يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

أو-تفاعل Slp1 البوليمرات واحد رقائق من

10.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53572

⸱

يناير 19, 2016

 ,  , 
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

في هذه المقالة

ملخص

للحصول على معلومات أساسية حول امتصاص الذهب وإعادة تدويره من الأنظمة المائية ، تم فحص تفاعل الجسيمات النانوية Au (III) و Au (0) على بروتينات الطبقة S. تم فحص امتصاص بوليمرات البروتين بواسطة ICP-MS وتلك الخاصة بالطبقات الأحادية البروتينية بواسطة QCM-D. يتيح AFM اللاحق تصوير الهياكل النانوية.

الملخص

< p class = 'jove_content'> في هذا المنشور ، تم وصف سلوك امتصاص الذهب لبروتينات الطبقة السطحية (الطبقة S) (Slp1) من Lysinibacillus sphaericus JG-B53. ترتب هذه الجزيئات الحيوية في مصفوفات ثنائية الأبعاد شبه بلورية على الأسطح ، وتربط المعادن ، وبالتالي فهي مثيرة للاهتمام للعديد من التطبيقات التقنية الحيوية ، مثل مواد الامتصاص الحيوي لإزالة أو استعادة عناصر مختلفة من البيئة والعمليات الصناعية. إن ترسب الجسيمات النانوية Au (0) على طبقات S ، إما عن طريق التوليف الموجه للطبقة S 1 أو امتصاص الجسيمات النانوية ، يفتح إمكانيات جديدة للتطبيقات الحسية المتنوعة. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد وصفت خصائص الامتصاص الحيوي للطبقات S 2-5 ، إلا أن الفهم الأعمق للتفاعل بين البروتين والبروتين والبروتين والمعدن لا يزال يمثل تحديا. في الدراسة التالية ، تم استخدام قياس الطيف الكتلي المقترن بالحث (ICP-MS) للكشف عن امتصاص المعادن بواسطة طبقات S المعلقة. ارتبط هذا بقياسات التوازن الدقيق لبلورات الكوارتز مع مراقبة التبديد (QCM-D) ، والتي تسمح بالكشف عبر الإنترنت عن تكوين طبقة أحادية البروتين وترسب المعدن ، وبالتالي فهم أكثر تفصيلا لربط المعادن.

أشارت نتائج ICP-MS إلى أن ارتباط Au (III) ببوليمرات الطبقة S العالقة يعتمد على الأس الهيدروجيني. تم الحصول على الحد الأقصى للارتباط ل Au (III) عند الرقم الهيدروجيني 4.0. مكنت تحقيقات QCM-D من اكتشاف امتصاص Au (III) بالإضافة إلى ترسب Au (0) -NPs في الوقت الفعلي أثناء التجارب في الموقع. علاوة على ذلك ، سمحت هذه الطريقة بدراسة تأثير ربط المعدن على استقرار شبكة البروتين ل Slp1. يمكن تصور الخصائص الهيكلية واستقرار طبقة البروتين مباشرة بعد تجربة QCM-D باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). في الختام ، يوفر الجمع بين هذه الطرق المختلفة فهما أعمق لارتباط المعادن بواسطة بروتينات الطبقة S البكتيرية في المعلق أو كطبقات أحادية على الخلايا البكتيرية أو الأسطح المعاد تبلورها

المقدمة

نظرا لتزايد استخدام الذهب لعدة تطبيقات مثل الالكترونيات والمواد الحفازة، أجهزة الاستشعار، أو الأدوات الطبية، نما الطلب على هذا المعدن النفيس أكثر من مرة خلال السنوات القليلة الماضية "6-9. يتم الافراج عن الذهب، فضلا عن العديد من المعادن الثمينة والثقيلة الأخرى في البيئة من خلال النفايات الصناعية السائلة في تركيزات المخففة، من خلال أنشطة التعدين، والتخلص من النفايات 7،8،10، على الرغم من أن معظم التلوث البيئي بالمعادن الثقيلة أو الثمينة هو عملية مستمرة الناجمة أساسا عن الأنشطة التكنولوجية. وهذا يؤدي إلى تدخل كبير من النظم الإيكولوجية الطبيعية، ويمكن أن تهدد صحة الإنسان 9. معرفة هذه النتائج السلبية يشجع على البحث عن تقنيات جديدة لإزالة المعادن من النظم الإيكولوجية والتحسينات الملوثة في إعادة تدوير المعادن من مياه الصرف الصناعي. أساليب الفيزيائية والكيميائية راسخة مثل هطول الأمطار أو التبادل الأيوني ليست فعالة جدا، وخصوصا في عاليةلاي المخفف حلول 7،8،11. Biosorption، إما مع المعيشة أو الكتلة الحيوية الميتة، هو بديلا جذابا لمعالجة مياه الصرف الصحي 10،12. استخدام مثل هذه المواد البيولوجية يمكن أن تقلل من استهلاك المواد الكيميائية السامة. وقد وصفت العديد من الكائنات الحية الدقيقة لتتراكم أو شل المعادن. على سبيل المثال، خلايا Lysinibacillus كروي (L. كروي) JG-A12 أظهرت قدرات عالية ملزمة للمعادن الثمينة، على سبيل المثال، PD (II)، وحزب العمال (II)، والاتحاد الافريقي (III)، والمعادن السامة الأخرى مثل الرصاص (II) أو U (VI) 4،13، خلايا العصوية الضارية لالكروم (VI) 14، خلايا خميرة الخباز لحزب العمال (II) والمشتريات (II) 15، وشلوريلا المبتذلة ل Au (III) وU (VI) 16 17. الربط المعادن السابقة مثل الاتحاد الافريقي (III)، PD (II)، وحزب العمال (II) كما تم الإبلاغ عن منتزعة الكبريت desulfuricans 18 وL. كروي JG-B53 19،20. ومع ذلك، لا آلالميكروبات ل ربط كميات عالية من المعادن وتطبيقها كمادة sorptive محدودة 12،21. وعلاوة على ذلك، معدنية سعة ملزم يعتمد على معايير مختلفة، مثل تكوين الخلية، وتستخدم المكون الحيوي، أو البيئية والظروف التجريبية (درجة الحموضة، والقوة الأيونية، ودرجة الحرارة وما إلى ذلك). دراسة معزولة شظايا جدار الخلية 22،23، مثل الدهون غشاء، ببتيدوغليكان، البروتينات، أو غيرها من المكونات، ويساعد على فهم المعدن عمليات الخلايا الكاملة المعقدة التي شيدت 8،21 ملزمة.

