ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا المحاكاة البيولوجية: رواية Biorubber يخلق معرف الصغرى، وعلى نطاق والماكرو-البنى في الكولاجين الهلاميات المائية

ملخص

تم تطوير تقنية تصنيع حيوي مبتكرة لهندسة التركيبات ثلاثية الأبعاد التي تشبه السمات المعمارية والمكونات والخصائص الميكانيكية للأنسجة في الجسم الحي. تتميز هذه التقنية بمادة قرابين مطورة حديثا ، مطاط BSA ، والتي تنقل السمات المكانية التفصيلية ، وتعيد إنتاج البنى في الجسم الحي لمجموعة متنوعة من الأنسجة.

الملخص

السقالات الأنسجة تلعب دورا حاسما في عملية تجديد الأنسجة. السقالة المثالية يجب أن تتوفر عدة شروط مثل وجود التركيبة الصحيحة، معامل المستهدفة، والسمات المعمارية واضحة المعالم. المواد الحيوية التي تلخص العمارة الجوهرية في الجسم الحي الأنسجة حيوية لدراسة الأمراض وكذلك لتسهيل تجديد الأنسجة الرخوة المفقودة والتالفة. وقد تم تطوير تقنية جديدة biofabrication الذي يجمع بين دولة من فن التصوير، ثلاثية الأبعاد الطباعة (3D)، والنشاط الأنزيمي انتقائية لخلق جيل جديد من المواد الحيوية للبحث والتطبيق السريري. المواد المتقدمة، الأبقار مصل الزلال المطاط، هي رد فعل حقن القالب الذي يدعم ميزات هندسية محددة. هذه المواد الأضاحي تتيح نقل كافية من المعالم المعمارية لمادة سقالة الطبيعية. يتكون النموذج من سقالة الكولاجين 3D مع 4 و 3 قنوات مم أن reprESENT بنية متفرعة. وتؤكد هذه الورقة استخدام هذه التقنية biofabrication لتوليد بنيات الطبيعية. هذا البروتوكول يستخدم برنامج بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لتصنيع القالب الصلب الذي سيكون رد فعل حقن المطاط BSA تليها عملية الهضم الأنزيمي من المطاط، وترك المعالم المعمارية في غضون المواد سقالة.

المقدمة

في مجال هندسة الأنسجة القدرة على تصنيع السقالات الأنسجة الحيوية. سقالة الأنسجة المناسبة لديها بنية 3D، وتتكون من المواد حيويا، ويقلد في الهندسة المعمارية أنسجة الجسم الحي لتسهيل نمو الخلايا والأنسجة والتجديد. هذا سقالة يجب أن يسمح بنقل المواد الغذائية وإزالة النفايات ^1-4. واحدة من العقبات الرئيسية في إنتاج هذه الاطر هو القدرة على تلخيص ملامح هندسية معينة إلى مادة حيويا. وقد تم الإبلاغ عن العديد من التقنيات biofabrication للسيطرة على الميزات الهندسية من هذه الاطر، والأمثلة والعزل الكهربائي ^5-8، المذيبات الصب ^9، المجسمة ^10، و3D-طباعة ^11، من بين أمور أخرى. هذه التقنيات تقصر في توفير نقل من السهل نسبيا من المعالم المعمارية الداخلية والخارجية يمكن السيطرة عليها، ومكلفة، وتقتصر بموجب قرار والقابليه ( > على سبيل المثال، وقياس فوهة، وتقييد المواد)، أو تتطلب تقنيات ما بعد التصنيع الذي يتطلب فترة طويلة من الوقت لإنتاج السقالات قابلة للحياة ^12.

في كثير من النظم تلفيق التجارية، وخلق الفراغات الداخلية، والقنوات، والميزات وتحقيقه باستخدام الرمل أو غيرها من المواد القابلة للإزالة أو الأضاحي مناسبة. ويتكون الجزء المعدني أو البلاستيك حول القالب الرمال، وبمجرد عزز ذلك، تتم إزالة الرمال. وبنفس الطريقة، الجيل القادم من المواد الحيوية يحتاج ما يعادل biosand. لذلك، تم تطوير المطاط BSA كبديل للbiosand. المطاط BSA هو مادة صيغت حديثا والتي تتكون من ألبومين المصل البقري crosslinked مع غلوتارالدهيد. والهدف النهائي هو إعادة المعالم المعمارية محددة في سقالة الكولاجين القابلة للتحلل. ووصف خصائص biorubber الذبيحه التي تحافظ على الإخلاص الأبعاد مع قالب من الأنسجة الأصلية.

