 3B، D، E، G):
    1. قياس تحدب الرزمة (الارتفاع)، وأقصر مسافة بين قمة الرأس من حزمة والخط الذي يمتد من خلال طرفي باقة "الأسلحة" كما هو مبين في الشكل الجيل الثالث 3G، غادر. بدلا من ذلك، تحديد المنطقةتشملها أحضان الخارجية خلية الشعر حزمة stereociliary كما هو مبين في الشكل الجيل الثالث 3G، والحق. إذا خلايا الشعر مع ويمكن تحديد حزم stereociliary دائرية تحسب هذه كنسبة مئوية من مجموع خلايا الشعر.
      ملاحظة: في العديد من المسوخ الهدبية يمكن ملاحظة تشوهات الباقة بغض النظر عن التوجه ربطة. ومن الصعب تحديد بدقة تشوهات حزمة stereociliary.
  6. توجيه حزم stereociliary (الشكل 3B، C، G):
    1. تقييم توجه كل حزمة الفردية نسبة إلى الخط يمتد عموديا على صف من خلايا عمود الذي يفصل بين خلايا الشعر الداخلية والخارجية. يتم محاذاة الخلايا مع التوجه الطبيعي على طول هذا المحور العمودي وهكذا يكون دوران 0 درجة. تحديد زوايا الدوران باستخدام إما تدوين 360 درجة أو الانحرافات المطلقة من 0 درجة.
  7. الأهداب المحركة لتحديد المواقع أو stereociliary المواقع حزمة (الشكل3B، F، H):
    1. حساب النسبة المئوية للخلايا التي الأهداب المحركة مفقودة. قياس المسافة من الهدب المحرك إلى "قمة" أو مركز للحزمة. في 'قمة' من حزمة قد لا يكون من السهل تحديد إذا حزم غير طبيعية، وذلك وسط حزمة يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك.
  8. تحديد موقف الأهداب المحركة وحزم stereociliary على سطح الخلية الشعر القمي، عن طريق تغطية شبكة الموضعية على كل خلية الشعر وبمناسبة موقع أي قاعدة الهدب المحرك أو قمة الرأس / وسط حزمة stereociliary. عرض البيانات كنسبة مئوية من كل فئة التي تقع ضمن منطقة محددة من الشبكة، وتتراكب مواقع كل علامات على شبكة الموضعية واحدة.
    ملاحظة: في الأنسجة السيطرة، الأهداب المحركة دائما تعلق على الرأس من حزمة stereociliary. في المسوخ أهداب، الأهداب المحركة في كثير من الأحيان في عداد المفقودين، mislocalized حتى الآن لا تزال تعلق، أو حتى منفصلة تماما عن الصورةحزمة tereociliary.
  9. طول الأهداب المحركة (الشكل 3I):
    1. قياس طول الهدب المحرك عن طريق وضع العلامات مع علامة الهدبية الخيط المحوري. قياس فقط الأهداب المحركة التي تكمن شقة ضمن 1.5 ميكرون الطائرة مبائر. تأكد من أن أهداب يكذبون شقة من خلال مراقبة وجهة نظر مستعرضة من الأنسجة الممسوحة ضوئيا. مقارنة عينات مطابقة تتراوح أعمارهن بين نفس المنطقة من القوقعة منذ الهدب المحرك تتراجع خلال التنمية.
  10. Mislocalization من البروتينات القطبية:
    1. بعد المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد بروتينات القطبية مثل Vangl2 وGαi3، وتحديد التعريب عن طريق التصوير.

ملاحظة: في بعض المسوخ أهداب، وتعطلت توطين البروتينات القطبية. وتشمل هذه Vangl2 وGαi3، والتي ثبت أن تعطلت في Ift20، Bbs8 وBbs6 القوقعة متحولة.

ملاحظة: أمثلة أخرى لكيفية تحديد وpolarit خلية شاشة الشعرذ يمكن العثور عليها في الأوراق التالية. كورتين، وآخرون. (2003) علم الأحياء الحالي 22، Montcouquiol، وآخرون. (2003) الطبيعة 7، وانغ، وآخرون (2006) مجلة العلوم العصبية 23، Montcouquiol، وآخرون. (2008) طرق في البيولوجيا الجزيئية 24، مايو Simera، وآخرون. (2012) طرق في علم الأحياء الجزيئي 25، يين وآخرون (2012) بلوس واحد 26.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القوقعة تشريح والأنسجة التحضير