مكونات الخلية التي تركز على هذه الدراسة هي بروتينات S-طبقة. البروتينات S-طبقة هي جزء من المغلف الخلية الخارجي من العديد من أنواع البكتيريا والعتيقة، والتي تشكل حوالي 15-20٪ من مجموع كتلة البروتين من هذه الكائنات. واجهة الأولى للبيئة، فإن هذه المركبات الخلية يؤثر بقوة على خصائص الامتصاص البكتيرية 3. البروتينات S-طبقة مع الأوزان الجزيئية تتراوح بين أربعينلتنتج مئات من كيلو دالتون داخل الخلية، ولكن يتم تجميعها خارج حيث أنها قادرة على تشكيل طبقات على الأغشية الدهنية أو البوليمر مكونات جدار الخلية. مرة واحدة معزولة، ما يقرب من جميع S-طبقة بروتينات لها خاصية ذاتية للعفويا التجمع الذاتي في التعليق، في واجهات، أو على الأسطح المستوية أو تشكيل أنبوب يشبه الهياكل 3. سمك أحادي الطبقة البروتين يعتمد على البكتيريا وضمن مجموعة من 5-25 نانومتر 24. بشكل عام، يمكن الهياكل بروتين S-طبقة تشكلت لديهم المائل (P1 أو P2)، مربع (P4)، أو سداسية (P3 أو P6) التماثل مع ثوابت شعرية من 2،5 حتي 35 نانومتر 3،24. يبدو أن تشكيل شعرية ليكون في كثير من الحالات تعتمد على الكاتيونات ثنائي التكافؤ وبشكل رئيسي على الكالسيوم 2+ 25،26، راف، J. آخرون. S-طبقة nanocomposites استنادا للتطبيقات الصناعية في القائمة على البروتين المهندسة النانو. (محرران Tijana Z. غروف وAitziber L. Cortajarena) (الوثاب، 2016 (المقدمة)). ومع ذلك، فإن سلسلة التفاعل الكامل للطي مونومر، التفاعل مونومر-مونومر، تشكيل شعرية، ودور المعادن المختلفة، وخاصة من الكاتيونات ثنائي التكافؤ مثل الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+، لا تزال غير مفهومة تماما.

سلالة إيجابية الجرام L. تم عزل كروي JG-B53 (التي أعيدت تسميتها من عصيات كروي بعد تصنيف النشوء والتطور الجديد) 27 من كومة من النفايات تعدين اليورانيوم "Haberland" (Johanngeorgenstadt، ساكسونيا، ألمانيا) 4،28،29. في ظيفية البروتين S-طبقة (Slp1) يمتلك شعرية مربع، الوزن الجزيئي من 116 كيلو دالتون 30، وسمك ≈ 10 نانومتر في العيش البكتيريا الخلايا 31. في دراسات سابقة، وقد تحقق تشكيل في المختبر من طبقة البروتين المغلقة ومستقرة مع سمك حوالي 10 نانومتر في أقل من 10 دقيقة 19. سلالة ذات الصلة L. كروي JG-A12، أيضا عزل من "Haberland" كومة، يمتلك قدرات معدنية عالية ملزمة وأظهرت معزول بروتين S-طبقته على معدلات الامتصاص الجيدة الكيميائية عالية والاستقرار الميكانيكية والمعادن الثمينة مثل الاتحاد الافريقي (III)، وحزب العمال (II)، وبالشلل الرعاش (II) 4،32،33. هذا الربط من المعادن الثمينة هو أكثر أو أقل محددة لبعض المعادن ويعتمد على توفر مجموعة وظيفية على سطح البروتين الخارجي والداخلي من البوليمر والمسام، والقوة الأيونية، وقيمة الرقم الهيدروجيني. المجموعات الوظيفية ذات الصلة للتفاعل المعدن من البروتينات COOH-، NH 2 - OH-، PO 4 -، SO 4 - وستتناول ما. من حيث المبدأ، والقدرات المعادن ملزم فتح مجموعة واسعة من التطبيقات، راف، J. آخرون. S-طبقة nanocomposites استنادا للتطبيقات الصناعية في القائمة على البروتين المهندسة النانو. (محرران Tijana Z. غروف وAitziber L. Cortajarena) (الوثاب، 2016 (مقدم)). على سبيل المثال، كمكونات biosorptive لإزالة أو الانتعاشمن المعادن السامة أو قيمة المنحل، قوالب لتخليق أو ترسب محددة من الجسيمات النانوية منظم بانتظام المعدنية (NPS) لالحفز، وغيرها من المواد الهندسة الحيوية مثل طبقات الحيوية الحسية 3،5،18،33. ترتيب بانتظام صفائف NP مثل الاتحاد الافريقي (0) يمكن استخدام -NPs لتطبيقات رئيسية تتراوح بين الإلكترونيات الجزيئية وأجهزة الاستشعار، أجهزة التخزين كثافة عالية جدا، والمحفزات لCO للأكسدة 34-37. تطوير مثل هذه التطبيقات والتصميم الذكي لهذه المواد تستدعي فهما أعمق لآليات ملزمة المعادن الأساسية.

ومن الشروط الأساسية لتطوير مثل هذه المواد الحيوي القائم هو تنفيذ موثوق من طبقة واجهة بين جزيء حيوي وسطح الفني 38،39. على سبيل المثال، polyelectrolytes تجميعها مع طبقة من قبل طبقة (LBL) تقنية 40،41 استخدمت بوصفها طبقة واجهة لالتبلور من البروتينات S-طبقة 39 . هذه واجهة تقدم طريقة سهلة نسبيا لأداء طلاء البروتين بطريقة متكررة والكمية. عن طريق إجراء تجارب مختلفة مع وبدون تعديل مع المروجين لاصق، فمن الممكن لجعل البيانات المتعلقة حركية طلاء والاستقرار طبقة، وتفاعل المعادن مع الجزيئات الحيوية 19،42، راف، J. آخرون. S-طبقة nanocomposites استنادا للتطبيقات الصناعية في القائمة على البروتين المهندسة النانو. (محرران Tijana Z. غروف وAitziber L. Cortajarena) (الوثاب، 2016 (مقدم)). ومع ذلك، ليست مفهومة تماما الآلية المعقدة لامتصاص البروتين والتفاعل بروتين السطح. وبخاصة تكنولوجيا المعلومات على التشكل، والتوجه نمط، وكثافة الطلاء ما زال مفقودا.

