مقالة منهجية

التصوير CD4 T خلية الخلالية الهجرة في الأدمة الملتهبة

DOI:

10.3791/53585

⸱

مارس 25, 2016

 ,  , 
1David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, NY

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الآليات التي تحكم الحركة من خلالي CD4 المستجيب خلايا تي في مواقع الالتهاب غير معروفة نسبيا. نقدم نهجا غير الغازية لتصور والتلاعب في المختبر -primed خلايا CD4 T في الأدمة الأذن الملتهبة، والسماح لدراسة السلوك الديناميكي لهذه الخلايا في الموقع.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدرة خلايا CD4 T للقيام بمهام المستجيب تعتمد على الهجرة بسرعة وكفاءة هذه الخلايا في الأنسجة الطرفية الملتهبة من خلال آلية غير معروف كما هو وحتى الان. تطبيق الفحص المجهري multiphoton لدراسة الجهاز المناعي يوفر أداة لقياس ديناميكية من الاستجابات المناعية داخل أنسجة سليمة. هنا نقدم بروتوكول لغير الغازية التصوير multiphoton حيوي داخلي من خلايا CD4 T في الأدمة الماوس الأذن الملتهبة. استخدام منصة التصوير العرف والقسطرة الوريدية تسمح لتصور ديناميات الخلايا التائية CD4 في الخلالي عن طريق الجلد، مع القدرة على استجواب هذه الخلايا في الوقت الحقيقي عن طريق إضافة منع الأجسام المضادة إلى المكونات الجزيئية الرئيسية المشاركة في الحركة. ويوفر هذا النظام مزايا أكثر كلا النموذجين في المختبر وإجراءات التصوير الغازية جراحيا. فهم مسارات تستخدم من قبل خلايا CD4 T للحركية قد تقدم في النهاية نظرة ثاقبة على باسيلوظيفة ج خلايا CD4 T فضلا عن التسبب في كل من أمراض المناعة الذاتية والأمراض من الالتهابات المزمنة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد وظيفة المستجيب لخلايا CD4 T بشكل حاسم على قدرتها على الدخول بسرعة إلى مجموعة متنوعة من الأنسجة الطرفية واجتياز مجموعة متنوعة من الأنسجة الطرفية لمسح الضرر أو تحديد بؤر العدوى أو التسبب في علم الأمراض من العدوى المزمنة أو المناعة الذاتية. في حين أن عمليات التوجيه إلى المواقع الملتهبة1-4 والتسرب5-7 من الأوعية الدموية إلى الأنسجة قد تم توصيفها جيدا ، فإن العوامل التي تدفع وتنظم الحركة الخلالية للخلايا التائية لا تزال غير محددة. تمت دراسة هجرة الخلايا التائية في بيئات ثلاثية الأبعاد المعقدة في المختبر من خلال استخدام المصفوفات الاصطناعية8-10 أو أجهزة الموائع الدقيقة11،12 ، لكنها تفشل في تلخيص البيئة المعقدة والديناميكية لنظام في الجسم الحي. في الآونة الأخيرة فقط ، مع ظهور التصوير متعدد الألوان عالي الدقة داخل الحيوية ، أصبح من الممكن دراسة السلوك الديناميكي للخلايا المناعية في الموقع ، مما يسمح بفهم أفضل للاستجابات المناعية السليمة.

منذ أكثر من عقد من الزمان ، تم نشر العديد من الدراسات المؤثرة التي استخدمت لأول مرة الفحص المجهري متعدد الفوتون لمعالجة الأسئلة المناعية. ركزت الدراسات المبكرة على سلوك الخلايا المناعية داخل الأعضاء اللمفاوية المزروعة13-16 ، والتي سرعان ما تبعتها تقنيات لتصوير الغدد الليمفاوية المكشوفة في الفئرانالمخدرة 17. سمح التصوير بملاحظات أساسية جديدة حول مراحل تحضير العقدة الليمفاوية للخلايا التائية18 ، والآليات التي تهاجر بها الخلايا التائية في الأعضاء اللمفاوية الثانوية19 ، وتفاعلات الخلايا التائية مع الخلايا المناعية الأخرى20،21 ، ووضع الخلايا التائية الديناميكية داخل العقدة الليمفاوية22. على الرغم من أن العديد من الدراسات المبكرة ركزت على ديناميكيات العقدة الليمفاوية ، فقد تم استخدام التصوير داخل الحيوية منذ ذلك الحين لتصوير الاستجابة المناعية في العديد من الأنسجة المحيطية ، بما في ذلك الدماغ23-25 والكبد26 والرئة27 والجلد28-30.

أدمة أذن الفأر مهيأة بشكل خاص للتصوير ، بسبب نحافة جلد الأذن ، والنقص النسبي في الشعر ، والسهولة التي يمكن بها عزلها عن حركات الجهازالتنفسي 31. في الواقع ، تم استخدام أدمة الأذن لتصوير السلوك الخلالي للخلايا المتغصنة32،33 ، والخلايا التائية28،29،34،35 ، والعدلات36،37 ، وهي موقع راسخ لدراسة التهاب الجلد. على نحو متزايد ، تحل الإجراءات غير الغازية محل المستحضرات الجراحية للجلد ، بما في ذلك الأدمة المنقسمة38،39 أو الجناح39،40 أو نافذة السديلة الجلديةالظهرية 39،41 ، والتي يمكن أن تحدث تغييرات في البيئة الالتهابية المحلية. يسمح استخدام الخلايا التائية المستجيب CD4 المنقولة ، في المختبر ، الخاصة بالمستضد بدراسة مجموعة متجانسة من الخلايا في سياق الاستجابة الالتهابية الجلدية30. نصف هنا إجراء تصوير غير جراحي يسمح بتصور خلايا CD4 T المستجيبة الخاصة بالمستضد في الخلال الجلدي لأذن الفأر الملتهبة ، والقدرة على معالجة هذه الخلايا في الوقت الفعلي عن طريق إدخال الأجسام المضادة الحاجزة من خلال قسطرة وريدية. نوضح أن هذا النموذج فعال في تتبع حركة خلايا CD4 T في الأدمة والاستعلام عن الآليات التي تحكم هذه الحركة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران عن طريق لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة روشستر، ونفذت بما يتفق بدقة مع قانون رعاية الحيوان وسياسة دائرة الصحة العامة للرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية من قبل المعاهد الوطنية تدار الصحة ومكتب رعاية حيوانات التجارب.