تم اختبار الحمار = "jove_content"> عدة مجموعات من تركيزات BSA وغلوتارالدهيد باستخدام مجموعة متنوعة من المذيبات. تم إنشاء هذه المواد عن طريق تفاعل بين جيش صرب البوسنة وغلوتارالدهيد. BSA المطاط يمكن أن يكون رد فعل حقنها في هندستها معقدة من القوالب الأنسجة. Crosslinked BSA والتربسين عطوب وهضمها بسهولة بواسطة انزيم في الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة ظروف معتدلة. على العكس من ذلك، نوع سليمة أنا الكولاجين هو مقاومة جدا للهضم التربسين. تم رسملة هذه الميزات لإزالة انتقائي المطاط BSA ترك الكولاجين وراء. يتألف هذا العمل من تحديد المعايير المثالية اللازمة للحصول على قالب قابل للتغيير التي يمكن أن توفر ميزات معمارية محددة لسقالة حيويا. وتشمل السمات المحددة التي تم تقييمها mixability، انزيم الهضم، الحاملة، والقدرة على أن يكون رد فعل حقن في قالب سلبي. مزيج من 30٪ BSA و 3٪ غلوتارالدهيد يفي بهذه المتطلبات. يوفر هذا البروتوكول necessالمبادئ التوجيهية آرى لإنشاء هذه السقالات ثلاثية الأبعاد. يتكون النموذج من سقالة الكولاجين التي تمثل بنية متفرعة مع تدفق واحد وقناة تدفق مع اثنين من أقطار 4- و 3 ملم، على التوالي. هذه التقنية لديها القدرة على تقليد الكلي والجزئي بيئات الأنسجة من الاهتمام. توفر هذه التكنولوجيا تقنية قابلة للتطبيق لتقديم المفيد هندسي محدد لمادة قابلة للتحلل في مسألة سهلة والوقت المناسب نسبيا مع الدقة العالية، والتي يمكن ضبطها لمحاكاة في الجسم الحي مرونة الأنسجة وغيرها من الأنسجة من الاهتمام الخصائص.

البروتوكول

1. تحديد نسبة المواد الصلبة في الدفعة الكولاجين

1. استخراج الكولاجين بعد إجراء نشرت سابقا ^13. ذوبان الجليد ما لا يقل عن 20 مل من الكولاجين. تحديد نسبة الأولية من المواد الصلبة الكولاجين في دفعة من أجل التلاعب تركيز الكولاجين في الهلاميات المائية تشكيلها.
   1. قطع ثلاث قطع من رقائق الألومنيوم (حوالي 6 × 6 سم) وشكل كل واحد كما مقلاة باستخدام الجزء السفلي من دورق 25 مل. تسجيل وزن كل المقلاة.
   2. إضافة كمية صغيرة من الكولاجين لكل عموم وتسجيل الوزن الكلي للعموم الألومنيوم والكولاجين. إضافة 0،5-0،8 غرام من الكولاجين في كل عموم الألومنيوم.
      ملاحظة: بعد هذه الخطوة، وهناك ثلاثة المقالي رقائق الألومنيوم ويجب أن يكون كل واحد على كمية صغيرة من الكولاجين. تأكد من تسجيل وزن كل (المجموع 3) فارغة عموم الألومنيوم والوزن من المقلاة بعد إضافة الكولاجين.
   3. حساب الوزن من الكولاجين في كل عموم باستخدام وollowing الصيغة:
      الوزن الكولاجين = عموم والوزن الكولاجين - الوزن عموم
   4. وضع المقالي من الالومنيوم الثلاثة التي عقد الكولاجين في الفرن على 100 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   5. بعد 24 ساعة، تسجيل وزن كل عموم الألومنيوم والكولاجين المجففة.
   6. حساب وزن الكولاجين المجففة باستخدام المعادلة التالية:
      المجففة الوزن الكولاجين = عموم والمجففة الوزن الكولاجين - الوزن عموم
   7. حساب النسبة المئوية الصلبة لثلاث عينات لتحديد تركيز الكولاجين الصلبة باستخدام المعادلة التالية:
      