وقد اجتذب الكوارتز الكريستال توازن دقيق مع مراقبة تبديد (QCM-D) تقنية الاهتمام في السنوات الأخيرة كأداة لدراسة امتصاص البروتين، حركية طلاء، والتفاعل المواليةسيرورات على مقياس النانومتر 19،43-45. هذا الأسلوب يسمح للكشف تفصيلي لامتصاص الكتلة في الوقت الحقيقي، ويمكن استخدامها كمؤشر لعملية الذاتي تجميع البروتين واقتران الجزيئات وظيفية على الشبكات البروتين 19،20،42،46-48. وبالإضافة إلى ذلك، والقياسات QCM-D تفتح إمكانية دراسة عمليات التفاعل معدنية مع طبقة البروتينية في ظل الظروف البيولوجية الطبيعية. في دراسة حديثة، والتفاعل من البروتين S-طبقة بالمعادن المختارة مثل الاتحاد الأوروبي (III)، والاتحاد الافريقي (III)، PD (II)، وحزب العمال (II) وقد درس مع QCM-D 19،20. طبقة البروتين كثف يمكن أن تكون بمثابة نموذج مبسط لجدار الخلية البكتيريا إيجابية الجرام. دراسة هذا المكون واحد يمكن أن تسهم في فهم أعمق للتفاعل المعدن. ومع ذلك، فقط التجارب QCM-D لا تسمح بيانات بخصوص الهياكل السطح والتأثيرات من المعادن إلى البروتين. تقنيات أخرى ضرورية للحصول على هذه المعلومات. أحد نقاط البيعsibility عن التصوير الحيوي النانو والحصول على معلومات عن الخصائص الهيكلية هي القوة المجهر الذري (AFM).

وكان الهدف من الدراسة التي قدمت للتحقيق في الامتصاص من الذهب (الاتحاد الافريقي (III) والاتحاد الافريقي (0) -NPs) للبروتينات S-طبقة، ولا سيما Slp1 من L. كروي JG-B53. وقد أجريت تجارب على البروتينات مع وقف التنفيذ على نطاق ودفعة في مجموعة ودرجة الحموضة 2،0-5،0 باستخدام ICP-MS ومع يجمد S-طبقات باستخدام QCM-D. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقيق تأثير محلول الملح المعدنية على استقرار شعرية مع دراسات AFM اللاحقة. الجمع بين هذه التقنيات يساهم في التوصل إلى فهم أفضل للفي المختبر عمليات التفاعل المعدن كأداة لتعلم المزيد حول الأحداث على الخلايا البكتيرية كاملة بشأن الصلات المعادن محددة ملزمة. هذه المعرفة أمر بالغ الأهمية لتطوير مواد التصفية المطبقة لاستخلاص المعادن من أجل حماية البيئة والحفاظ على إعادة ليس فقطمصادر 49، ولكن أيضا لتطوير صفائف تلك المصادر المعدنية أمر غاية في التطبيقات التقنية المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الكائنات الدقيقة وزراعة الأحكام

ملاحظة: تم إجراء كافة التجارب تحت ظروف معقمة L. تم الحصول كروي JG-B53 من ثقافة الحفاظ البرد 29،30.

  1. نقل البرد الحفاظ على ثقافة (1.5 مل) تحت مقاعد البدلاء النظيفة إلى 300 مل العقيمة مرق مغذي (NB) وسائل الاعلام (3 ز / L استخراج اللحوم، 5 ز / L ببتون، 10 غرام / لتر كلوريد الصوديوم). بعد ذلك يحرك الحل لا يقل عن 6 ساعة عند 30 ° C للحصول على ما قبل الثقافة للزراعة.
  2. زراعة البكتيريا في الظروف الهوائية في NB وسائل الإعلام في الرقم الهيدروجيني = 7.0، 30 ° C في 70 L تحجيم مفاعل حيوي البخار في المكان. لذلك، وملء المفاعل ≈ 57 لتر ماء منزوع الأيونات. إضافة وحل سائل الإعلام NB الصلبة مباشرة في مفاعل حيوي (تركيزات انظر أعلاه).
    1. بالإضافة إلى إضافة عامل مضاد الرغوة (30 ميكرولتر / L NB-وسائل الاعلام) إلى وسائل الإعلام لقمع تشكيل رغوة خلال زراعة، ثم الأوتوكلاف (122 درجة مئوية، ودرجة الحرارة عقد من الزمن 30 دقيقة) وسائل الإعلامداخل منشأة المفاعل.
  3. تهدئة الإعلامية وتنفيذ كامل تشبع الأكسجين. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 (باستخدام 1 MH 2 SO 4 و 2 M هيدروكسيد الصوديوم) وبدء التلقيح الآلي ل300 مل قبل الثقافة. بدء تسجيل بيانات المعلمات زراعة عند نقطة التلقيح. تسجيل المعلمات على الانترنت على سبيل المثال، مستوى الأكسجين الذائب (DO 2)، وحمض وقاعدة بالإضافة إلى ذلك، وقيم درجة الحموضة داخل زراعة.
    1. مراقبة نمو البكتيريا عبر الإنترنت من خلال القياسات التعكر غير الغازية.
  4. أداء عينات إضافية بعد كل ساعة من زراعة وتحديد مزيد من المعلمة مثل الوزن الحيوي الجافة (BDW) وحاليا الضوئية الكثافة (OD). لذلك، وجمع 20 مل زراعة مرق في كل نقطة أخذ العينات تحت ظروف معقمة.
    1. تحديد متواجد حاليا OD بواسطة القياسات الضوئية للامتزاز في 600 نانومتر. استخدام معقم مرشح NB-المتوسطة كقيمة فارغة. الخلفإيه الوصول الامتزاز> 0.4 تمييع تعليق الخلية التالية الخطي للقانون لامبرت-البيرة.
    2. لتحديد BDW الطرد المركزي 1-5 مل من تعليق البكتيرية (اعتمادا على كثافة الخلية) في 5000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تجفيف بيليه الخلية التي تم الحصول عليها في 105 درجة مئوية في تسخين الفرن حتى الاستقرار الشامل وقياس كتلة بيليه.
  5. التقاط صور مجهرية مع المرحلة البصرية المجهر البحوث التباين في 400 و 1000 التكبير أضعاف (الطوري المكثف 2 و 3 على التوالي) للتحقق من نمو البكتيريا وكوسيلة لمراقبة التلوث المتبادل.
  6. بعد الوصول إلى مرحلة النمو الأسي الكشف عنها بواسطة الانترنت تفعل 2 وتعكر على الانترنت، حصاد الكتلة الحيوية من خلال التدفق من خلال الطرد المركزي في 15000 x ج، 4 ° C، ويغسل الكتلة الحيوية مرتين مع العازلة القياسي (50 ملي تريس، 10 ملي MgCl 2، 3 ملم نان 3، ودرجة الحموضة = 7.5).
    ملاحظة: يمكن تخزين بيليه الكتلة الحيوية التي تم الحصول عليها في -18 & #176؛ C حتى مزيد من الاستخدام لعزل.

