نحن تصف الإجراء التجريبي بسيطة وسريعة لتوليد الخلايا الليفية الأولية من الأذنين وذيول الفئران. لا يتطلب إجراء تدريب خاص الحيوان، ويمكن استخدامها لتوليد الثقافات الليفية من آذان المخزنة في RT لمدة تصل إلى 10 يوما.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الثقافات توليد الخلايا الليفية الأولية من ماوس الأذن والذيل الأنسجة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتستمد الخلايا الأولية مباشرة من أنسجة ويعتقد أن يكون أكثر تمثيلا للالحالة الفسيولوجية للخلايا في الجسم الحي من خطوط الخلايا المحددة. ومع ذلك، ثقافات الخلية الأولية عادة ما يكون لها عمر محدود وتحتاج إلى كثير من الأحيان إعادة تأسيس. الليفية هي مصدر يمكن الوصول إليها بسهولة من الخلايا الأولية. هنا، نحن نناقش إجراء التجارب بسيطة وسريعة لإنشاء الثقافات الليفية الأولية من آذان وذيول الفئران. يمكن استخدامها على بروتوكول إنشاء الثقافات الليفية الأولية من آذان المخزنة في RT لمدة تصل إلى 10 يوما. عند اتباع البروتوكول بعناية، من غير المرجح أن تحدث على الرغم من استخدام الأنسجة غير معقمة تخزينها لفترة طويلة في بعض الحالات التلوث. الليفية تتكاثر بسرعة في الثقافة ويمكن توسيعها لتشمل أعداد كبيرة قبل ان يخضع الشيخوخة تنسخي.
المقدمة
وتستمد الخلايا الأولية من الأنسجة ومثقف يعيشون في ظل ظروف في المختبر. ويفترض عموما أن الخلايا الأولية أكثر شبها الدولة الفسيولوجية والخلفية الوراثية من الأنسجة التي نشأت من خطوط الخلايا خلد أو ورم 1. لهذا السبب، الخلايا الأولية تمثل نموذجا مفيدا لدراسة المسائل البيولوجية 2،3. ولكن، على عكس خطوط الخلايا المنشأة التي تنمو إلى أجل غير مسمى، الخلايا الأولية تخضع في نهاية المطاف الشيخوخة في الثقافة وتحتاج إلى كثير من الأحيان إعادة تأسيس.
وتشمل الخلايا الأولية التي تستخدم عادة الخلايا الليفية، الخلايا الظهارية، وخلايا بطانة الأوعية الد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتم إيواء الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية حتى euthanization (الرعاية المؤسسية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) المبادئ التوجيهية في جامعة سنغافورة الوطنية واللجنة الوطنية الاستشارية لمختبر أبحاث الحيوان (NACLAR) المبادئ التوجيهية).
1. الفئران
- من أجل الماوس واحدة من الخلفية الوراثية المناسبة. ويستند هذا البروتوكول على الأنسجة المستمدة من C57BL واحد / 6 الماوس.
2. إعداد الكامل المت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخراج الخلايا الليفية من نتائج الأنسجة في كمية كبيرة من الحطام الأنسجة (الشكل 1). وعلى النقيض من الحطام الأنسجة، والخلايا الليفية تلتزم الأنسجة السطوح البلاستيكية الثقافة بين يوم 1 و 3 من الثقافة. وسيلة الثقافات الليفية يمكن تغيير بسلام في يوم 3 من الثقافة، والذي لا بد أن يقلل بشكل كبير من مستويات الحطام موجودة في ثقافة (الشكل 2). عرض الليفية في التشكل ممدود والسيتوبلازم واضحة للعيان (الشكلان 1 و 2). يجب أن تكون الخلايا الإنقسام.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نقدم إجراء التجارب بسيطة وغير مكلفة وسريعة لإنشاء الثقافات الليفية الأولية من آذان وذيول الفئران. استخراج ينبغي أن يؤدي إلى تقسيم الخلايا الليفية ملتصقة وبسرعة في غضون 3 أيام بعد العزلة من الأنسجة. قيود هاما من الخلايا الأولية هو الشيخوخة، وتوقف نمو دائم 15. باستخدام بروتوكول والثقافات الليفية يمكن passaged لمدة 5 إلى 6 مرات قبل أن تصبح الخلايا الليفية هرمة، وأشار تسطيح الخلايا، وزيادة في الحجم (2-3 مرات الزيادة) وفشل في التوسع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح المالية.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل منحة NRF HUJ-CREATE - الآليات الخلوية والجزيئية للالتهاب.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin / Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| الإيثانول | ميرك ميليبور | 107017 | المطلق للتحليل |
| الكولاجيناز D | Roche Diagnostics | 11088866001 | من Clostridium histolyticum< / em> ، المجفف بالتجميد ، غير معقم |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | من Streptomyces griseus عازلة < / em> |
| Tris (درجة الحموضة 8) | 1st BASE | 1415 | درجة نقية |
| للغاية 0.5 متر EDTA (درجة الحموضة 8) | 1st BASE | BUF-1053 | درجة التكنولوجيا الحيوية |
| 10X محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | فائق النقاء |
| 10X | سيجما-ألدريتش | 59418C-100ML | 0.5٪ تربسين ، 0.2٪ EDTA ، تريبسين جاما مشع بعملية SER-TAIN ، بدون فينول أحمر ، في محلول ملحي |
| أمفوتريسين ب | سيجما-ألدريتش | A2492-20 مل | 250 مو ؛ جم / مل في الماء منزوع الأيونات ، مقص مفلتر معقم |
| Aesculap | |||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 & مرشح حقنة M | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 & مصفاة الخلية M | SPL | 93070 | |
| مكبس حقنة | Terumo | SS + 10L | |
| أنبوب التبريد | NUNC | 368362 | |
| 1.7 مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Axygen | MCT-175-C | |
| طبق ثقافة الخلايا 10 سم | Greiner | 664160 | طبق معالج بزراعة الخلايا ؛ |
| 15 مل أنبوب سفلي مخروطي | الشكل Greiner | 188271 | |
| 50 مل أنبوب سفلي مخروطي | الشكل Greiner | 227261 | |
| حمام مائي | GFL | 1002 | |
| جهاز طرد | مركزي Eppendorf | 5810R | |
| شاكر حضانة | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 مجهر ضوئي | Carl Zeiss AG |
المراجع
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformat....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