   8. حساب متوسط ​​المحتوى الصلب الكولاجين الدفعة باستخدام نسبة من المواد الصلبة الكولاجين لكل من العينات الثلاث.
      ملاحظة: الكولاجين التي سيتم استخدامها هو ما تبقى من الكولاجين رطب. وسوف تستخدم أيا من الكولاجين المجففة.
   9. بعد تحديد نسبة الكولاجين الصلبة (طتركيز الكولاجين nitial) الدفعة، الاستمرار في استخدام الكولاجين المائية المتبقية. استخدام متر الرقم الهيدروجيني معايرة لضبط درجة الحموضة من الدفعة الكولاجين ل3.
      1. إضافة كميات صغيرة (2-5 ميكرولتر في وقت واحد) من 12 N حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك). الحفاظ على الجليد في جميع الأوقات. لا تقم بإضافة حمض الهيدروكلوريك مباشرة إلى الكولاجين - إضافة الحامض إلى جانب الأنبوب. بعد إضافة حامض، واستخدام ملعقة لدفع حمض لالكولاجين وسرعان ما يقلب الخليط.
   10. عندما يصل الرقم الهيدروجيني من 3، والسماح للالكولاجين الجلوس O / N عند 4 درجات مئوية.

2. إعداد جيش صرب البوسنة المطاط

1. إعداد الحل الأبقار مصل الزلال (BSA) بعد الإجراء المذكورة أدناه.
   1. يعد حل 2X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إضافة إلى اثنين من أقراص برنامج تلفزيوني إلى 100 مل من الماء لجعل 0.02 حل M برنامج تلفزيوني.
   2. الجمع بين BSA مع 2X في برنامج تلفزيوني لإيجاد حل جيش صرب البوسنة 30٪ باستخدام الإجراء المذكورة أدناه.
      1. على سبيل المثال، لجعل BSA 30٪ مع 30 مل من 2X في برنامج تلفزيوني، استخدم 12.9 غرام من جيش صرب البوسنة. إضافة 1/3 من 2X في برنامج تلفزيوني (على سبيل المثال، 10 مل) إلى قارورة مع بقضيب. إضافة 1/2 من جيش صرب البوسنة (على سبيل المثال، 6.45 ز BSA) إلى القارورة وباستخدام ملعقة، والرطب المذاب الجاف.
      2. كرر هذه العملية لإضافة برنامج تلفزيوني ثم BSA حتى كل المذاب والمذيب في القارورة. استخدام ملعقة لالرطب جميع المذاب. وسوف تبدو وكأنها خليط من بعض السائل وكتل. اتركه لمدة حوالي 30 دقيقة.
      3. ثم، وتحويل النمام على دورة منخفضة والتأكد من عدم وجود كتل حول بقضيب. ينبغي أن تأخذ 90 دقيقة للحصول على كل شيء في حل أو أنها يمكن أن تترك اثارة O / N عند 4 درجات مئوية. بعد المذاب يذوب كل شيء، وضع الحل في حقنة 20 مل وتوج مع فلتر حقنة 0.20 ميكرون. اضغط على المكبس لطرد السوائل من خلال تصفية وجمع الحل تعقيمها في أنبوب جديد. تخزينها في 4 درجات مئوية.
   3. إعداد 3٪ soluti غلوتارالدهيدعلى طريق تمييع 25٪ محلول غلوتارالدهيد مع العقيمة التي تمت تصفيتها 2X في برنامج تلفزيوني. على سبيل المثال، لمدة 10 مل من 3٪ من محلول غلوتارالدهيد، استخدام 2 مل من 25٪ غلوتارالدهيد و 8 مل من 2X في برنامج تلفزيوني. تخزينها في 4 درجات مئوية.