2. S-طبقة عزل البروتين وتنقية

ملاحظة: تنقية البوليمرات Slp1 وفقا لطريقة تكييفها كما هو موضح سابقا 2،19،30،32،50،51.

  1. تجانس الكتلة الحيوية الخام غسلها وديفروستيد تم الحصول عليها من زراعة في المخزن القياسي (1: 1 (ث / ت)) لإزالة الآفة باستخدام المفرق (المستوى 3، 10 دقيقة) تحت حمام الثلج التبريد عند 4 درجات مئوية.
  2. الطرد المركزي تعليق (8000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة)، ويغسل بيليه الحصول عليها مرتين مع العازلة القياسي (1: 1 (ث / ت)). بعد غسل والطرد المركزي (8000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة)، resuspend الكرية في المخزن القياسي (1: 1 (ث / ت))، إضافة الدناز الثاني وريبونوكلياز (0.4 وحدة / ز الكتلة الحيوية) إلى تعليق وتتفكك الخلايا في 1000 شريط مع الخالط الضغط العالي. بعد ذلك الطرد المركزي تعليق في 27500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: تعليق خلية مراقبة مع ميل البحوثcroscope. اكتمال تمزق عندما يكون أقل من 2-3 خلايا سليمة واضحة في هذا المجال نظرا لالمجهر في التكبير 400 أضعاف.
  3. يغسل بيليه مرتين مع العازلة القياسي (1: 1 (ث / ت)) وإجراء الطرد المركزي مرة أخرى. بعد ذلك resuspend الكرية في المخزن القياسي (2: 1 (ث / ت)) مختلطة مع 1٪ تريتون X-100 واحتضان لمدة 20 دقيقة تحت المتتالية تهز (100 دورة في الدقيقة) لإذابة الدهون الودائع.
  4. الطرد المركزي الحل (27500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة)، ويغسل الحصول بيليه ثلاث مرات مع العازلة القياسي (1: 1 (ث / ت)).
  5. احتضان بيليه الحصول عليها بعد الطرد المركزي الإضافية (27500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة) لمدة 6 ساعة في المخزن القياسي (1: 1 (ث / ت)) مختلطة مع 0.2 جم / L الليزوزيم، ليتحلل الروابط في ببتيدوغليكان 50. بالإضافة إلى ذلك إضافة الدناز الثاني وريبونوكلياز (كل 0.4 وحدة / ز الكتلة الحيوية) إلى تعليق.
  6. بعد الطرد المركزي (45500 x ج، 4 ° C، 1 ساعة)، resuspend والمرحلة بروتين البيض العليا مع انخفاض حجم رانه الطرد المركزي طاف (<30 مل) التي تحتوي على وحدات بروتين.
  7. إذابة تعليق البيضاء عن طريق خلط 1: 1 مع 6 M غوانيدين هيدروكلوريد (6 M GuHCl، 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة = 7.2). الحل يصبح مشرق.
  8. أداء الترشيح العقيمة (0.2 ميكرون) من حل معاملة GuHCl تليها إضافي الطرد المركزي عالية السرعة (45500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة).
  9. طاف لنقل أنابيب غشاء غسيل الكلى (MWCO 50،000 دالتون) ومدال ضد عازلة التبلور (1.5 ملي تريس، 10 ملي CaCl 2، ودرجة الحموضة = 8.0) لمدة 48 ساعة.
  10. نقل بيضاء اعادة بلورة حل البروتين البوليمر في الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 45500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. resuspend الكرية في انخفاض حجم عالى النقاء المياه (<30 مل).
  11. بعد ذلك، نقل تعليق في أنابيب غشاء غسيل الكلى وإجراء غسيل الكلى ضد الماء عالى النقاء لمدة 24 ساعة لإزالة محتوى العازلة.
    ملاحظة: عدة تغييرات عازلة أو الماء عالى النقاء دخلال شهر غسيل الكلى لا غنى عنها.
  12. يجفد وSlp1 تنقيته في مجفف التجميد.

3. توصيف والكمي لSlp1 للتجارب

ملاحظة: تم كميا تركيز Slp1 لالامتصاص وطلاء التجارب التي كتبها UV-VIS الطيفي.

  1. ماصة 2 ميكرولتر من عينة Slp1 المنحل مباشرة على أقل رمى قياس مضواء. تحديد تركيز البروتين في امتصاص أقصى عند طول موجي 280 نانومتر ل، سمة للبروتينات. استخدام معامل انقراض 0.61 لتحديد تركيز Slp1. استخدام Slp1 حل مجانية لقياس مرجعية.
  2. تمييع البروتين مع العازلة (للتجارب الامتصاص في دفعة واسطة استخدام كلوريد الصوديوم 0.9٪، ودرجة الحموضة = 6.0 وللتجارب QCM-D تستخدم عازلة التبلور، ودرجة الحموضة = 8.0) إلى التركيز المطلوب لإجراء التجارب (1 جم / لتر و 0.2 غرام / L على التوالي).
  3. تحليل Slp1 الجودة والوزن الجزيئي من قبل bioanal القياسيةytical طريقة الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE) التي وصفها Laemmli، UK 52.
    1. أداء SDS-PAGE قبل استخدام Slp1 ضمن التجارب وعلى سبيل المثال، بعد الاتحاد الافريقي (0) -NP حضانة باستخدام 10٪ والمواد الهلامية الفصل بولي أكريلاميد.
    2. مقابل عينات SDS مزيج ≈10 ميكرولتر من زراعة أو البروتين العينة مع عينة العازلة (1.97 ز تريس، 5 ملغ برموفينول الأزرق، 5.8 مل الجلسرين، 1 غرام SDS، 2.5 مل β المركابتويثانول، وملء مع الماء عالى النقاء إلى 50 مل) في نسبة 1: 1 (ت / ت) وماصة الخليط بعد 4 دقائق الحضانة عند 95 درجة مئوية في جيوب هلام.
    3. تشغيل SDS-PAGE 30 دقيقة عند جهد 60 V حتى العينات تمرير هلام جمع وتغيير الجهد إلى 120 فولت مرة واحدة اجتياز جل الانفصال.
    4. إزالة المواد الهلامية من نظام هلام، وشطف مع الماء عالى النقاء ومكان لمدة 1 ساعة إلى حل التثبيت (حمض الحمضية 10٪ والايثانول المطلق 50٪). بعد ذلك، وشطف المواد الهلامية مع الماء عالى النقاء.
    5. المواد الهلامية وصمة عارباستخدام الغروية غير محددة تكييفها Coomassie الرائعة طريقة الأزرق 53،54. بعد destaining 72،73، التقاط صور SDS-PAGE من قبل نظام توثيق جل وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