1. إعداد خلايا CD4 T المستجيب

ملاحظة: BALB / ج-TCR المعدلة وراثيا الفئران DO11.10 التي تعترف على وجه التحديد الببتيد من ألبومين البيض بيضة دجاجة (pOVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). يمكن أن تكون بديلا أنظمة TCR المعدلة وراثيا أخرى، وذلك باستخدام الببتيد وما شابه ذلك مناسبا في مكان pOVA حيث المشار إليها.

  1. تنقية خلايا CD4 T السذاجة
    1. الموت ببطء القديم أسابيع 6-8 الإناث DO11.10 BALB / ج الماوس عن طريق تعريض إلى 2 لتر / دقيقة CO 2 حتى يظهر الماوس لا توجد مؤشرات على الحركة أو التنفس لمدة 1 دقيقة، تليها خلع عنق الرحم، أو وفقا لالمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام المحلية. رذاذ الفأر مع حل الإيثانول 70٪، وجعل شق حوالي 7 سم في الجلد من الذقن من الماوس ل2/3 من الطريق إلى أسفل البطن. جعل 2-3 شقوق الجلد الطول من نهاية شق في البطن نحو قدميه الخلفيتين. يجب الحرص على عدم قطع في الغشاء البريتوني.
    2. بعناية فصل الجلد من البريتوني عن طريق سحب بلطف مع ملقط. تقع الغدد الليمفاوية الأربية على الجلد بالقرب من تقاطع الساقين الخلفيتين مع الجسم. إزالة من استيعاب وسحب بالملقط وقعت في 8 مل من HBSS تستكمل مع 2٪ مصل العجل (سي إس).
    3. حصاد الإبطين والليمفاوية العضدية العقد من الماوس عن طريق استيعاب وسحب بلطف مع ملقط. ضع في HBSS + 2٪ NCS مع الغدد الليمفاوية الأربية.
    4. حصاد الغدد الليمفاوية الرقبية العميقة والسطحية التي تقع في الرقبة من الفأرة مع ملقط ومكان في HBSS + 2٪ NCS مع التمديدالغدد الليمفاوية لها.
    5. خفض بلطف في الصفاق، مع الحرص على عدم قطع في الأمعاء. فهم الأعور والقولون مع ملقط وفضح الغدد الليمفاوية المساريقي التي تقع فقط على طول القولون. بعناية إزالة الغدد الليمفاوية المساريقي مع ملقط ووضع مع الغدد الليمفاوية الأخرى.
    6. حدد موقع الطحال في التجويف البريتوني وإزالة بعناية، وعقد مع ملقط وقطع النسيج الضام بعيدا مع زوج من مقص جراحي. وضع الطحال مع الغدد الليمفاوية.
    7. إعداد تعليق خلية واحدة بواسطة صب + 2٪ NCS HBSS يحتوي على الطحال والغدد الليمفاوية في مصفاة معدنية توضع في طبق ثقافة 60 × 15 مم. الهريس بلطف الطحال والغدد الليمفاوية من خلال مصفاة معدنية مع المكبس من حقنة 10 مل في + 2٪ NCS HBSS.
    8. باستخدام ماصة، نقل تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي 50 مل نظيفة. شطف مصفاة معدنية وصحن الثقافة مع 10 مل إضافية من HBSS + 2٪ NCS، شالغناء ماصة، ووضع هذا الحل في نفس 50 مل أنبوب الطرد المركزي كما تعليق خلية.
    9. تدور الخلايا في 600 x ج لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه و resuspend في 10 مل HBSS + 2٪ NCS من قبل pipetting بلطف. ما لم ينص على خلاف ذلك، يجب أن يتم تنفيذ كل الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. تمييع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في 90 ميكرولتر من 0.1٪ أزرق التريبان في برنامج تلفزيوني لتخفيف 01:10. ضع 10 ميكرولتر من الخلايا في الزرقاء التريبان على عدادة الكريات من قبل pipetting الحل في أخدود على حافة عدادة الكريات. عدد خلايا الدم البيضاء في الشبكة وسط عدادة الكريات، وتجاهل كريات الدم الحمراء التي تظهر أصغر قليلا، الجولة، خلايا الدم الحمراء ملون والزرقاء ميتة خلية / الموت. مضاعفة عدد الخلايا تحسب بنسبة 10 4، من قبل عامل التخفيف (10)، وحجم الخلايا (10 مل) لتحديد العدد الكلي للخلايا التي تم جمعها في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    11. إلى إثراء للخلايا CD4 T، الطرد المركزيخلايا لتكوير، وresuspend الخلايا في 2x10 7 خلية / مل في محلول يحتوي على ما يقرب من 1 ميكروغرام / مل مكافحة CD8 (استنساخ 3.155)، 1 ميكروغرام / مل مكافحة MHC من الدرجة الثانية (استنساخ M5 / 114)، و 1 ميكروغرام / مل مكافحة CD24 (استنساخ J11d) الأجسام المضادة في HBSS + 2٪ NCS من قبل pipetting بلطف.