3. قوالب العلاج

ملاحظة: النموذج هو موضح في هذه الورقة يستخدم العرف الفولاذ المقاوم للصدأ Y قالب قطعة. يحتوي القالب تدفق وتدفق قناتين من 4 و 3 ملم، على التوالي. أولا، قوالب نظيفة، رذاذ لهم مع شحم الخنزير غير المشبعة، وتعقيم لهم. إعداد قوالب باتباع الإجراء هو موضح أدناه.

1. قوالب الصلب غير القابل للصدأ نظيفة باستخدام sonicator على تردد 35 كيلوهرتز. ضع القوالب في sonicator وغمر لهم الماء والجليد. الحفاظ على قوالب البرد في جميع الأوقات بينما sonicator قيد التشغيل. تشغيل sonicator ل2 فترات من 90 دقيقة.
   1. بعد كل فترة، واستخدام إبرة للتأكد من أنه لا يوجد مادة في بالتركيبة قفل الفولاذ المقاوم للصدأ أو بموصل الرس. استخدام الماء والصابون لتنظيف السطح بأكمله من الجانبين من القوالب. تحقق من وجود أي انسداد في القنوات.
2. وضع قوالب، ومسامير، ولور موصل قفل في كيس الأوتوكلاف والأوتوكلاف ذلك.
3. ملء زجاجة التي يعلقها على نصف الطريق بخاخ الهواء مع شحم الخنزير المتاحة تجاريا (الأحماض الدهنية المختلطة وكيل الافراج). استبدال الغطاء مع غطاء زجاجة العادية. وضعه في كيس الأوتوكلاف والأوتوكلاف ذلك.
   ملاحظة: يتم استخدام شحم الخنزير لتسهيل الإفراج عن المواد التي سوف يكون رد فعل حقن في وقت لاحق (BSA المطاط). لا تضع غطاء زجاجة بخاخ في autoclave- أنها يمكن أن تلحق الضرر الختم الداخلي.
4. الاحماء شحم الخنزير لمدة 45 ثانية أو حتى في واضحة والسائل في الميكروويف. المسمار غطاء بخاخ الهواء إلى زجاجة شحم الخنزير. ربط الغطاء مع البخاخ. إرفاق بخاخ للمصدر الهواء في مقاعد البدلاء المختبر. فتح صمام الهواء، وفتح فوهة البخاخ حتى يبدأ ترطيب سطحمن منشفة ورقية.
5. رش شحم الخنزير عمودي على سطح القالب حتى يتم تغطية السطح بالكامل. بعد أن تم رش كل قطعة، ووضعها في طبق بتري وختم عليها. ضع القوالب في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
6. انتقل إلى تعقيم قوالب من خلال تعريض السطح لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. وضعها مرة أخرى في 4 درجات مئوية حتى انهم على استعداد ليكون رد فعل حقن.

4. حقن رد فعل جيش صرب البوسنة المطاط

ملاحظة: جميع المواد والحل يجب أن تبقى باردة حتى جاهزة للاستخدام لمنع وضع سابق لأوانه من المطاط BSA في الخطوات التالية.

