Method Article

التصوير غشاء المحتملة مع اثنين من أنواع مشفرة وراثيا نيون الجهد مجسات

DOI:

10.3791/53566

⸱

February 4th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, 3College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 4Advanced Institutes of Convergence Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تم وصف طريقة لتصوير التغيرات في إمكانات الغشاء باستخدام مؤشرات الجهد المشفرة وراثيا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحسنت مؤشرات الجهد المشفرة وراثيا (GEVIs) لدرجة أنها بدأت تكون مفيدة للتسجيلات في الجسم الحي. في حين أن الهدف النهائي هو تصوير نشاط الخلايا العصبية في الجسم الحي ، يجب أن يكون المرء قادرا على تصوير نشاط خلية واحدة لضمان نجاح الاستعدادات في الجسم الحي. سيصف هذا الإجراء كيفية تصوير إمكانات الغشاء في خلية واحدة لتوفير أساس للتصوير في النهاية في الجسم الحي. نصف هنا طرق تصوير GEVIs التي تتكون من مجال استشعار الجهد المدمجة إما في بروتين فلوري واحد (FP) أو بروتينين فلوريين قادرين على نقل طاقة رنين Förster (FRET) في المختبر. يتيح استخدام مقسم الصور عرض الصور التي تم إنشاؤها بواسطة طولين موجيين مختلفين على نفس الكاميرا المقترنة بالشحن (CCD) في وقت واحد. يضع مقسم الصور مكعب مرشح ثان في مسار الضوء. يتكون مكعب المرشح الثاني هذا من مرشح ثنائي اللون ومرشحين انبعاثيين لفصل الأطوال الموجية الفلورية المانحة والمتقبلة اعتمادا على FPs الخاصة ب GEVI. يتيح هذا الإعداد التسجيل المتزامن لكل من شركاء الفلورسنت المستقبل والمتبرع بينما يتم التلاعب بإمكانات الغشاء عبر تكوين مشبك تصحيح الخلية بالكامل. عند استخدام GEVI يتكون من FP واحد ، يمكن إزالة مكعب المرشح الثاني مما يسمح للمرايا الموجودة في مقسم الصور بعرض صورة واحدة على كاميرا CCD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التركيز الرئيسي من هذه الورقة هو للتدليل على التصوير الضوئي التغيرات في إمكانات غشاء في المختبر باستخدام البروتينات الفلورية المرمزة وراثيا. التغييرات التصوير في غشاء المحتملة توفر إمكانية مثيرة لدراسة نشاط الدوائر العصبية. عندما التغيرات في غشاء نتيجة المحتملة في تغير كثافة مضان، كل بكسل للكاميرا يصبح القطب البديل تمكين قياسات نونينتروسيفي من نشاط الخلايا العصبية. لأكثر من أربعين سنة، كانت الأصباغ الحساسة الجهد العضوية مفيدة لرصد التغيرات في غشاء المحتملة 1-4. ومع ذلك، هذه الأصباغ تفتقر إلى التحديد الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، بعض أنواع الخلايا صعبة وصمة عار. مؤشرات الجهد المشفرة وراثيا (GEVIs) التغلب على هذه القيود من خلال وجود الخلايا لدراستها على وجه التحديد تعبر عن الفلورسنت التحقيق الحساسة الجهد.

هناك ثلاث فئات من GEVIs. الطبقة الأولى من GEVI تستخدم فوltage الاستشعار المجال من الفوسفاتيز الاستشعار الجهد إما مع البروتين واحد فلوري (FP) 5-9 أو فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) زوج 10-12. الطبقة الثانية من أجهزة الاستشعار وتستخدم الجراثيم رودوبسين كمؤشر الفلورسنت مباشرة أو عن طريق 13-15 الحنق كهربائيا 16،17. الطبقة الثالثة تستخدم عنصرين، عنصر وراثي كونه غشاء الراسية FP والعنصر الثاني كونه غشاء ملزمة تبريد صبغ 18-20. في حين أن الطبقات الثانية والثالثة هي مفيدة لفي المختبر، وشريحة التجارب 19،20، فقط أول دفعة من أجهزة الاستشعار مفيدة في الجسم الحي يحلل 6 حاليا.