      ملاحظة: يتم استخراج الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الخطوة في المنزل من خطوط الخلايا هجين ويقترب تركيزات. تم تحديد تركيز وحجم هذه الأجسام المضادة مثالية للتحلل تكملة تجريبيا وسوف تختلف بين المختبرات. بدلا من ذلك، تتوفر لتنقية خلايا CD4 T السذاجة عدة مجموعات المتاحة تجاريا، ويمكن أن تكون بديلا للتحلل مكملا وعملية تنقية CD62L + الممثلة هنا. في حالة استخدام طريقة أخرى لتنقية خلايا CD4 T السذاجة، هذا البروتوكول لا يمكن أن تستمر من الخطوة 1.2.
    12. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. في نهاية هذه الحضانة، ذوبان الجليد بسرعة خنزير غينيا تكملة طريق وضع في 37 درجة مئوية الماء بATH لحوالي 2 دقيقة. إضافة 100 ميكرولتر من تكملة لكل 1 مل من الخلايا في حل الأجسام المضادة من قبل pipetting تكملة مباشرة إلى تعليق الخلية. احتضان الخلايا في 37 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة.
    13. إضافة HBSS + 2٪ NCS لجعل الخلايا إلى إجمالي حجم 20 مل في أنبوب الطرد المركزي. طبقة في 8 مل من وسائل الاعلام RT الكثافة الطرد المركزي (الكثافة 1.086 غ / مل) تحت الخلايا. على الفور أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1400 x ج في RT لمدة 15 دقيقة مع أجهزة الطرد المركزي قبالة الفرامل.
    14. جمع الخلايا في واجهة استخدام المصلية خلايا ماصة ونقل إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة. غسل الخلايا عن طريق جعل وحدة التخزين في أنبوب الطرد المركزي إلى 50 مل مع HBSS + 2٪ NCS والطرد المركزي.
    15. resuspend الخلايا في عازلة أجهزة ماكينتوش (PBS تستكمل مع 2٪ NCS و 2 ملي EDTA) من قبل pipetting بلطف واعتباره سابقا، في خطوة 1.1.10.
    16. إلى إثراء للخلايا CD4 T السذاجة، resuspend الخلايا في 2x10 7 خلية / مل في محلول2.5 ميكروغرام / مل البيوتين مترافق مكافحة CD62L الأجسام المضادة في المخزن أجهزة ماكينتوش، استنادا إلى عدد عدها في الخطوة 1.1.16. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    17. غسل الخلايا بإضافة 10 مل بالاعمال العازلة، ثم الطرد المركزي الخلايا. resuspend الخلايا في 10 7 خلية / 100 ميكرولتر العازلة في أجهزة ماكينتوش وإضافة الخرز الفصل المغناطيسي streptavidin مترافق في التخفيف 1:10 مباشرة إلى الخلايا. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    18. غسل الخلايا كما كان من قبل، في خطوة 1.1.17، و resuspend الخلايا في 2x10 8 خلية / مل في المخزن أجهزة ماكينتوش، في حجم الحد الأدنى من 500 ميكرولتر.
    19. ضع عمود الفصل المغناطيسي في حامل المغناطيس وغسل العمود عن طريق السماح عازلة 3 مل بالاعمال تتدفق من خلال. تطبيق الخلايا إلى العمود مع ماصة.
    20. غسل العمود لإزالة الخلايا غير ملزمة العمود المغناطيسي من قبل pipetting 3 مل بالاعمال العازلة على العمود والسماح المخزن المؤقت بالاعمال في التدفق من خلال، وكرر 3 مرات. تجاهل التدفق من خلال الكسر.
    21. ازالتهاه عمود من الوقوف المغناطيسي وعقد أكثر من 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة. الماصة 5 مل من العازلة أجهزة ماكينتوش على العمود واستخدام المكبس المغلقة مع العمود لدفع بالاعمال العازلة من خلال عمود للافراج عن خلايا العمود المنضم وجمع من خلال تدفق الذي يحتوي على خلايا CD4 T السذاجة المخصب.