4. التجارب الامتصاص في دفعة واسطة والكمي المعادن

  1. لدفعة التجارب الامتصاص الاستعداد الاتحاد الافريقي (III) حل سهم من HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O، ويخفف من الملح والمعادن ومزجها مع الحل Slp1 / كلوريد الصوديوم إلى تركيز المعادن الأولي من 1 ملم والتركيز Slp1 النهائي من 1 غرام / L . إجراء تجارب في ثلاثة توائم مع سيطرة سلبية إضافية دون Slp1. استخدام إجمالي حجم 5 مل للتجارب الامتصاص.
  2. يهز تعليق مستمر في RT على قيم مختلفة درجة الحموضة تعديلها قبل بين 2،0-5،0 لمدة 24 ساعة (ضبط درجة الحموضة مع انخفاض حمض الهيدروكلوريك المركز ومحلول هيدروكسيد الصوديوم).
  3. بعد الامتصاص، الطرد المركزي العينات في 15000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) لseparأكل Slp1 من طاف.
  4. نقل طاف في أنابيب الترشيح الفائق (MWCO 50،000 دا) وأجهزة الطرد المركزي هذه في 15000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإزالة أحادية البروتين المذاب.
  5. تحديد تركيز المعادن في الترشيح الناجم عن ICP-MS 19،20 واستخدام النتائج لظهر حساب الممتص منها المعادن من قبل الكتلة الجافة Slp1. مبادئ القياس، وصفت الفرص للأسلوب ومكونات تستخدم ICP-MS في الأدب 55.
    1. إعداد العينات والمراجع لقياس ICP-MS باستخدام 1٪ HNO 3 مثل المصفوفة والروديوم كمعيار داخلي (1 ملغ / مل).

5. توليف الاتحاد الافريقي-NP وتحديد حجم الجسيمات

ملاحظة: سترات استقرت الاتحاد الافريقي (0) تم تصنيعه -NP وفقا لطريقة تكييفها وصفها من قبل Mühlpfordt، H. وآخرون. (1982) للحصول على جسيمات كروية يبلغ قطرها 10-15 نانومتر 56،57 .

  1. إعداد استقرت 25 ملي HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O الأسهم لتشكيل NP.
  2. تمييع 250 ميكرولتر من هذا الحل الأسهم في 19.75 مل عالى النقاء المياه واحتضان هذه في 61 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تحت الهز على التوالي.
  3. إعداد 5 مل من محلول المخزون الثاني (12 ملم حمض التانيك، 7 ملي سيترات الصوديوم ثنائي الهيدرات، 0.05 ملي K 2 3 CO)، واحتضان الحل 2 الثاني بشكل منفصل في 61 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة إطار ثابت تحريك المحلول 2 إلى حل واحد. يحرك خليط التفاعل لمدة 10 دقيقة على الأقل في 61 ° C. تبرد بعد ذلك إلى أسفل الحل واستخدامه لNP الطلاء على Slp1 شعرية ضمن التجارب QCM-D.
    ملاحظة: الناتج الاتحاد الافريقي (0) تميزت -NP مع UV-VIS الطيفي في الامتصاصية كحد أقصى من 520 نانومتر، التي تستخدم عادة للكشف عن تشكيل الاتحاد الافريقي (0) -NPs 58. ويمكن تخزين الحل في 4 درجات مئوية.
  5. تحليل حجم المشكلةالاتحاد الافريقي (0) -NP بواسطة الفوتون ارتباط التحليل الطيفي (PCS) والذي يعرف أيضا باسم تشتت الضوء الحيوي.
    1. لتحديد حجم NP، ونقل 1.5 مل من توليفها الاتحاد الافريقي (0) -NP الحل في cuvettes في ظل ظروف خالية من الغبار في مربع تدفق الصفحي وتحليلها مع حجم وزيتا المحتملة بحجم الجسيمات. ويرد وصف تفصيلي لPCS وإعداد العينات في Schurtenberger، P. وآخرون. (1993) 59 وجاين، R. وآخرون. (2015) 60.

6. التجارب QCM-D - Slp1 طلاء على السطوح والاتحاد الافريقي-NP الامتزاز على Slp1 شعرية

تم إجراء قياسات مع QCM-D مجهزة مع ما يصل إلى أربع وحدات تدفق: مذكرة. أجريت جميع التجارب QCM-D مع معدل تدفق ثابت من 125 ميكرولتر / دقيقة عند 25 درجة مئوية. وقد أجريت Slp1 الطلاء والمعادن / NP الحضانة على شافي 2 كهرضغطية أجهزة الاستشعار AT-قطع الكوارتز (Ø 14 ملم) مع تردد الأساسي لل≈ 5 ميغاهرتز. الشطف الخطوات وإضافةيتم وضع علامة ition من الحل في أرقام النتائج جزء تمثيلي. يمكن وصف التجارب QCM-D باعتباره خطوة بخطوة طريقة التي تبدأ مع تنظيف وتعديل السطح من أجهزة الاستشعار المستخدمة تليها Slp1 التبلور في وقت لاحق على معادن والتفاعل NP.