في هذا التقرير سوف نظهر التصوير من غشاء المحتملة باستخدام الدرجة الأولى من GEVIs (الشكل 1) في المختبر. هذه الطبقة الأولى من أجهزة الاستشعار الجهد هو أسهل للانتقال إلى التصوير في الجسم الحي. منذ GEVIs شtilizing مجال الاستشعار الجهد تنصهر إلى FP وحوالي 50 أضعاف أكثر إشراقا من الدرجة رودوبسين من أجهزة الاستشعار، ويمكن تصويرها باستخدام مصباح قوس الإضاءة بدلا من طلب ليزر قوية للغاية. نتيجة أخرى من التفاوت في السطوع هي أن الطبقة الأولى من GEVIs يمكن أن تتجاوز بسهولة لصناعة السيارات في مضان من الدماغ. لا يمكن للتحقيقات القائم على رودوبسين. الطبقة الثالثة من أجهزة الاستشعار هو مجرد مشرق مثل الدرجة الأولى ولكنها تتطلب إضافة فاكهه تقضي المادة الكيميائية التي يصعب إدارتها في الجسم الحي.

ونحن، بالتالي، تدليل على الاستحواذ على التحقيق مع FP واحد (Bongwoori) 8 والتحقيق المكونة من زوج الحنق (النبي 2) 12. الحنق يبني في هذا التقرير هي إصدارات فراشة VSFP-CR (البروتينات الفلورية الحساسة الجهد - البرسيم-mRuby2) 11 تتألف من المانحين الفلورية الخضراء، البرسيم، ومتقبل أحمر فلوري، mRuby2، واسمه النبي 2.242 و 2.244 النبي

figure-introduction-1
الشكل 1. نوعان من المؤشرات مشفرة وراثيا الجهد (GEVIs) تصوير في هذا التقرير (A) وFP أحادية أساس GEVI وجود مجال الاستشعار الجهد العابرة للغشاء والبروتين الفلوري. (ب) وGEVI أساس الحنق تتألف من عبر غشاء مجال الاستشعار الجهد، مانحا الحنق ومتقبل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على بروتوكول التجربة الحيوانية رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في بروتوكول الحيوان KIST 2014-001.