    22. الطرد المركزي الخلايا و resuspend في 10 مل RPMI تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، و 100 وحدة دولية / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول (RPMI-10). عدد الخلايا كما كان من قبل، في خطوة 1.1.10.
    23. ضبط التركيز النهائي للخلايا CD4 T ساذجة إلى 6x10 5 / مل في RPMI-10.
  2. تنقية T-المنضب خلية ناقلات الجنود المدرعة الطحال
    1. الموت ببطء القديم أسابيع 6-8 الإناث من النوع البري BALB / ج الماوس كما في الخطوة 1.1.1.
    2. رذاذ الفأر مع حل الإيثانول 70٪ وفضح الطحال عن طريق شق حوالي 3 سم على الجانب الأيسر من abdome الماوس،ن. خفض فتح طبقة البريتوني وإزالة الطحال من خلال استيعاب برفق مع ملقط وقطع عليه بعيدا عن الأنسجة التي تربط الكامنة مع مقص جراحي.
    3. وضع الطحال إلى 8 مل من HBSS + 2٪ NCS.
    4. إعداد تعليق خلية واحدة من يهرس الطحال، وغسل، وعدد الخلايا، كما كان من قبل، في خطوات 1.1.7-1.1.10
    5. تستنفد خلايا تي من قبل الغزل الخلايا في 600 x ج لمدة 5 دقائق لبيليه، وresuspend الخلايا في 2x10 7 في حل ما يقرب من 1 ميكروغرام / مل مكافحة Thy1.2 الأجسام المضادة (J1J استنساخ) من قبل pipetting بلطف. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: وقد استمدت هذه الأجسام المضادة في المنزل من خط خلية هجين وتقريب concentraton. تم تحديد تركيز وحجم هذه الأجسام المضادة مثالية للتحلل تكملة تجريبيا وسوف تختلف بين المختبرات. يمكن أن تكون بديلا أساليب أخرى لناقلات الجنود المدرعة تنقية من splenocytes إذا رغبت في ذلك. خلايا T ساذجة وناقلات الجنود المدرعة يجب أن يكون مستعدا في عبادةلدى عودتهم من الخطوة 1.3.
    6. إضافة خنزير غينيا تكملة، واحتضان، وفصل الخلايا في وسائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي كما كان من قبل، في خطوات 1.1.13-1.1.14.
    7. resuspend الخلايا في 10ML من RPMI 10 وأشرق ناقلات الجنود المدرعة من خلال وضع خلايا في أنبوب 50 مل الطرد المركزي في irradiator جاما لطول الفترة الزمنية التي سوف تعرض الخلايا إلى 25 الإشعاع غراي. وهذه المدة تختلف استنادا إلى irradiator وسوف تحتاج إلى أن تحسب كل مرة يتم المشع الخلايا.
    8. عد الخلايا على عدادة الكريات كما كان من قبل، في خطوة 1.1.10، وضبط خلايا APC إلى تركيز النهائي من 2.4x10 6 خلية / مل في RPMI-10.
  3. تحفيز الخلايا وتمييز الخلايا التائية CD4 إلى النمط الظاهري TH1 في ثقافة لمدة 5 أيام.
    ملاحظة: على الرغم من أننا نقدم هنا بروتوكول لإعداد وتصوير المؤثرات TH1 المتولدة من خلايا CD4 T السذاجة، وهذا البروتوكول يمكن تعديلها لتمييز الخلايا الساذجة إلى النمط الظاهري مختلفة، أو رس استخدام أنواع أخرى من الخلايا، مثل الخلايا التائية CD8. وشروط فتيلة والتمايز يجب أن تحدد تجريبيا.
    1. في كل بئر من صحن الثقافة 24 بشكل جيد، والجمع بين 500 ميكرولتر من خلايا CD4 T السذاجة و 500 ميكرولتر من ناقلات الجنود المدرعة المشع في كل بئر، ليصبح المجموع 3x10 5 خلايا تي و1.2x10 6 ناقلات الجنود المدرعة لكل بئر.
    2. يعد حل في RPMI-10 التي تحتوي على 2 ميكرومتر وما شابه ذلك OVA الببتيد، 20 U / مل المؤتلف IL-2، 80 ميكروغرام / مل مكافحة IL-4 (استنساخ 11B11) و 40 نانوغرام / مل المؤتلف IL-12 و تصفية باستخدام 0.2 حقنة ميكرون فلتر. إضافة 1ml من هذا الحل إلى كل بئر من الخلايا، لإجمالي حجم 2 مل في كل بئر.
    3. احتضان الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 3 أيام.
    4. في يوم 3، وتقسيم الحضارات pipetting بلطف ل resuspend الخلايا وتتحرك 1 مل من كل بئر إلى ثقافة جديدة أيضا. جلب كل بئر إلى الحجم النهائي من 2 مل عن طريق إضافة 1 مل جيدا / من RPMI-10 + 20 U / مل المؤتلف IL-2.
    5. العودة لوحات لالحاضنة وتسمح للخلايا لتوسيع حتى يوم 5.