1. إعداد موزع لتقديم المطاط BSA إلى قوالب باتباع الخطوات التالية.
   1. تعقيم كافة المكونات خلط (اثنين من الحلقات، وكأب حقنة، حقنة مزدوجة، مزيج طرف، و 4: 1 موزع) بتعريضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة في غطاء محرك السيارة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).
      ملاحظة: تم استخدام غطاء محرك السيارة PCR لرويشمل الإجراء له مثبتات. هذه المواد الكيميائية لا يمكن أن تستخدم في الخلية هود الثقافة / الأنسجة بسبب خطر التعرض والسمية على خلايا الجسم. فإن أي غطاء محرك السيارة الأخرى التي تحتوي على الأشعة فوق البنفسجية تكون مناسبة.
   2. وضع غطاء رأس على حامل حل.
   3. أداء الخلط والحقن في نسبة 4: 1 من BSA: غلوتارالدهيد. إضافة BSA 30٪ إلى غرفة مزدوجة حقنة من شأنها تقديم أكبر قدر من الحل (وسوف يستغرق حوالي 4 مل لشغل). تأكد من ترك مساحة كافية لوضع خاتم O من أجل منع التلوث تفيض ومن الغرفة المجاورة.
   4. إضافة 3٪ محلول غلوتارالدهيد إلى غرفة أخرى (سوف يستغرق حوالي 1 مل لشغل). تأكد من ترك مساحة كافية لوضع عصابة يا لمنع التلوث تفيض ومن الغرفة المجاورة.
   5. وضع حقنة مزدوجة على موزع. إمالة التجمع عموديا بحيث غطاء حقنة على رأس. استبدال الغطاء مع غيض الاختلاط.
   6. الشوري REW اثنين من الفولاذ المقاوم للصدأ قطع القالب الصلب معا.
   7. وضع التجمع داخل حقيبة الأوتوكلاف.
   8. لإزالة أي هواء في موزع، لأنه عقد في وضع مستقيم وبسرعة الضغط على المقبض مرة واحدة لإطلاق كمية صغيرة من جيش صرب البوسنة مختلطة مع غلوتارالدهيد. ثم سرعان ما نعلق موصل قفل لور من الفولاذ المقاوم للصدأ Y العفن على طرف الحقنة.
   9. عقد غير القابل للصدأ الصلب العفن Y مع اليد اليسرى وموزع خليط BSA-غلوتارالدهيد على اليمين. البديل تغطي كل من العادم الأيسر والأيمن من قنوات التدفق عن طريق الضغط على العادم على الجانبين من الحقيبة الأوتوكلاف للتأكد من ملء الفراغات الداخلية مع الحل. ثم، ضع القوالب أفقيا وحقن مرة أخرى.
   10. فصل قوالب من موزع ومكان في 25 مم طبق بيتري.
   11. وضع بارافيلم حول طبق بيتري لمنع الجفاف من المطاط.
   12. مكان القالب في الثلاجة 4 درجات مئوية O / N.

= "jove_title"> 5. ضبط تركيز الكولاجين

ملاحظة: يجب أن تظل الكولاجين على الجليد في جميع الأوقات خلال هذه العملية.

1. تعديل تركيز الكولاجين باستخدام نسبة من المواد الصلبة الكولاجين.
   1. جعل 10 مل من 1.75٪ الكولاجين عن طريق ضبط تركيز الكولاجين الأولي بالماء البارد.
   2. باستخدام مقياس درجة الحموضة معايرة، وضبط درجة الحموضة إلى 3 باستخدام 12 N حمض الهيدروكلوريك. لا تقم بإضافة حمض الهيدروكلوريك مباشرة إلى collagen- إضافة حمض إلى جانب الأنبوب. بعد إضافة حامض، واستخدام ملعقة لدفع الحمض في الكولاجين وسرعان ما يقلب الخليط.
   3. يزن 4 غراما من الكولاجين في أنبوب مخروطي منفصل.
   4. أجهزة الطرد المركزي الكولاجين لإزالة الهواء في 4 درجة مئوية و 9343 x ج لمدة 20-30 دقيقة.
   5. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الخلية هود الثقافة لمدة 30 دقيقة، وإضافة 14 ميكرولتر من laminin إلى الكولاجين 4 مل. وهذا يؤدي إلى تركيز laminin النهائي من 10 ميكروغرام / ميكرولتر. ملاحظة: Laminin يقدم الصورةسلامة tructural، التصاق، وتشجع مختلف الاستجابات الخلوية.
   6. تحويل PCR ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20-30 دقيقة قبل استخدام غطاء للتعقيم.
   7. وضع غطاء قفل لور، لنعلق على حقنة 20 مل، في الإيثانول لساعة 2. ثم، اتركه حتى يجف ووضعه في ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
   8. غاما أشرق الكولاجين 8.6 دقيقة للوصول إلى 1200 CGY.
      ملاحظة: التوقيت سيعتمد على اضمحلال مصدر السيزيوم. ضبط الوقت للوصول إلى نفس الجرعة.