1. إعداد المعدات

  1. الإعداد والتصوير
    1. وضع المجهر مضان مقلوب على طاولة الاهتزاز العزلة. استخدام عالية التكبير (60X عدسة الغمر النفط مع 1.35 الفتحة العددية) عدسة موضوعية ومكعب مرشح مجهزة مرآة مزدوج اللون والمرشحات مناسبة لالبروتينات الفلورية المستخدمة في التصوير الجهد.
      ملاحظة: يستخدم هذا الإعداد مجهر مقلوب، من أجل توظيف أهداف مع ارتفاع NA، ولكن يمكن أيضا المجاهر تستقيم استخدامها. في الواقع، المجهر المقلوب هو فقط للتنمية التحقيق منذ ارتفاع الفتحة العددية (NA) عدسة الهدف يجمع مزيدا من الضوء من واحد مع NA منخفضة وبالتالي تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR، ويمكن وصفها بأنها إشارة ضوئية الذروة مقسوما على الانحراف المعياري من خط الأساسمضان) من التسجيل. وبالنسبة لغير المطورين، فإننا نوصي المجهر تستقيم لتطبيقات مثل شريحة أو في التسجيلات الجسم الحي.
    2. إعداد مصدر للضوء، على سبيل المثال، زينون مصباح قوس، ومجهزة مع مفتاح ميكانيكي لepifluorescence كفاءة التصوير واسعة المجال. توجيه الضوء إلى مجهر عن طريق دليل ضوء جبل. وعلى ضوء تمر عبر فلتر الإثارة وينعكس من خلال أول مرآة مزدوج اللون في المكعب التصفية. محاذاة ضوء لإلقاء الضوء على عينة بالتساوي مع شدة الضوء مكبر أكثر من مجال الرؤية 21.
      ملاحظة: تقليديا، تم استخدام مصباح قوس 75 واط منذ ارتفاع المصابيح القوة الكهربائية خلق أكبر ولكن لا مجال الإضاءة أكثر إشراقا. الليزر يمكن استخدام ولكن تقتصر على الطول الموجي واحد. أصبحت المصابيح أكثر إشراقا، وربما يكون في الواقع مصدر الضوء من خيار تقديم موجات متعددة ولا تتطلب مفتاح ميكانيكي.
    3. تركيب كاميرات CCD اثنين إلى fluorescسينعقد المجهر كما هو مبين في الشكل 2D.
      ملاحظة: اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا الأولى ديها قرار مكانية عالية، ويستخدم لتحديد خلية معربا عن GEVI في الغشاء البلازمي لفحصها. لإجراء تغييرات التصوير في غشاء المحتملة، تأكد من أن كاميرا CCD الثانية لديها ارتفاع معدل إطار مثل 1000 إطار في الثانية (FPS). استخدام مزدوج كاميرا محول ميناء (الشكل 2D- (3)) للتبديل مسار التصوير بين كاميرات CCD اثنين. في هذا الإعداد، يتم استخدام demagnifier لتتناسب مع صورة من عدسة الهدف على رقاقة CCD في الكاميرا CCD الثانية.
    4. تثبيت الخائن صورة بين الأول (بطيئة) والثانية (سريع) كاميرات CCD للتصوير من GEVI الحنق القائم. إدراج مكعب تصفية وجود مرآة مزدوج اللون (560 نانومتر) والمرشحات الانبعاثات اثنين (520 نانومتر / 40 و 645 نانومتر / 75) في التقسيم الصورة. وسيؤدي هذا في حقلين للعرض، واحد لمضان المانحة والآخر يمثل مضان متقبل. إزالة هذا قecond مرشح مكعب عند التصوير في GEVI مع FP واحد.
      ملاحظة: GEVI FP واحد على أساس اختبار في هذا الأسلوب هو Bongwoori الذي يستخدم FP، سوبر مسير الشمس pHluorin A227D (SE A227D). وقد تم اختيار مرشح الإثارة (472 نانومتر / 30)، مرشح الانبعاثات (497 نانومتر / تمريرة طويلة) ومرآة مزدوج اللون (495 نانومتر) على أساس لها الإثارة وانبعاث أطياف 5. عموما، يجب أن يكون الإثارة وانبعاث المرشحات أكبر تداخل مع كل أطياف fluorophore للحصول على صورة مشرقة بينما الكتل مرآة مزدوج اللون أي ضوء الإثارة تنتقل من خلال تصفية الانبعاثات. اختيار المرشحات والمرايا مزدوج اللون لتسجيل GEVI أساس الحنق الزوج 11 يتبع نفس المبدأ إلا أنه يتطلب مكعب مرشح الثاني في الخائن صورة للمراقبة المتزامنة من الجهات المانحة ومتقبل مضان. أول مكعب مرشح وضعها في خانة تصفية المجهر يحتاج الى عملية تصفية الإثارة (475 نانومتر / 23) لالبرسيم. ثم المنبعثة ووستحال luorescence من كل ضباط الإتصال إلى المكعب مرشح الثاني من خلال أول مرآة مزدوج اللون (495 نانومتر). المكعب مرشح الثاني له مرآة مزدوج اللون (560 نانومتر) والمرشحات الانبعاثات اثنين (520 نانومتر / 40 لالبرسيم و 645 نانومتر / 75 mRuby2) لأنه هكذا كل FP فصل مضان من اثنين من مختلف ضباط الإتصال.
واحد GEVI FP مقرها
(Bongwoori) 		الحنق GEVI تقوم على أزواج
(النبي 2.42 و 2.44 النبي)
الفلتر الأول مكعب وضعها في المجهر مرشح الإثارة 472 نانومتر / 30 475 نانومتر / 23
مرآة مزدوج اللون 495 نانومتر 495 نانومتر
تصفية الانبعاثات 497 نانومتر / تمريرة طويلة -
مرشح مكعب الثاني وضعت في الحزمة الخائن مرآة مزدوج اللون -
تصفية الانبعاثات 1 - 520 نانومتر / 40
تصفية الانبعاثات 2 - 645 نانومتر / 75

الجدول 1. اثنان تصفية مجموعات مختلفة تستخدم لGEVI FP وبناء واحد وGEVI تسجيلات الحنق القائم