بعد إزالة الدماغ، ما بعد خط منتصف تشريح سهمي من رئيس P0 الماوس، والتيه العظمي، وينظر من وراء، يمكن تصور (الشكل 1A، السهم الأبيض) وإزالتها. ويبين الشكل 1B متاهات عظمي معزولة مع الشعر القوقعة تواجه صعودا، بطني، (يسار) ومن وراء، ظهري (يمين). يشير السهم ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند إعداد الأنسجة قوقعة للتحليل، هناك عدد قليل من النقاط الرئيسية أن نأخذ في الاعتبار. أولا، يمكن أن الاختلافات في الخلفية الوراثية تعديل النمط الظاهري قوقعة الأذن، مما يجعل من الضروري تحليل ومقارنة الضوابط littermate فقط. ثانيا، يتعين إزالة كاملة من الغشاء السقفي للحصول على أفضل الصور مع المناعية وضروري لوزارة شؤون المرأة. الغشاء السقفي هو هيكل مبهمة ويمكن أن تحجب خلايا ظهارة حسية مباشرة تحتها، مما يجعل التصوير أكثر تحديا. أحيانا أثناء المعالجة، الغشاء السقفي قد ينكمش مرة أخرى، و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن صاحب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود الكاتب أن أشكر ماثيو كيلي، تيزيانا Cogliati، جيسيكا Gumerson، أوفي ولفروم، ريفكا Levron، فيولا كريتشمير وزوي مان ولتقييم ينتقدون فيها المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة Sofja كوفاليفسكايا (مؤسسة Humbodlt) وجامعة يوهانس غوتنبرغ،، ماينز، ألمانيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أدوات / معدات
سيليكون مطاط أسماك - Sylgard 184Sigma-Aldrich761028-5EAانظر الملاحظة 2
مقص تشريح دقيق - شفرة مستقيمة
(رقم 5 و 55) وملقط حادتشريح مختلف
.شرائح مجهر زجاجي غير
زلات غطاء مجهر مختلفة (22 مم & مرات ؛ 40 مم & مرات ؛ 0.15 مم)
نقل
أدوات العلوم الدقيقة26002-10
حامل عينة SEMtousimis8762
مسامير الفحص المجهري الإلكتروني المسحTED PELLA16111
PELCO علامات التبويب: لاصق الكربونTED PELLA16084-3
مجهر الفلورسنتمجفف النقاط الحرجة المختلفة
مسح المجهر الإلكترونيمجهر زجاجي مختلف
زجاجية
كيمواب مختلفة   ؛الدقيقة المختلفة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Gibco / Life Technologies10010023
Paraformaldehyde   ؛ (PFA) (درجة EM مطلوبة ل EM)مختلفإعداد حل 4٪ في 1 & مرات. PBS طازجة في كل مرة. درجة EM مطلوبة ل EM.
2.5٪ جلوتارالديهايد من الدرجة 1سيجما ألدريتشG5882
تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5)كلوريد الصوديوم المختلف
ككلوريد الهواء 2مختلف
تريتون X-100
مصل الماعز العاديالمختلف AffiniPure
Fab جزء الحمار المضاد للفأر IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch715-007-003
Fluoromount-G تصاعد وسائل الإعلامSouthernBiotech0100-01
10 & مرات ؛ هانكس محلول الملح المتوازن (HBSS)Gibco / Life Technologies14065
HepesGibco / Life Technologies15630-080
رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4)Sigma-Aldrich / Fluka Analytical75632
حمض التانيكSigma-Aldrich403040
الإيثانول 200 دليلالأجسام
مكافحة Arl13bبروتين التكنولوجيا17711-1-APالتركيز المقترح 1: 1,000
التوبولين المضاد للأسيتيلات (611-B1)Sigma-AldrichT6793التركيز المقترح 1: 800
مضاد جاما توبولين (GTU-88)Sigma-AldrichT6557التركيز المقترح 1: 200
مضاد Zo_1 & nbsp ؛Invitrogen40-2300التركيز المقترح 1: 500
Myosin VIProteus Biosciences25-6791التركيز المقترح 1: 1000
Myosin VIIaProteus Biosciences25-6790التركيز المقترح 1: 1،000
anti Vangl2Merk MilliporeABN373التركيز المقترح 1: 250
مضاد G & alpha ؛ i3Sigma-AldrichG4040التركيز المقترح 1:250
Alexa Fluor & 488 PhalloidinInvitrogen / Life TechnologiesA12379التركيز المقترح 1: 300 - 1,000
Alexa Fluor & 568 PhalloidinInvitrogen / Life TechnologiesA12380التركيز المقترح 1: 300 - 1,000
ملقط رفيع مختلف مجهر مصقول مختلفة ماصات مختلفة دبابيس Minutien مختلفة   ؛ شرائح أغطية مختلفة أنسجة كواشف فرشاة الطلاء 1 & مرات ؛ على المضادة المختلفة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7(2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378(2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7(2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839(2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988(2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925(2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B(2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C(2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

VIIA ZO 1

مقالات ذات صلة