  1. تنظيف الإجراءات:
    1. تجهيز خلايا السائل مع الدمى الاستشعار. مضخة لا يقل عن 20 مل (كل لكل وحدة) من القلوية وكيل التطهير السائل (2٪ المطهر في الماء عالى النقاء (ت / ت)) من خلال نظام QCM-D وأنبوب. ضخ بعد ذلك حجم خمسة أضعاف (كل لكل وحدة) من الماء عالى النقاء من خلال نظام (معدل تدفق تصل إلى 300 ميكرولتر / دقيقة). أداء التنظيف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. تنظيف أجهزة الاستشعار شافي 2 خارج وحدات التدفق عن طريق الحضانة (20 دقيقة على الأقل) في 2٪ SDS الحل وشطف أجهزة الاستشعار بعد ذلك عدة مرات مع الماء عالى النقاء 61،62.
    3. تجفيف بلورات مع شركات تصفيتهاressed الهواء ووضعها في غرفة التنظيف الأوزون لمدة 20 دقيقة 63،64.
    4. كرر الإجراء التنظيف مرتين لإزالة كافة محتويات العضوية.
    5. لإزالة المعادن المربوطة من سطح جهاز الاستشعار شطف أجهزة الاستشعار مع 1 M HNO 3. بعد ذلك، نفذ كل الخطوات الشطف بالماء عالى النقاء.
  2. استشعار تعديل السطحية التي Polyelectrolytes:
    ملاحظة: يمكن أن يتم تعديل سطح إما داخل (تتدفق من خلال الداخلي) أو خارج وحدة التدفق (تقنية LBL). ضمن هذه التجارب تم استخدام الطريقة التالية لتعديل السطوح.
    1. تعديل أجهزة الاستشعار مع 3 غرام / لتر من طبقات متبادلة من البولي ايثلين PE إمين (PEI، MW 25000) والبوليسترين سلفونات (PSS، MW 70000) عن طريق تراجع الطلاء باستخدام تقنية LBL 40،41 الموصوفة سابقا لنظام خاص المستخدمة في المقالة التي كتبها سور، M. وآخرون. (2014) 19.
    2. وضع أجهزة الاستشعار داخل PE-الحل المناسب في ث عميقلوحات الذراع واحتضان هذه لمدة 10 دقيقة في RT.
    3. خذ أجهزة الاستشعار من PE-حل وشطف أجهزة الاستشعار بين كل طلاء خطوة تراجع بشكل مكثف مع الماء عالى النقاء.
      ملاحظة: يتكون تعديل السطح الجديد لا يقل عن ثلاثة PE طبقة تنتهي مع موجبة الشحنة PEI.
    4. بعد هذا التعديل الخارجي وضع أجهزة الاستشعار داخل وحدة التدفق وتتوازن أجهزة الاستشعار من قبل الشطف بالماء عالى النقاء قبل بدء التجارب.
  3. Slp1 أحادي الطبقة التبلور:
    1. حل Slp1 في 4 M اليوريا لتحويل البوليمرات في مونومرات.
    2. الطرد المركزي البروتينات monomerized في 15000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لإزالة تكتلات أكبر من البروتين.
    3. مزيج طاف Slp1 solubilized وطرد مع العازلة التبلور إلى تركيز البروتين النهائي من 0.2 جم / L.
      ملاحظة: الكالسيوم اعتمادا التبلور من Slp1 (تجميع الذات) يبدأ من خلال إضافة تفصيلrystallization العازلة. لذلك، ضخ حل مختلطة مع معدل تدفق 125 ميكرولتر / دقيقة لأجهزة الاستشعار (وضعت داخل وحدات تدفق) على الفور. ويتم التبلور بعد القيم المستقرة للتحولات التردد وتبديد تم الكشف عنه خلال التجارب QCM-D.
    4. بعد نجاح التبلور البروتين على رأس أجهزة الاستشعار تعديل PE داخل وحدات تدفق شطف أجهزة الاستشعار المغلفة مع العازلة التبلور أو عالى النقاء waterintensively مع معدل تدفق 125 ميكرولتر / دقيقة حتى القيم المستقرة للتحولات التردد وتبديد تم الكشف عنها.
      ملاحظة: يتم تصور تعديل سطح شافي 2 مع PE للتجارب الامتصاص في وقت لاحق على Slp1 أحادي الطبقة وAFM دراسات في الشكل 1.

figure-protocol-1
الشكل 1. تخطيطي تصميم PE تعديل السطحية وSlp1 أحادي الطبقةالطلاء؛ تم تعديل هذا الرقم من سور، M. وآخرون. (2015) 19 بإذن من سبرينغر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. المعادن والمعادن NP التفاعل:
    ملاحظة: الامتصاص مع الاتحاد الافريقي محلول الملح المعدنية (HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O) أجريت في تركيزات 1 ملم أو 5 ملم في الرقم الهيدروجيني = 6.0 في 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحلول. وقد تم أو-NP الامتزاز مع مخفف أو-المصادر في 1.6 ملي العازلة ثلاثي الصوديوم سترات في الرقم الهيدروجيني ≈ 5.0.
    1. بعد نجاح Slp1 الطلاء في وحدات تدفق، وشطف طبقة Slp1 التي تم الحصول عليها بشكل مكثف مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل حتى تم الكشف عن القيم المستقرة للتحولات التردد وتبديد.
    2. ضخ حل استعداد المعادن (1 ملم) وحل NP إلى وحدات تدفق بمعدل تدفق 125 ميكرولتر / دقيقة وتتبع امتصاص الكتلة إلى المدعوهطبقة P1. ويمكن الكشف عن الامتزاز الشامل مباشرة عن طريق تتبع التحولات تردد اشارة الى المعادلة ساوربري (المعادلة 1).
    3. بعد الانتهاء من التفاعل المعادن وNP المعادن، وشطف مع طبقة معدنية / NP عازلة خالية لإزالة ضعيفة أو المعادن النانوية المرفقة المربوطة أو ضعيفة.
      ملاحظة: يتم عرض مثال على الإعداد التجريبي في الشكل 2.

figure-protocol-2
الشكل 2. التصميم التخطيطي من الإعداد QCM-D باستخدام وحدة تدفق قطر للطحين 401 * 66. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تسجيل البيانات والتقييم:
    1. تسجيل التغيرات في التردد في هرتز (Δf ن) وتبديد (ΔD ن) ضمن التجارب QCM-D باستخدام QCM-D برامج معينة.
    2. استخدام لتقييم حساسية جماعية كثف (Δm) وساوربري المعادلة / نموذج (المعادلة 1) 65 66 صالحة للأفلام رقيقة وصلبة إلى جانب دون احتكاك على سطح مستشعر تطبيقها على ال ن يغلب. على المدى C (سوربري ثابت) لاستخدامها 5 ميغاهيرتز AT قطع استشعار الكوارتز هو 17.7 نانوغرام ∙ هرتز -1 ∙ سم -2 68. لجامدة، موزعة بالتساوي، وطبقات رقيقة بما فيه الكفاية كثف استخدام المعادلة 1 كما تقريب جيد.
      figure-protocol-3
    3. أداء نماذج إضافية وفقا للنموذج كلفن فويت صالحة لجزيئات اللزجة 68-71 مع برنامج تصنيع محددة، ومقارنة النتائج مع هذا النموذج سوربري.
    4. لحساب من سمك طبقة واستخدام الامتزاز الشاملكما الهامة المعلمة النمذجة كثافة طبقة طبقة كثف من 1.35 غرام ∙ سم -3 المقابلة لقيم المذكورة سابقا للبروتينات S-طبقة 72-75. استخدام نفس القيمة لحساب تفاعل المعدن مع الطبقة البروتينية.