  1. عزل الاهتزاز
    1. عدم تحميل أي معدات مع تحريك المكونات على جدول عزل الاهتزاز. تأكد من أن الكابلات التي تعلق على معدات غير معزولة هي فضفاضة لتجنب اهتزاز من العينة.
  2. التصحيح غرفة المشبك
    1. ختم الجزء السفلي من الغرفة المشبك التصحيح مع رقيقة # 0 غطاء زجاجي منذ المسافة عمل الهدف صغيرة نسبيا. هذا هو العيب من الإعداد المجهر المقلوب.
      ملاحظة: كما المقايضة وجود ارتفاع NA العدسة الشيئية، يقلل من المسافة العمل. من أجل وضع specimأون ضمن مسافة عمل قصيرة جدا، والزجاج غطاء وساترة (الخطوة 2) تحتاج إلى أن تكون رقيقة قدر الإمكان.
  3. التحكم في درجة الحرارة
    1. ضمان تدفق حل حمام من خلال وحدة تحكم في درجة الحرارة للحفاظ على خلايا مصححة حوالي 33 درجة مئوية في كافة مراحل التجربة.
  4. معدات اتصالات
    1. توصيل مكبر للصوت المشبك التصحيح ومفتاح ميكانيكي من مصدر الضوء إلى مربع القيادة حربة نيل-Concelman (BNC) من اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا سرعة عالية. وسيمكن هذا البرنامج التصوير للسيطرة على مكبر للصوت، وكاميرا، ومصدر الضوء في وقت واحد.
      ملاحظة: المكونات الكهربائية والتصوير تحتاج إلى أن تكون متزامنة من أجل توفير التسجيلات الكهربائية والبصرية في وقت واحد من النشاط الكهربائي.

figure-protocol-1
الشكل 2. تجهيزاتيتم تصفية إعداد منة التصوير الجهد مع GEVIs سير العمل التالية مسار الضوء، (A) 75W زينون مصباح قوس، (ب) ضوء الإثارة من مصباح قوس بواسطة عامل تصفية الإثارة وثم تنعكس من خلال أول مرآة مزدوج اللون قبل أن تصل إلى المرحلة العينة، أقحم في الزاوية اليمنى العليا معارض التكوين كله خلية، (C) يتم استخدام بطء سرعة الكاميرا CCD لمساعدة كل من اختيار الخلية والمشبك التصحيح، (D) الجزء الحصول على الصور. (1) ارتفاع كاميرا CCD سرعة، (2) الخائن صورة لكل من الحنق الزوج وأحادية FP GEVIs، (3) demagnifier لتناسب الصورة على رقاقة CCD في الكاميرا CCD عالي السرعة، (4) والمنفذ المزدوج محول كاميرا للتبديل مسار التصوير و (5) من بطء سرعة الكاميرا CCD مع قرار مكانية عالية لتحديد الخلية إلى التصحيح، (E & F) الحصول على الصور مع واحد-FP أساس GEVI (E) وGEVI القائم على الحنق(F). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. التعبير عن GEVIs

  1. في الجنينية البشرية الكلى 293 الخلايا
    1. ثقافة الجنينية البشرية الكلى 293 (كلوة 293) الخلايا مع Dulbecco ومتوسطة النسر المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 (5٪ CO 2). استخدام صحن زراعة الأنسجة بقطر 100 ملم و 20 ملم الارتفاع. بدء الثقافة مع 2 × 03-06 أكتوبر × 10 3 خلية / سم 2 واحتضان حتى تصل إلى 80-90٪ confluency لترنسفكأيشن لاحق.
    2. يوم ترنسفكأيشن، نضح في وسائل الإعلام خلية وغسل بلطف مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و. تفريق الخلايا كلوة 293 مع 0.25٪ حل التربسين-EDTA لمدة 1-2 دقائق، ونضح الحل والاستفادة بلطف جانب طبق لفصل جملتعلمي اللغة اإلنكليزية. إضافة DMEM جديدة (10٪ FBS) وفصل الخلايا تجمعت من قبل pipetting. تحديد تركيز خلية باستخدام عدادة الكريات.
    3. وضع 0،08-0،13 مم، مم 10 coverslips مع بولي-L-يسين في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا المغلفة مسبقا. البذور الخلايا كلوة 293 coverslips على على 1 × 10 5 خلية / سم 2 كثافة الخلية.
      ملاحظة: منذ كلوة 293 الخلايا قادرة على تشكيل تقاطعات الفجوة مع بعضها البعض، وعدد البذور يحتاج لانتاج الخلايا المعزولة.
    4. عابر transfect الخلايا مع بناء الجين المناسب ترميز GEVI باستخدام كاشف lipofection التالية تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: بنيات الجينات المستخدمة لهذه الخطوة الاستفادة pcDNA3.1 (Bongwoori) وpUB2.1 (النبي 2.242) كما ناقلات العمود الفقري. كان المبلغ من استخدام الحمض النووي 100 نانوغرام لكل ساترة. ومع ذلك، تحتاج شروط ترنسفكأيشن أن يكون تصميما تجريبيا لكل GEVI لفحصها.
  2. في الورك الماوس نأتالخلايا العصبية الأولية pocampal
    1. تشريح الحصين من اليوم الجنينية 17 الفئران C57BL6 / N ثم فصل الخلايا العصبية قرن آمون كما هو موضح سابقا 22،23.
    2. لوحة الخلايا العصبية نأت على بولي-D-يسين المغلفة 0،08-0،13 مم، 10 coverslips مم في 1 × 10 5 خلية / مل كثافة الخلية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 (5٪ CO 2).
    3. Transfect الخلايا العصبية فصل عابر في 6-7 أيام في المختبر (DIV) مع بناء الجين ترميز GEVI باستخدام فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن الكاشف كما هو موضح سابقا (24).
      ملاحظة: بنيات الجينات المستخدمة لهذه الخطوة الاستفادة pcDNA3.1 (Bongwoori) وpUB2.1 (النبي 2.244) كما ناقلات العمود الفقري. وكانت كمية الحمض النووي المستخدمة 1 ميكروغرام لكل ساترة. مرة أخرى، لا بد الظروف ترنسفكأيشن أن يكون تصميما تجريبيا لكل GEVI اختبارها.
  3. التحقق من مستوى التعبير قبل الجهد معهد العالم العربيجينج
    1. تأخذ لوحة زراعة الأنسجة من الحاضنة CO 2 ومراقبة مضان من الخلايا transfected تحت المجهر epifluorescence.
    2. بعد التأكد من مضان من الغشاء، ونقل ساترة إلى غرفة الترقيع للتصوير الجهد في القسم 3.
      ملاحظة: يتم إجراء التصوير الجهد 16-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. لكن، وكما لها البروتينات الفلورية مختلفة مرات نضوج مختلفة، بعض GEVIs بحاجة الى مزيد من الوقت في مرحلة ما بعد ترنسفكأيشن. على سبيل المثال، أزواج الحنق التي تحتوي على mRuby2 في هذا البروتوكول قد يستغرق وقتا أطول للتعبير منذ نضوج mRuby2 يأخذ فترة أطول كثيرا من البرسيم 11. يجب فحص مضان من كل من الجهات المانحة ومتقبل.