6.Casting الكولاجين في جيش صرب البوسنة المطاط

1. لبلمرة الكولاجين، استخدم 8: نسبة 1: 1 (الكولاجين: HEPES: MEM). ويستند هذا الإجراء التالي على 4 ز الأولي من الكولاجين المحمضة (من الخطوة 5.1.8).
   1. جعل حل 0.2 N HEPES في الماء، وضبط درجة الحموضة إلى 9 وذلك بإضافة كميات صغيرة (1-5 ميكرولتر) من 1-5 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حل. باستخدام مقياس درجة الحموضة معايرة، ومراقبة درجة الحموضة من الحل بعد كل إضافة. تخزينها في 4 درجة مئوية أو كهالجيش الشعبي على الجليد.
   2. بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية من غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة لمدة 20-30 دقيقة لتعقيم غطاء محرك السيارة.
   3. ملقط الأوتوكلاف، ملعقة، ومشرط للتعقيم.
   4. خلط 1.5 مل من 0.2 N HEPES (الرقم الهيدروجيني 9) و 1.5 مل من 10X MEM باستخدام غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة. تأكد من أن يبقيه على الجليد ودوامة لمدة 5 ثوان قبل استخدامها. تخزين عند 4 درجات مئوية أو الحفاظ على الجليد.
   5. لتعقيم هود PCR، بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
   6. وضع لوحة جيدا 12 وحقنة 20 مل في -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، أو حتى على استعداد للمتابعة. ملاحظة: حافظ على جميع المواد البرد حتى جاهزة للاستخدام. الزيادة في درجة حرارة تحرض المبكرة اللييفات الكولاجين.
   7. رش جميع الأنابيب والصفائح بشكل جيد التي ستكون في غطاء محرك السيارة مع الايثانول 70٪ والسماح لهم الجافة للتعقيم. وضع حقنة 20 مل على الجليد لتبريد لاستخدامها لاحقا.
   8. في غطاء محرك السيارة PCR، فتح قوالب الصلب غير القابل للصدأ لاطلاق سراح المطاط BSA وباستخدام مشرط، وقطع قنوات العادم من ص BSAالعفن ubber.
   9. تحت غطاء محرك السيارة PCR، وفتح أنابيب الكولاجين معقمة وإضافة 1 مل من محلول HEPES-MEM (تأكد من أن قبل استخراج الحل HEPES-MEM، أنه تمتزج جيدا وليس هناك أي ودائع الصلبة).
   10. باستخدام ملعقة معقمة، مزيج دقيق الحل الكولاجين والعازلة.
   11. إغلاق ودوامة بسرعة لضمان هيدروجيل-تمتزج جيدا.
   12. نقل إلى الباردة حقنة 20 مل.
   13. بيد واحدة، أمسك BSA المطاط داخل البئر، واستخدام البعض، الاستغناء عن نصف الحل الكولاجين هيدروجيل على قاع البئر.
   14. استخدام ملاقط معقمة، تأكد من أن تدفق المطاط وتدفق الغايات ولمس جوانب البئر.
   15. صب الحل الكولاجين على الجزء العلوي من المطاط حتى يتم تغطيتها بالكامل.
   16. تأكد من أن المطاط BSA معلق داخل الكولاجين وأنه لا توجد فقاعات، وخصوصا بالقرب من طرفي المطاط.
   17. وضع غطاء والتفاف حول بارافيلممحيط البئر.
   18. وضع في الحاضنة لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. الحفاظ على ضوء الأشعة فوق البنفسجية على PCR.
2. بعد بلمرة الكولاجين والأشعة فوق البنفسجية تشعبي هيدروجيل عبر الإجراء التالي.
   ملاحظة: وسوف يتم يشابك الكولاجين باستخدام جهاز للأشعة فوق البنفسجية crosslinker فيه كمية من الطاقة يمكن السيطرة عليها.
   1. بدوره على crosslinker الأشعة فوق البنفسجية واستخدام الإعداد الطاقة لأشرق في غرفة فارغة مع 630،000 μJ / سم ^2.
   2. إزالة المواد الهلامية من الحاضنة.
   3. رش اليدين مع الإيثانول، و، داخل غرفة، وإزالة الغطاء في أسرع وقت ممكن.
   4. إغلاق غرفة والأشعة فوق البنفسجية تشعبي الهلاميات المائية عن طريق اختيار الإعداد الطاقة واضاءة 630،000 μJ / سم ^2.
   5. بعد دورة يشابك، إيقاف ضوء الأشعة فوق البنفسجية على غطاء محرك السيارة PCR
   6. رش اليدين مع الإيثانول وفتح الغرفة، ووضع بسرعة الغطاء الخلفي على لوحة جيدا. نقل لوحة جيداإلى غطاء محرك السيارة PCR.
   7. باستخدام ملعقة العقيمة، وتخفيف بلطف وإزالة هلام من البئر. الوجه المواد الهلامية تحت غطاء محرك السيارة لتشعبي الجزء السفلي من هيدروجيل. كرر الخطوة 6.2.3 و6.2.4.