2. نقل الخلايا وتحريض التهاب

ملاحظة: للحصول على أرقام الهواتف المحمولة الأمثل للتصوير، ينبغي نقل 5X10 6 خلايا TH1 fluorescently المسمى إلى كل فأر في إجمالي حجم 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. خلايا وصفت هنا مع CFSE صبغة خضراء أو القريب الحمراء CMTMR صبغ، على الرغم من غيرها من الأصباغ خلية تعقب يمكن استخدامها. CFSE والخلايا المسمى CMTMR يمكن أن يشترك في نقل للسماح لتتبع اثنين المستجيب متميز السكان CD4.

  1. التسمية المستجيب الخلايا التائية مع CFSE
    1. حصاد الخلايا من الأطباق الثقافة من قبل pipetting بقوة الخلايا في كل بئر ونقل إلى أنبوب 50ML الطرد المركزي العقيمة مع الماصة. عدد الخلايا كما في الخطوة 1.1.10، ثم الطرد المركزي و resuspend الخلايا في 10 7 خلية / مل في برنامج تلفزيوني + 5٪ NCS.
    2. تمييع 5 ملي الأسهم CFSE الحل 1: 100 فيبرنامج تلفزيوني. إضافة 110 ميكرولتر حل CFSE لكل 1 مل من الخلايا عن طريق وضع قطرة من حل CFSE على جانب الأنبوب ثم بسرعة تعصف أنبوب ذهابا وإيابا إلى مزيج دقيق.
    3. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق على RT، ثم يطفئ CFSE بإضافة 5 مل من مصل العجل الجنين (FCS) مباشرة إلى أنبوب من الخلايا. تبرزي حجم 50 مل مع برنامج تلفزيوني + 5٪ NCS.
    4. الطرد المركزي الخلايا و resuspend بيليه في 20 مل PBS + 5٪ NCS. كرر هذه العملية مرتين أخريين لغسل الخلايا 3 مرات الإجمالية. عد الخلايا في عدادة الكريات، كما كان من قبل، في خطوة 1.1.10، و resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني العقيمة في 2.5 × 10 7 خلية / مل لنقلها إلى الفئران.
  2. التسمية المستجيب الخلايا التائية مع CMTMR
    1. حصاد الخلايا على النحو الوارد أعلاه في الخطوة 2.1.1، ثم عد، الطرد المركزي و resuspend الخلايا في 10 7 خلية / مل في RPMI-10.
    2. إضافة 10 ملي CMTMR المحلول مباشرة إلى الخلايا لتركيز النهائي من 10 ميكرومتر. عشر الماصة بسرعةخلايا الإلكترونية لمزيج دقيق في CMTMR وتمنع ترسب صبغة.
    3. احتضان 30 دقيقة في 37 ° C حمام الماء. غسل الخلايا 3X في برنامج تلفزيوني + 5٪ NCS كما كان من قبل، في خطوة 2.1.3-2.1.4. العد وresuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني العقيمة في 2.5x10 7 خلية / مل لنقلها إلى الفئران.
  3. نقل الخلايا التائية المستجيب لالسذاجة 6-8 الاسبوع الإناث القديمة الفئران BALB / ج.
    1. رسم تعليق الخلية (الخطوة 2.1.4 أو 2.2.3) إلى حقنة، مع الحرص على إزالة كافة الفقاعات من خلال عقد إبرة حقنة جانب المتابعة، عبها بلطف الجانب من الحقنة وتحريك المكبس صعودا وهبوطا، إذا لزم الأمر .
    2. وضع الفئران في قفص نظيفة والحرارة بلطف تحت مصباح الحرارة حتى يبدو vasodilated الوريد الذيل. ضع الماوس في جهاز الزجرية ومسح الذيل مع مسحة الكحول. حقن ببطء 200 ميكرولتر من تعليق خلية في الوريد الذيل الأفقي. يجب أن تكون هناك مقاومة لحقن أو فقاعات مرئية تحت الجلد.
  4. حمل التهاب الجلد بتحصين مع كامل المصاحب فرويند (CFA)
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، ويتسبب الالتهاب عن طريق الحقن داخل الأدمة للCFA مستحلب مع المستضد إما وما شابه ذلك أو غير وما شابه ذلك. يمكن أن تكون بديلا نماذج التهابات أخرى، على الرغم من أن عدد الخلايا اللازمة لنقل وتوقيت التصوير سوف تحتاج إلى تعديل تجريبيا.
    1. يعد حل 200 ميكرومتر من OVA الببتيد في برنامج تلفزيوني العقيمة في أنبوب microcentrifuge. الماصة لما يعادل حجم CFA على رأس من الحل الببتيد.
    2. يستحلب الحل عن طريق رسم عليه في 28 G1 حقنة / 2 الأنسولين ومن ثم تغرق الحل مرة أخرى في أنبوب microcentrifuge، ثم تكرار هذا العمل ما يقرب من 20 مرة. عندما مستحلب تماما، فإن CFA وحل الببتيد تشكيل خليط سميك وغير شفافة.
      ملاحظة: لا بد من استخدام حقنة إبرة الأنسولين ثابتة لتشكيل مستحلب، كما سيتم فقدان مستحلب في الفضاء الميت في needl غير ثابتالبريد حقنة.
    3. اختبار مستحلب من خلال إسقاط كمية صغيرة على الماء توضع في طبق بتري. وينبغي أن تظل مستحلب سليمة ولا تفريق في الماء.
    4. رسم مستحلب إلى 300 ميكرولتر 28 حقنة G1 / 2 الأنسولين واضغط لأسفل بشدة على المكبس لإزالة فقاعات الهواء الكبيرة.
    5. مباشرة بعد نقل fluorescently المسمى خلايا T المستجيب، تخدير الفئران عن طريق الحقن الملكية الفكرية من 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول في 240 ملغ / كغ. تقييم التخدير عن طريق قرصة اصبع القدم لطيف، وإدارة أكثر 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول في 1 زيادات ملغ، إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: التخدير المعتمدة الأخرى قد تكون بديلا لل-ثلاثي بروم إيثانول 2،2،2.
    6. وضع كشتبان على السبابة اليسرى وفهم بعناية الأذن الماوس، بين الإبهام الأيسر والسبابة مع الأذن بطني مواجهة. تأكد من عدم الضغط المفرط على الأذن، والتي يمكن أن تسبب التلف الميكانيكي على الجلد.
    7. حرك إبرة تحتوي على CFA هmulsion في الأدمة، الجانب شطبة مواجها لها، ويحقن ببطء 10 ميكرولتر من مستحلب في الأذن. وينبغي أن يكون موضع الحقن في 1/3 الخارجي من الصيوان، قليلا خارج مركز للسماح للتصوير الأمثل.
    8. مراقبة الفئران حتى ترتديه التخدير قبالة والفئران قادرة على صحيحا نفسها وتكون المتنقلة. الفئران صورة 3 أيام بعد التطعيم، وتوفير الوقت للالتهاب لتطوير وخلايا T تحويلها إلى حركة المرور إلى الأدمة الأذن.
      ملاحظة: لا يمكن ترك الفئران غير المراقب في أي وقت أثناء تحت التخدير.