3. بروتوكول التصوير الجهد

  1. اختيار الخلية الصحيحة مع التعبير غشاء جيد
    1. باستخدام المجهر، والعثور على الخلايا السليمة (الشكل 4B) أن يظهر قويامضان المحلية غشاء مقارنة مضان الداخلي. ليس محاولة لرأب الصدع خلايا مدورة. خلايا دائرية إما تقسيم أو يموتون ويصعب التصحيح. تطبيق نبض اختبار من 5.0 فولت في ميللي ثانية السعة و 5.0 في مدة لمساعدة التجارب المشبك التصحيح اللاحقة.
  2. إعداد خلية للتصوير الجهد
    1. بعد اختيار الخلية إلى التصحيح، وضع ماصة التصحيح المشبك فوق الخلية. جلب ماصة أسفل حتى يلمس بلطف غشاء الخلية. في هذه الخطوة، ومراقبة 1 MΩ - 2 ارتفاع MΩ في مقاومة الغشاء على المشبك التصحيح برنامج 25.
      ملاحظة: أحيانا، يمكن أن يحدث جيد ختم جيجا أوم ببساطة عن طريق لمس غشاء الخلية. طالما أن ختم جيجا أوم مستقرة، وينبغي أن تكون على ما يرام.
    2. إنشاء ختم جيجا أوم عن طريق تطبيق بلطف ضغط سلبي من خلال ماصة. تعيين إمكانات ماصة في إمكانية عقد المرجوة.
    3. مع الحفاظ على ختم جيجا أوم، صورة عشرخلية ه مع كاميرا CCD عالية السرعة والتركيز على منطقة الغشاء.
    4. تمزق غشاء الخلية من خلال تطبيق نبضات شفط عن طريق الفم أو حقنة برفق لجعل تكوين خلية كاملة 26.
    5. صورة التصحيح فرضت خلية ضمن تكوين خلية المشبك كله وفقا لتصميم تجريبي باستخدام برامج التصوير
      1. بدء برامج التصوير. انقر على [يكتسب] - القائمة [SciMeasure كاميرا] لفتح "CCD الحصول على 'صفحة.
      2. إنشاء ملف بيانات جديد لحفظ الصور.
      3. انقر [التماثلية إخراج] ثم [اقرأ على ASCII] لفتح ملف بروتوكول النبض لإجراء التصوير. انقر على 'المتوسط ​​التكرار الداخلية "إذا كان يحتاج البيانات إلى أن متوسط. ثم أغلق "التماثلية إخراج 'صفحة.
        ملاحظة: هذا البروتوكول نبض يحتاج إلى أن تكون مصممة وحفظها كملف ". TXT" وفقا للغرض من كل تجربة قبل هذه الخطوة.
      4. تعيين مكتسبات معينةالمعلمات ition من صفحة "CCD اكتساب". إدخال القيم المحددة ل 'عدد من الإطارات لاقتناء "و" عدد من التجارب ".
        ملاحظة: يتم تحديد عدد الإطارات من سرعة اكتساب وتوقيت بروتوكول النبض. على سبيل المثال، إذا التصوير في 1 كيلو هرتز، 1000 إطارات يساوي 1 ثانية من وقت التسجيل.
      5. انقر على [أخذ البيانات (بصريات + BNC)] الزر لبدء التسجيل. في حين أن التصوير الجهد يجري، مشاهدة نافذة الذبذبات من برنامج المشبك التصحيح لضمان استقرار تكوين خلية كاملة في جميع أنحاء تسجيل.
        ملاحظة: لاختبار مدى الجهد استجابة لGEVI، وحجم إشارة في ΔF / قيمة F أو القرار الزماني في جميع أنحاء مجموعة الجهد الفسيولوجية، إجراء كلها خلية المشبك الجهد التجربة مع نبضات الجهد بروتوكول النبض بعد أن صعد تتراوح بين -170 بالسيارات إلى 130 فولت. لتحديد أداء GEVI في حل إمكانات العمل أثار من الوجاهة مثقفالخلايا العصبية راي، صورة الخلية تحت التكوين المشبك الحالي خلية كاملة.