7. انزيم الهضم من جيش صرب البوسنة المطاط

1. من أجل الحصول على سقالة الكولاجين جوفاء، وإزالة BSA المطاط بطريقة لا تؤثر على أبعاد جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل. ووصف الإجراء أدناه.
   1. بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20-30 دقيقة لتعقيم هود زراعة الأنسجة.
   2. جعل 0.25٪ حل التربسين درجة الحموضة 7.8. على سبيل المثال، لمدة 15 مل من الماء، إضافة 0.0376 غرام من التربسين في أنبوب مخروطي 50 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 بإضافة كميات صغيرة (2-5 ميكرولتر) من 1 M كلوريد الصوديوم. وضع الحل في حقنة 20 مل وتوج مع فلتر حقنة 0.20 ميكرون. اضغط على المكبس لطرد السوائل من خلال تصفية وجمع محلول معقم في أنبوب جديد.
   3. بدوره على الحمام المائي وضبط درجة الحرارة إلى 30° C.
   4. بعد 30 دقيقة، وإيقاف ضوء الأشعة فوق البنفسجية. رذاذ الايثانول على جميع الأنابيب والمواد التي سيتم استخدامها في غطاء محرك السيارة.
   5. نقل هيدروجيل الكولاجين تحت غطاء محرك السيارة ووضعها في أنبوب مخروطي منفصل.
   6. إضافة حوالي 3-5 مل (فقط ما يكفي لتغطية المواد الهلامية) من 0.25٪ حل التربسين مع الرقم الهيدروجيني من 7.8 إلى كل أنبوب.
   7. ختم الأنابيب مع بارافيلم ودوامة برفق لحوالي 1 دقيقة.
   8. مكان في 30 ° C حمام الماء لمدة 15-24 ساعة. بينما في حمام مائي، دوامة بخفة المواد الهلامية في كثير من الأحيان حتى يتم هضمها المطاط BSA أو إزالتها من هيدروجيل.
      ملاحظة: من أجل تحديد ما إذا تم إزالة المطاط BSA، إما المطاط يعوم في حل التربسين أو هناك قطعة المعطلة. يجب أن تكون هناك مناطق مظلمة البصرية داخل هيدروجيل.
2. لضمان أن جميع المطاط BSA والتربسين تم إزالتها من الهلاميات المائية، وشطف كما هو موضح أدناه.
   1. تشغيل هوو PCRد ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20-30 دقيقة.
   2. يعد حل Mosconas. الجمع بين كلوريد البوتاسيوم (بوكل، 28.6 ملم)، (NaHCO _3، 11.9 ملم) والجلوكوز (9.4 ملم) و (ناه _{2 ص 4،} 0.08 ملم) في الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم أو 12 حل M حمض الهيدروكلوريك. وضع الحل في حقنة 20 مل واستخدام فلتر حقنة 0.20 ميكرون لتعقيم الحل.
   3. رش كل شيء مع الايثانول قبل وضعها على غطاء محرك السيارة والسماح للإيثانول لتجف.
   4. فتح الأنبوب ونقل 5-10 مل من محلول معقم Mosconas إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
   5. نقل هيدروجيل الكولاجين لأنبوب مخروطي الشكل الذي يحتوي على حل الانزيم. تأكد من أن هيدروجيل مغطاة بالكامل مع الحل. ترك الأنبوب في شاكر في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   6. نضح الحل Mosconas وكرر الخطوة 7.2.5 مرتين.
   7. تخزينها في 4 درجات مئوية.