7. AFM القياسات

  1. إجراء دراسات وقادرة تماما على AFM المجهر الضوئي المقلوب.
    1. تسجيل صور AFM في السائل باستخدام المخزن المؤقت التبلور أو الماء عالى النقاء مباشرة على أجهزة استشعار المغلفة QCM-D.
    2. شطف أجهزة الاستشعار مع الماء عالى النقاء بعد عدة تجارب QCM-D ووضعها داخل الخلية السوائل AFM. ولذلك، استخدم خلية السوائل مغلقة مع الحجم الإجمالي حوالي 1.5 مل. الحفاظ على درجة حرارة ثابت خلية السائل عند 30 درجة مئوية.
    3. استخدام ناتئ مع تردد صدى ≈ 25 كيلو هرتز في الماء وتصلب <0.1 N / م. ضبط سرعة المسح الضوئي بين 2.5 و 10 ميكرون / ثانية.
      4. التقط الصور في وضع الاتصال ديناميكي في حين هو متحمس ناتئ من قبل بيزو في تردد صدى لها. تحديد مسافة ناتئ إلى السطح من التذبذب التخميد 76.
      ملاحظة: يتم عرض الصور الارتفاع مع ض النطاق بينما قيم Z تمثل تضاريس الدقيق للسطح. يتم عرض السعة (الزائفة 3D) الصور دون ض النطاق لقيم Z السعة تعتمد على المعلمات المسح الضوئي وتحمل معلومات محدودة. وقد تم تحليل الصور باستخدام ثلاثة برامج التقييم مختلفة في 77.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