4. الحصول على البيانات

  1. حساب ΔF / F
    1. بدء برامج التصوير. انقر على [FILE] - [قراءة البيانات أرشيف] لفتح ملف بيانات ليتم تحليلها. مراقبة صورة خلية في لكثافة يستريح الخفيفة (مؤشر القائمة الحمراء) على الجانب الأيمن
      ملاحظة: المتوسطات البرمجيات الأطر 5 الأولى لتحديد مؤشر القائمة الحمراء للتسجيل.
    2. انقر على "مشاهدة BNCs" لتحقيق القيم الحالية والجهد يقاس على الشاشة.
    3. تغيير وضع الصفحة من "إطار RLI 'إلى' الطرح الإطار" إلى الاستفادة من وظيفة إطار الطرح لتحديد بكسل مع الإشارات الضوئية استجابة. هذه هي القوة الحقيقية التصوير لأن كل بكسل يمكن فحص التغيرات المحتملة في مضان.
    4. حدد نقطتين الوقت (F 0 و F 1) لالطرح. تحديد أي منطقة من الخلية هوتظهر إشارات استجابة لغشاء تغيير محتمل.
      ملاحظة: SNR للصور إطار الطرح يمكن تحسينها من خلال اختيار إطارات متعددة لكل نقطة زمنية في المتوسط ​​زمنيا الإشارة. البرنامج يطرح متوسط ​​شدة الضوء مأخوذة من الإطارات المحددة ويحسب F 1 -F 0 القيم (ΔF). عادة واحد يختار نقطة زمنية حصلت على عقد النقطة المحتملة ووقت آخر اتخذت خلال فترة التحفيز.
    5. تعيين بكسل التي تحتاج إلى تحليل عن طريق سحب أو النقر فوق كل بكسل مع فأرة الكمبيوتر. مراقبة تمثيل رسومي من متوسط ​​كثافة مضان من البيكسل المحددة على الجانب الأيسر من نافذة البرنامج. أرقام 4B 5B وتظهر الصور التمثيلية من تحليل إطار الطرح.
    6. تقسيم بكسل تطرح من قبل RLI (F 0). انقر على [القسمة على مؤشرات مؤشر القائمة الحمراء] للحصول على القيم ΔF / F
  2. تصدير البيانات
      حساب القيم ΔF / F لكل خطوة الجهد لمواصلة تحليل خصائص الاستشعار عن الجهد GEVI ل. استخدام هذه القيم لرسم الرسوم البيانية مثل ΔF / F مقابل الجهد للحصول على بيانات لاحقة يحلل.
  3. إزالة الرسوم البيانية التيار والجهد من قبل unclicking القائمة 'مشاهدة BNCs ". الذهاب إلى [الناتج] - [حفظ آثار وعرض (ASCII)] لتصدير التتبع مضان في تنسيق ملف ASCII لتحليل تركيب منحنى بواسطة برنامج الرسوم البيانية القياسية.