النتائج

وتظهر النتائج أن هذه التقنية biofabrication فعالة في توليد السقالات 3D التي يمكن أن تحاكي الترتيب المكاني ينظر في الجسم الحي في الأنسجة. الميزات المعمارية هي العوامل الحيوية لتطبيق هندسة الأنسجة، ولعب دورا حاسما في الخلية التفاعل في الجسم الحي وظائف الأنسجة.

كان الاتساق وmixability من المطاط BSA معيارا هاما في إنتاج المطاط BSA الت...

المناقشة

Biofabrication هو حقل متعدد التخصصات للغاية التي تندمج علم الأحياء والهندسة مبادئ لتوليد المواد المعقدة التي تحاكي الأنسجة الأم. من أجل تحقيق ذلك، هناك حاجة إلى تطوير التقنيات التي تستخدم المعلومات التي تم جمعها من في الجسم الحي الأنسجة وترجمتها إلى سقالة في المختبر. وبهذه الطريقة، منبرا يمكن هندستها التي تشبه خصائص المعمارية والفنية، والميكانيكية للأنسجة في الجسم الحي. المواد السقالات المثلى يجب أن تمتلك خصائص معينة، مثل أن تكون حيويا، تحاكي الخواص المي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الكولاجين من النوع الأول			من الكولاجين المستخرج من جلد العجل
حمض الهيدروكلوريك (HCl)	سيجما ألدريتش	7647-01-0
محلول عازلة الفوسفات (أقراص PBS)	MP Biomedical	U5378	1 قرص لكل 100 مل يصنع 1x PBS
Albumium من مصل الأبقار (BSA)	سيجما ألدريتش	A9647
جلوتارالديهايد	سيجما -ألدريتش	G5882	Toxic
Lard	Fields	3090
قوالب			مطحونة باستخدام آلة Microlution
طقم فرشاة الهواء	الهوائية المركزي	47791
طرف الخلط للحقنة المزدوجة	Medmix	ML2.5-16-LLM	خلاط ، DN2،5X16 ، 4: 1 بني ، متوسط
حلقة صغيرة للحقنة المزدوجة	Medmix	PPB-X05-04-02SM	المكبس B ، 5 مل ، 4: 1 ،
غطاء حقنة مزدوج طبيعي PE   ؛	غطاء Medmix	VLX002-SM	، 4: 1/10: 1 ، PE بني ، حلقة ميد
بيج أو للحقنة المزدوجة	Medmix	PPA-X05-04-02SM	مكبس A ، 5 مل ، 4: 1
حقنة مزدوجة	Medmix	SDL X05-04-50M	حقنة مزدوجة ، 5 مل ،
موزع حقنة مزدوجة	Medmix	DL05-0400M	موزع ، 5 مل ، 4: 1 ، متوسط ،
Laminim			عادي 3.6 مجم / مل - مختبر USC
20 مل حقنة لور قفل طرف	دينار بحريني	302830
أغطية قفل لور	فيشر	JGTCBLLX
هيبس	سيجما -ألدريتش	H4034
جيبكو الحد الأدنى من الوسائط الأساسية 10x (MEM)	لايف تكنولوجيز	1143-030
تربسين	لايف تكنولوجيز	27250-018
الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker	سبيكترولين للأشعة فوق البنفسجية	XLE1000
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) فيشر		S271-10	لتحضير موسكوناس
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	سيجما -ألدريتش	P5405-250	لتحضير بيكربونات الصوديوم موسكوناس
(NaHCO3< / sub>) فيشر		BP328-500	لتحضير موسكوناس
جلوكوز	سيجما -Aldrich	G-8270	للتحضير موسكوناس
فوسفات الصوديوم didasic (NaH2< / sub>PO4< / sub>)	Sigma-Aldrich	S-7907	لتحضير
مرشح موسكوناس المعقم للمحاقن	Corning	431224