3. إعداد الماوس للتصوير

  1. إعداد القسطرة
    1. بعناية إزالة إبرة معدنية من 30 G1 / 2 السلين (السل) إبرة حقنة مع كماشة وتنظيف قبالة أي الغراء الزائد، وذلك باستخدام نطاق تشريح لتصور أن الصمغ هو إزالتها تماما.
    2. قطع رأس قبالة 30 G1 / 2 تيرابايت حقنة إبرة أخرى، وضمان أن الإبرة المتبقية لا تزال صatent بالمعاينة البصرية. تنزلق قطعة 18 سم من PE-10 الأنابيب الطبية على الإبرة قلص، ووضع بعناية الإبرة المعدنية العارية ما يقرب من 5 ملم إلى الطرف الآخر من الأنبوب، وخلق القسطرة.
  2. طرد القسطرة عن طريق ملء السل حقنة 1 مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة، وإزالة أي فقاعات الهواء. وضع بلطف القسطرة على طرف الحقنة، ودفع برنامج تلفزيوني بلطف على الرغم من أن قسطرة لإزالة أي فقاعات في الأنبوب.
    ملاحظة: عند الضغط السوائل عن طريق القسطرة، لا بد من عقد القسطرة على حقنة لمنع ضغط السائل من دفع القسطرة الخروج من حقنة.
  3. وضع الفئران في قفص نظيفة والحرارة بلطف تحت مصباح الحرارة حتى يبدو vasodilated الوريد الذيل. تخدير الفأر مع خليط من هواء الغرفة والأيزوفلورين (5٪ تحريض، صيانة 1-2٪، في 2 لتر / دقيقة معدل التدفق)، المقدمة من خلال تجميع الرؤوس التي ارتبطت المرذاذ الأيزوفلورين. تأكد من أن الفأر هو تخدير وايث قرصة اصبع القدم لطيف. زيادة تدريجية في معدل تدفق الأيزوفلورين بنسبة 0.1٪ إذا لوحظ حركة. تغطية العينين مع مرهم للعين لمنع جفاف وإصابة بينما الفأر هو تخدير.
    ملاحظة: من الضروري أن الفئران أبدا أن تترك غير المراقب في حين تخدير. يجب في كثير من الأحيان يتم رصد الفئران لالتخدير كافية عن طريق قرصة اصبع القدم لطيف.
  4. لشل حركة الذيل في قاعدة مع زوج من ملقط، ثم امسح الذيل مع مسحة الكحول. الشريحة بعناية قسطرة في الوريد الذيل الأفقي وتحقق من المباح عن طريق دفع بلطف على المكبس من الحقنة. يجب أن تكون هناك مقاومة لحركة ولا محتدما مرئية من برنامج تلفزيوني تحت الجلد إذا ما وضعت بشكل مناسب. يلصق القسطرة إلى ذيل من خلال تطبيق 1-2 قطرات من مادة لاصقة الأنسجة cyanoacrylate إلى موقع الحقن والسماح ليجف، ما يقرب من 30 ثانية.
  5. تقليم بعناية الشعر من الخلف والجانبين من الأذن مع زوج من مقص، مع الحرص على عدم الإضرار كورونافي. تقليم شعيرات كذلك. باستخدام قطعة من القطن المبللة على السطح الداخلي من الأذن مع برنامج تلفزيوني.
  6. تدوير الماوس والأذن على 24 × 50 مم رقم 1.5 غطاء زجاجي زلة. باستخدام ملقط، تتسطح بلطف الأذن على انزلاق الغطاء، تحريك الماوس إذا لزم الأمر للتأكد من أن الأذن هي الاحمرار مع الزجاج. إزالة الزائدة برنامج تلفزيوني من الأذن من قبل النشاف بلطف بمنديل يمسح.
    ملاحظة: تأكد من عدم الضغط بقوة أيضا على الأذن، والجلد الرقيق يمكن أن تتلف بسهولة مع الضغط المفرط.
  7. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط المنحنية، فهم قطعة حوالي 20 مم طويل من الشريط النسيج طوليا في الزوايا العليا. وضع أسفل الشريط على ساترة في الجزء العلوي من الأذن الماوس، ولفة الشريط على بقية الأذن، ودفع الشعر الزائد للخروج من الطريق مع ملقط إذا لزم الأمر لتركيب الأذن إلى ساترة. اضغط بلطف على الشريط حول الأذن مع مسحة القطن الجاف لضمان ختم ضيق، مع الحرص على عدم الضغط على الأذن نفسها.
  8. إرفاق منصة التصوير إلى 37 درجة كتلة C التدفئة مع شريط لاصق. تطبيق الشحوم فراغ على جانبي منطقة الأذن من منصة التصوير. تدوير الماوس لوضع ساترة على منصة التصوير، مع الحرص على المواءمة بين الأذن في مركز شعر.
    ملاحظة: تجنب الحصول على فراغ الشحوم على الشريط، لأن ذلك سوف يؤدي إلى تأتي بمعزل عن غطاء زجاجي زلة.
  9. المفاجئة الرؤوس الأيزوفلورين في حامل على منصة التصوير، والتأكد من أن الرؤوس آمنة وتغطي تماما أنف الفأر. نشر الشحوم فراغ تحت ساترة عن طريق الضغط بحزم ولكن بعناية ساترة على منصة التصوير مع قطعة من القطن نظيفة وجافة.
  10. يلصق ساترة لمنصة مع اثنين من 20 ملم قطعة من الشريط وقطعتين أطول من الشريط ملفوفة حول الجزء العلوي من المنصة. إذا أي فقاعات هواء موجودة بين الأذن وساترة، ويمكن إزالتها بلطف عن طريق الضغط على الأذن من دون وايث قطعة من الورق مطوية.
    ملاحظة: من الضروري عدم استخدام ورق سميك جدا أو الضغط بشدة، لأن ذلك يمكن أن يسبب الأنسجة ابيضاض والضرر، وتعقيد النتائج.
  11. تحريك الماوس لمرحلة المجهر وتأمين منصة بشريط لاصق. الأنابيب طبقة مزدوجة من الشحوم فراغ على ساترة حول الأذن لتكون بمثابة خزان للهدف الغمر بالماء.
  12. التفاف بطانية التدفئة مملوءة بالماء في جميع أنحاء الماوس من خلال منصة التصوير. ملء الخزان مع 37 درجة مئوية الماء المقطر. تأكد من أن كل شيء يتم تأمين على خشبة المسرح مع شريط لاصق وأن حقنة من القسطرة يمكن الوصول إليها بسهولة.