تحليل 5. البيانات

  1. الجهد الملكية الاستشعار من GEVI
    1. رسم التغيير مضان مقابل الرسم البياني الجهد (اناث) من خلال التآمر القيم ΔF / F مقابل الجهد في برنامج تحليل البيانات. تناسب منحنى إلى وظيفة بولتزمان (الجدول 2) لتحديد مدى الجهد للإشارة الضوئية عن طريق النقر [تحليل] - [تركيب] - [صالح السيني] - [الحوار فتح]، ثم اختر وظيفة بولتزمان.
      ملاحظة: من المناسب أن وظيفة يجعل من الامكانه لتوصيف خصائص الاستشعار عن الجهد تحقيقات الجهد مختلفة أو لمقارنة أدائهم في خلايا مختلفة. وظيفة بولتزمان يمكن استخدامها لتحقيقات اختبارها في هذه الورقة لأن منحنيات اناث من هذه التحقيقات تبين نمط السيني.
    2. تطبيع كل قيمة ΔF / F باستخدام القيم الأولية والنهائية (A 1 و A 2) وتحسب على أساس وظيفة.
      ملاحظة: في معادلة بولتزمان، والحد الأدنى هو A 1 والحد الأقصى هو A 2. للتطبيع، واستخدام البرمجيات تطبيق جدول بيانات لضبط القيم ΔF / F من خلال تحديد A 1 صفر وA 2 واحد. متوسط ​​في ΔF تطبيع / القيم F وحساب الخطأ المعياري للتحليل الإحصائي.
    3. Replot وΔF تطبيع / القيم F مقابل الجهد كما هو موضح سابقا في القسم 5.1.1).
  2. سرعة الاستجابة البصرية
    1. فتح ملف ASCII المكتسبة من الخطوة 4.2.2) مع تحليل البياناتبرنامج ورسم التتبع ΔF / F مقابل الوقت.
    2. انقر على "محدد البيانات" في برنامج تحليل البيانات وتحديد نقطة زمنية واحدة المقابلة لبداية نبضة الجهد صعدت ونقطة زمنية ثانية عند الإشارة الضوئية قد وصل إلى حالة من الثبات. تناسب هذه المجموعة على حد سواء وظيفة تسوس الأسي مفردة ومزدوجة عن طريق النقر [تحليل] - [تركيب] - [صالح الأسي] - [الحوار فتح]، واختيار وظيفة تسوس الأسي. بلغ تناسب أفضل.
      ملاحظة: من خلال تركيب لوظائف الاضمحلال الأسي واحدة أو مزدوجة، الثوابت الوقت كميا ممثلة τ يمكن الحصول عليها. وهذا سوف يساعد المجربون مقارنة حركية قياساتهم القيام به مع مؤشرات الجهد مختلفة. تتبع مضان قد تظهر مكونات السريعة والبطيئة التي يمكن وصفها مع ضعف وظيفة تسوس الأسي. في هذه الحالة، فإن حساب يؤدي في اثنين من الثوابت الوقت مع سعة مختلفة.
    3. حساب الالبريد الثوابت τ المرجح للمقارنة بين حركية تحقيقات العارضة عنصرين الزمنية للتحقيقات مع مكون واحد.
      ملاحظة: يتم احتساب تاو المرجح كمجموع τ 1 مضروبا في السعة النسبية، A 1، بالإضافة إلى τ 2 مضروبا في السعة النسبية، A 2، على النحو المحدد في الصيغة التالية: figure-protocol-2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عابر خلايا transfected يمكن أن يحمل تفاوت كبير في كثافة مضان ودرجة التعبير غشاء البلازما. حتى على نفس ساترة بعض الخلايا سيكون لها مستويات مختلفة من مضان الداخلي. وهذا هو الأرجح بسبب كمية العامل ترنسفكأيشن تمتصه الخلايا. في بعض الأحيان، والكثير من التعبير يتسبب الخلية لتجربة استجابة البروتين تكشفت مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج 27 (مشرق، تقريب الخلايا، مع مضان الداخلية عالية). ولذلك حذر المجرب لاختبار كل من خلايا مشرق والخلايا قاتمة مع م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم الجهاز العصبي الجهد في عدة طرق مختلفة، وتثبيط يسبب فرط طفيف، ومدخلات متشابك يؤدي إلى الاستقطاب طفيف والعمل النتائج المحتملة في تغيير الجهد الكبير نسبيا. القدرة على قياس التغيرات في غشاء المحتملة التي كتبها GEVIs توفر إمكانات واعدة من تحليل العديد من مكونات الدوائر العصبية في وقت واحد. في هذا التقرير ونحن لشرح طريقة أساسي لإجراء تغييرات التصوير في غشاء المحتملة باستخدام GEVIs.