زراعة الكائنات الدقيقة وSlp1 توصيف

البيانات المسجلة للنمو البكتيري يشير إلى نهاية مرحلة النمو الأسي في حوالي 5 ساعة. وقد أظهرت التحقيقات السابقة التي Slp1 يمكن عزله عن هذه النقطة من الحصاد (4.36 جم / L الكتلة الحيوية الرطب ≈ (1.45 جم / L (BDW)) مع أقصى عائد 19. ومع ذلك، والتحسين من زراعة باستخدام مكونات وسائل الاعل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا العمل دراسة الربط من الاتحاد الافريقي للبروتينات S-طبقة تم التحقيق باستخدام مزيج من الأساليب التحليلية المختلفة. على وجه الخصوص، الربط من الاتحاد الافريقي غير جذابة للغاية ليس فقط لاسترداد الاتحاد الافريقي من المياه التعدين أو حلول عملية، ولكن أيضا لبناء المواد، على سبيل المثال، الأسطح الحسية. للدراسات للتفاعل الاتحاد الافريقي (الاتحاد الافريقي (III) والاتحاد الافريقي (0) -NPs) مع وقف التنفيذ وبلورته أحادي الطبقة من Slp1، كان البروتين لتكون معزولة. ولذلك، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل المشروع IGF "S-المنخل" (490 ZBG / 1) بتمويل من BMWi وBMBF المشروع "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). شكر خاص لتوبياس J. غونتر لمساعدته القيمة خلال الدراسات AFM وإريك جونستون V. لقراءة المخطوطة كما يتحدث اللغة الإنجليزية. وعلاوة على ذلك، فإن مؤلف هذه الورقة أود أن أشكر ألين ريتر وسابرينا Gurlit (من معهد البيئة الموارد من أجل المساعدة في القياسات ICP-MS)، مانجا فوغل، نانسي أنجر، كارين E. Viacava والتكنولوجيا الحيوية مجموعة للمعهد هيلمهولتز فرايبرغ للتكنولوجيا الموارد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >equiment وبرمجيات < / قوي >
مفاعل حيوي ، بخار في المكان 70L نظامتجريبي Applikon Biotechnology ، هولنداZ6Xبما في ذلك dO2< / sub> ، مستشعرات الأس الهيدروجيني من Applikon Biotechnology وبرنامج BioXpert V2
جهاز مراقبة الكتلة الحيوية غير الغازية BugEye 2100BugLab ، كونكورد (كاليفورنيا) ، الولايات المتحدة الأمريكيةZ9X---
مطياف Ultrospec 1000Amersham Pharmacia Biotech ، بريطانيا العظمى80-2109-10شركة الآن GE Healthcare Life
Sciences MiniStar micro طردVWR ، ألمانيا521-2844للطرد المركزي لعينات الزراعة
مجهر نظام البحث BX-61Olympus Germany LLC ، ألمانيا037006المجهر بالاشتراك مع برنامج التصوير
Cell ^ P (الإصدار 3.1)أوليمبوس سوفت إيميجينغ سوليوشنز ذ.م.م، Mü نستر ، ألمانيا---جنبا إلى جنب مع المجهر
Powerfuge نظام الفصل التجريبي Serie 9010-SCarr Centritech ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية9010PLTلحصاد الكتلة الحيوية
T18 الأساسية Ultra TurraxIKA Labortechnik ، ألمانيا431-2601لإزالة السوط وتجانس
العينات Sorvall Evolution RC Superspeed جهاز طردمركزي Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية728411تستخدم في عزل البروتين
معالج سائل القص العالي المتنقل ، M-110EH-30 PilotMicrofluidics ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةM110EH30Kيستخدم لتمزق الخلية
مجفف التجميد Alpha 1-4 LSCمجففات Martin Christ Freeze LLC ، Osterode ، ألمانيا102041---
UV-VIS القياس الطيفي (NanoDrop 2000c)Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية91-ND-2000C-Lلتقدير البروتين تركيز
غرفة الرحلان الكهربائي العمودي Mini-PROTEANBio-Rad Laboratories GmbH ، ميونيخ ، ألمانيا165-3322لنظام التصوير SDS-PAGE
VersaDoc 3000Bio-Rad Laboratories GmbH ، ميونيخ ، ألمانيا1708030تستخدم لتصوير المواد الهلامية SDS-PAGE
ICP-MS Elan 9000PerkinElmer ، Waltham (MA) ، الولايات المتحدة الأمريكيةN8120536لتقدير تركيز
المعدنZetasizer Nano ZSMalvern Instruments, Worcestershire المملكة المتحدةZEN3600لتحديد حجم الجسيمات النانوية
جهاز Q-Sense E4  Q-Sense AB ، جوتنبرج ، السويدQS-E4تم طلبها عبر LOT تصميم الكم (البرنامج المتضمن مع منصة E4)
Q-Soft 401 (تسجيل البيانات)Q-Sense AB ، جوتنبرج ، السويد
Q-Tools 3 (تقييم البيانات والنمذجة)Q-Sense AB ، جوتنبرج ، السويد
التدفق QCM-D QFM & nbsp ؛ 401 Q-Sense AB ، جوتنبرج ، السويدQS-QFM401تم طلبها عبر LOT quantum design
QSX & nbsp ؛ 303 SiO2< / sub> مستشعرات الكوارتز الكهروإجهاديةAT-Cut Q-Sense AB ، جوتنبرج ، السويدQS-QSX303تم طلبها عبر LOT تصميم الكم
غرفة تنظيف الأوزونBioforce Nanoscience ، أميس (IA) ، الولايات المتحدة الأمريكيةQS-ESA006تم طلبها عبر LOT تصميم الكم
مجهر القوة الذرية MFP-3D Bio AFMAsylum Research ، سانتا باربرا (كاليفورنيا) ، الولايات المتحدة الأمريكيةMFP-3DBioAFM قياسات وبرامج التصوير
أبحاث اللجوء AFM AR الإصدار 120804 + 1223Asylum Research ، سانتا باربرا (كاليفورنيا) ، الولايات المتحدة--- برنامج التصوير المضمن في Cat. لا. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 برنامجWaveMetrics, Inc., الولايات المتحدة الأمريكية---برنامج التصوير المضمن في Cat. لا. MFP-3DBio
BioHeaterAsylum Research ، سانتا باربرا (كاليفورنيا) ، الولايات المتحدة الأمريكيةسخان بيولوجي عينة لقياسات AFM
Biolever mini cantilever ،   ؛ BL-AC40TS-C2أوليمبوس ألمانيا ذ.م.م, ألمانيا  BL-AC40TS-C2ناتئ مفضل لقياسات AFM
WSxM 5.0 تطوير 6.5 (2013)Nanotec Electronica SL ، برنامج مجاني إسبانيالتحليل AFM
NameCompanyCatalog NumberComments
Detergents وغيرها من الأسهمية
حمض حمضي ، 100٪ ، سنوياكارل روث GmbH + CO. KG3738.5سائل وبخار وقابل للاشتعال والتآكل. يسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين.
مضاد للرغوة 204شركة سيجما ألدريتش ذ.م.م.A6426لقمع الرغوة
بروموفينول الأزرق ، ملح الصوديومSigma-Aldrich Co. LLC.B5525
---Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)CARL ROTH GmbH+CO. KG3862.1---
Deoxyribonuclease II من طحال الخنازيرSigma-Aldrich Co., LLC.D4138النمط الرابع ، 2,000 - 6,000  وحدات كونيتز / مجم بروتين
الإيثانول ، 95٪VWR ، ألمانيا20827.467قابل للاشتعال
، p.A.كارل روث GmbH + CO. KG3783.1---
هيدروكلوريد جوانيدين (GuHCl) CARLROTH GmbH + CO. KG0037.1---
Hellmanex IIIHellma GmbH & Co. KG9-307-011-4-507---
حمض الهيدروكلوريك (HCl) (37٪) CARLROTH GmbH + CO. KG4625.2خطر; تآكل ، يستخدم لتعديل الأس الهيدروجيني
Lysozyme من بياض بيض الدجاجSigma-Aldrich Co. LLC.L6876 مسحوق مجفف بالتجميد ، بروتين = 90٪ ، = 40،000 وحدة / مجم بروتين (سيجما)   ؛
محرك مغناطيسي مع تدفئة ،   ؛ MR 3000KHeidolph Instruments GmbH & amp Co.KG ، ألمانيا504.10100.00محرك قياسي ضمن التجربة
NB-Media DM180Mast Diagnostica GmbH121800---
حمض النيتريك (HNO3< / sub>) CARLROTH GmbH + CO. KGHN50.1خطر. الأكسدة ،
تآكل الصفحةمسطرة سلم البروتين غير الملوثةThermoScientific-Pierce26614---
بولي (الصوديوم 4-ستايرينسولفونات) (PSS) شركةسيجما ألدريتش ذ م م.243051متوسط ميغاواط ~ 70،000
بولي إيثيلينيمين (PEI) ، شركةSigma-Aldrich Co. LLC المتفرعة.تحذير 408727 ضار ومهيج وخطير على البيئة. متوسط ميغاواط ~ 25,000
كربونات البوتاسيوم اللامائية (K2< / sub>CO3< / sub>) شركةSigma-Aldrich LLC.60108تحذير ؛
ريبونوكلياز أ الضار من البنكرياس البقري شركة سيجما ألدريتش ذ.م.م.R5503نوع I-AS, 50 - 100 وحدة Kunitz / ملغ بروتين 
أزيد الصوديوم (NaN3< / sub>) MerckKGaA106688خطر ؛ سام جدا وخطير على البيئة
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)CARL ROTH GmbH + CO. KG3957.2---
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) شركةسيجما ألدريتش ذ.م.م.L-5750خطر؛
هيدروكسيد الصوديوم السام (NaOH)CARL ROTH GmbH + CO. KG6771.1خطر; تآكل ، يستخدم لتنظيم الأس الهيدروجيني داخل الزراعة وتعديل الأس الهيدروجيني
Spectra / Por 6 ، غشاء غسيل الكلى ، MWCO 50،000   ؛كارل روث GmbH + CO. KG1893.1---
حامض الكبريتيك (H2SO4)CARL ROTH GmbH + CO. KGHN52.2خطر. تآكل ، يستخدم لتنظيم الأس الهيدروجيني داخل زراعة
حمض التانيك (C76< / sub>H52< / sub>O46< / sub>)Sigma-Aldrich Co. LLC.16201---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)CARL ROTH GmbH+CO. كيلو9090.2---
تريتون X-100كارل روث جي إم بي إتش + كو. تحذير KG3051.3؛ ضارة وخطيرة على البيئة
VIVASPIN 500 ، 50،000 MWCO أنابيب الترشيح الفائقSartorius AGVS0132---
& beta ؛ -mercaptoethanolSigma-Aldrich Co. LLC.M6250خطر, سامة
مركزي وحدات برنامج الأمريكية خطر ، جلسرين

المراجع

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705(2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بروتينات الطبقة السطحيةامتزاز الذهبتحليل QCM-Dالكشف بواسطة ICP-MSتصوير AFMطبقة أحادية من Slp1ارتباط المعادنإعادة بلورة البروتينامتزاز الجسيمات النانوية
أو-تفاعل Slp1 البوليمرات واحد رقائق من
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.