4. في فيفو التصوير الوقت الفاصل بين والإدارة الأجسام المضادة عن طريق الوريد

ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب استخدام المجهر multiphoton مجهزة تي: نظام ليزر سا. الهدف المستخدم هو عدسة 25X التكبير مع 1.05 NA، الملصقة مع كائنتعيين إيف سخان إلى 40 درجة مئوية. تم تحديد درجة الحرارة المثلى لهذا سخان تجريبيا أن تكون درجة الحرارة المناسبة للحفاظ على الأدمة الأذن عند 37 درجة مئوية، وربما تحتاج إلى تعديل للاستخدام في أنظمة التصوير الأخرى. قد تضطر إلى إجراء للعمل على أنظمة تكوين مختلف البرامج اكتساب المستخدمة قد تختلف بين الصكوك وتعديلات على البروتوكول. تأكد من أن الصور يمكن انقاذه في تنسيق متوافق مع أي برامج التحليل المطلوب.

  1. تحديد موقع الأدمة من خلال العدسات عن طريق وضع الهدف على مركز الأذن وخفض الهدف فقط حتى إنها تجري اتصالات مع سطح الماء في الخزان. باستخدام مصدر ضوء خارجي، ننظر من خلال العدسات والاستمرار في خفض ببطء الهدف حتى يأتي سطح الأذن إلى التركيز. خفض الستائر الداخلية والخارجية حول المرحلة المجهر.
  2. تحديد إعدادات المجهر وتحديد مكان وجود منطقة للتصوير
    1. قبل IMAGINز، تكوين ليزر لالإثارة القصوى والكشف عن fluorophores المرجوة من خلال تعديل الطول الموجي ليزر 900 نانومتر في إطار النائب تحكم الليزر، وقوة الليزر في إعداد اكتساب: نافذة ليزر، والفولتية PMT في صورة إطار التحكم اكتساب .
      ملاحظة: يستخدم هذا الإجراء على الطول الموجي الإثارة من 900 نانومتر مع المرشحات للكشف عن الجيل الثاني التوافقي (420-460 نانومتر)، CFSE (495-540 نانومتر)، وCMTMR (575-630 نانومتر). تكوينات أخرى يمكن أن تستخدم لكشف fluorophores مختلفة كما تريد.
    2. تعيين المجهر إلى 512 × 512 بيكسل، مع زمن السكون 2 μsec / بكسل في إعداد اكتساب: حجم ووضع النوافذ. تنشيط وضع التصوير الحي للسماح المسح الضوئي من خلال النسيج لمساحة لصورة بالنقر على "تكرار XY". من الناحية المثالية، ينبغي أن تكون منطقة موحدة نسبيا، من دون فقاعات الهواء، وتجنب المناطق من بصيلات الشعر الكثيفة.
      ملاحظة: مستحلب CFA هو autofluorescent الزاهية في المنطقة الخضراء وشمال شرقع الحمراء القنوات ويجب تجنبها. حقل الأمثل عادة ما يمكن العثور على ما يقرب من 3 ملم من حافة مستحلب. ما يقرب من 10 - يمكن تتبع 100 خلية في صورة واحدة. إذا كان الكثير من خلايا موجودة، سوف تتبع البرامج تواجه عموما أخطاء في محاولة لفصل الخلايا الواقعة عن كثب، مما يؤدي إلى مسارات خلية تقصير و / أو غير دقيقة.
    3. مرة واحدة وقد يقع حقل التصوير المناسب، وتحديد المنطقة Z التي سيتم تصويرها عن طريق تحديد موقع الخلية "أعلى" في الأدمة، وضع Z-موقف ل0 بالنقر فوق الزر "تعيين 0"، والتمرير لأسفل في Z الاتجاه لقياس مدى عمق الخلية. عمق التصوير من 35-75 ميكرون هو نموذجي. تعيين المناصب البداية والنهاية في إعداد اكتساب: نافذة مجهر. ضبط الصك الفولتية PMT وقوة الليزر في إطار "Z مشرق" لتحسين التصور من الخلايا في جميع أنحاء عمق حقل التصوير.
      ملاحظة: تجنب رفع لاسالسلطة إيه أكثر من 25 ميغاواط في العينة، يمكن لمستويات عالية الطاقة كما يسبب ضرر الحرارة والإصابة معقمة لالأدمة. فإن أقصى طاقة المناسب لكل المجهر تختلف وسوف يتعين قياس. وتجدر الإشارة إلى أن زيادة قوة الليزر أو الفولتية PMT مع عمق الأنسجة لا تسمح للمقارنة كمية من سطوع الصورة على أعماق مختلفة في تحليل ما بعد الشراء.
    4. التحقق من "العمق" وأزرار "تايم" تحت زر "مسح" في صورة إطار التحكم الاستحواذ. تعيين مرشح كالمان لمسح الصورة 3 مرات في كل سطر في التحكم اكتساب صورة: نافذة وضع تصفية وضبط عمق Z-شريحة في اكتساب صورة: نافذة مجهر بحيث يستغرق حوالي 1 دقيقة لالتقاط كومة كاملة، كما لوحظ في الإطار TimeView.