مفتاح رئيسي للتغييرات التصوير ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج المعهد العالمي للمستوى (WCI) التابع للمؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا بتمويل من وزارة التعليم والعلوم والتكنولوجيا الكورية WCI 2009-003 ومشروع البرنامج المؤسسي للمعهد الكوري للعلوم والتكنولوجيا 2E24210. تم دعم Sungmoo Lee من قبل برنامج زمالة الدكتوراه العالمي (NRF-2013H1A2A1033344) التابع لمؤسسة البحوث الوطنية (NRF) التابعة لوزارة التعليم (وزارة التربية والتعليم ، كوريا).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
المجهر المقلوبأوليمبوسIX71
60X عدسة موضوعية (فتحة عددية = 1.35)أوليمبوسUPLSAPO 60XO
مرشح الإثارةSemrock  FF02-472 / 30لتصوير الجهد ل pHluorin فائق مسير الشمس في مرآة Bongwoori
DichroicSemrockFF495-Di03-25x36
مرشح الانبعاثSemrockFF01-497 / LP
75W مصباح قوس زينونCAIRNOptoSource Illuminatorمصابيح LED والليزر هي أيضا مصادر إضاءة فعالة
كاميرا CCD بطيئة السرعةهيتاشيKP-D20BU
محول الكاميرا ثنائي المنفذOlympusU-DPCAD
كاميرا CCD عالية السرعةRedShirtImaging ، LLCNeuroCCD-SM
مقسم الصورCAIRNOptosplit 2
مرشح الإثارةSemrockFF01-475 / 23-25لتصوير الجهد لزوج FRET GEVI القائم على FRET الذي يتكون من Clover و mRuby2)
مرآة ثنائية اللونSemrockFF495-Di03-25x36
مرشح الانبعاثChromaET520 / 40
مرآة ثنائية اللونSemrockFF560-FDi01-25X36
مرشح الانبعاثChromaET645 / 75
نظام عزل الاهتزازالأنظمة الحركية250BM-IC ، 5702E-3036-31
غرفة الترقيعWarnerRC-26G ، 64-0235
# 0 غطاء زجاجي صغير (22 × 40 مم)علوم المجهر الإلكتروني72198-20
جهاز التحكم في درجة الحرارةأدوات وارنرTC-344B
# 0 (0.08 ~ 0.13 مم) - غطاء زجاجي بقطر 10 ممتيد بيلا260366
عامل LipofectionLife Technologies11668-027
كاشف فوسفات الكالسيومClontech - Takara631312
مكبر للصوت HEKAEPC 10 USB مكبر
الحصول على البيانات متعدد القنواتبرنامج الحصول على البيانات HEKAPatchmaster
برنامج الحصول على الصور وتحليلهاRedShirtImagingNeuroplex
برنامج تطبيق جدول بياناتMicrosoftMicrosoft Excel 2010
OriginLabOriginPro 8.6.0
مزيل المؤشرQioptiq LINOSمقرنة الكاميرا القياسية Optem 0.38x SC38 J المشبك
مجهر متحد البؤرنيكون نيكونA1R مجهر
مضاد للبهتان كاشفLife TechnologiesP36930
أدوات للصوت برنامج متحد البؤر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
  3. Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
  5. Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
  6. Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
  7. St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
  8. Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
  9. Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012(2015).
  10. Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440(2007).
  11. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
  12. Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585(2015).
  13. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
  14. Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894(2014).
  15. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
  16. Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674(2014).
  17. Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625(2014).
  18. Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
  19. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
  20. Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
  21. Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
  22. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  23. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  24. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
  25. Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
  26. Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
  27. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
  28. Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
  29. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514(2008).
  30. Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetically Encoded Voltage IndicatorsFluorescent Voltage SensorsFRET based GEVISingle Fluorescent ProteinImage SplitterWhole Cell Patch ClampHEK293 CellsMembrane Potential ImagingFluorescence Change AnalysisCCD Camera Acquisition

Related Articles