      ملاحظة: الفاصل الزمني بين أكوام يجب أن لا يستغرق وقتا أطول من حوالي 1 دقيقة، كما تمنع فترات أطول تتبع الخلايا المهاجرة بسرعة. اعتمادا على النوع (ه) من الخلايا التي يجري تصويرها، قد تحتاج إلى تعديل للسماح لتتبع خلية السليم بواسطة برنامج تحليل هذه الفترة. وينبغي أن يكون-شرائح Z لا يزيد عن 5 ميكرون. عموما 15-18 Z-شرائح بين 2-5 ميكرون سميكة مناسبة لفترة التصوير 1 دقيقة.
  3. التقاط قبل الأجسام المضادة صورة مرور الزمن
    1. القبض على 5 دقائق صورة الوقت الفاصل بين المنطقة لتقييم استقرار النسيج من خلال تحديد عدد يكرر إلى "5" في إعداد اكتساب: نافذة TimeScan والنقر على زر "مسح".
      ملاحظة: الأنسجة "الانجراف" يمكن أن يكون سببها عدم إتاحة الوقت الكافي للأذن للوصول إلى التوازن الحراري، وسوء إعداد الأذن، أو يمكن أن تكون بسبب الانجراف المحلي في منطقة واحدة من الأذن. إذا كانت الصورة 5 دقائق ليست مستقرة، صورة منطقة جديدة في الأدمة. إذا كان الصورة الثانية في منطقة جديدة لا تزال غير مستقرة، فمن الأفضل أن يكرر بعناية إعداد الأذن والتصوير من الخطوة 3.6 مع COV جديدةerslip.
    2. إذا كان النسيج مستقرة في الصورة 5 دقائق، جمع 30-45 دقيقة صورة مرور الزمن من خلال تحديد عدد يكرر ما بين 30 و 45 في إعداد اكتساب: نافذة TimeScan والرصد لأي انحراف الأنسجة طفيفة كما كانت الصورة التي تم جمعها. حفظ الملف في تنسيق متوافق مع برامج التحليل لاستخدامها.
      ملاحظة: عند هذه النقطة في البروتوكول، على بعد خطوات 4.2.2 - 4.3.2 يمكن أن تتكرر في صورة مواقع متعددة في نفس الأذن. فأر واحد لا ينبغي أن تبقى تخدير لمدة أطول من 4 ساعات، كما من المرجح أن تحدث الوفاة.
  4. حقن الأجسام المضادة الحجب والتقاط صورة بعد الأجسام المضادة.
    1. رسم الخليط الضد إلى حقنة السل 1 مل وإزالة الإبرة، مع التأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء. اضغط على المكبس بحيث يشكل الحل الضد من "قطرة" في نهاية الحقنة.
    2. رفع الستائر حول المرحلة وتحديد القسطرة. إزالة الأصلي برنامج تلفزيوني حساب المشتركحقنة ining من القسطرة. دون وضع القسطرة أسفل، ونعلق بعناية حقنة جديدة تحتوي على الأجسام المضادة. عقد نهاية القسطرة على حقنة وحقن ببطء الخليط الضد إلى القسطرة. ضمان عدم وجود مقاومة لحقن.
    3. تعيين قسطرة أسفل وخفض الستائر المحيطة المسرح المجهر. ملاحظة وقت الحقن والبدء فورا في جمع من 20-40 دقيقة تسلسل التصوير الجديد في نفس الموقع باستخدام إعدادات أداة نفس الصورة قبل الأجسام المضادة. حفظ الملف في شكل مناسب لبرامج التحليل لاستخدامها.
      ملاحظة: بين الوقت الفاصل بين الصور، ومراقبة الماوس للتخدير والتنفس كافية. لا ينصح للصورة أكثر من حقل واحد بعد إدارة الأجسام المضادة، كما يمكن أن يكون هناك بنسب متفاوتة من إزالة الأجسام المضادة.
  5. حقن ديكستران fluorescently المسمى لتحديد الأوعية الدموية، وتقييم قسطرة المباح، وقياس بنفاذية الأوعية lood
    1. إعداد محلول / مل 2 ملغ من ديكستران fluorescently، مترافق (70000 ميغاواط) في 100 ميكرولتر العقيمة برنامج تلفزيوني ويوجه إلى حقنة، وإزالة أي فقاعات الهواء.
    2. باستخدام نفس الأسلوب كما في الخطوة 4.4.1-4.4.2، وضع الحقنة على القسطرة وحقن محلول ديكستران عن طريق الوريد.
    3. القبض على كومة واحدة في 1024 x 1024 بكسل القرار عن طريق تغيير هذا القرار في إعداد اكتساب: نافذة الوضع، مع نفس الإعدادات PMT والليزر أما الوقت الفاصل بين الصور. لجمع صورة، قم بإلغاء تحديد زر "تايم" تحت زر "مسح"، ثم النقر على زر "مسح". وهذه صورة 3D يسمح لاستبعاد الخلايا T الموجود في الأوعية الدموية وتبين أن القسطرة كانت براءات الاختراع وإدراجها بشكل صحيح. نشر ديكستران الفلورسنت من السفن يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم نفاذية الأوعية الدموية المحلية.
      ملاحظة: هذا عالية الدقة (1024 x 1024) صورة ثابتة يستخدم لالعلاقات العامةأغراض esentation ويمكن بالإضافة إلى ذلك يمكن استخدامها لتحليل بنية الأنسجة في نفس المنطقة الوقت الفاصل بين الصور. بدلا من ذلك، 512 × 512 صورة يمكن اتخاذها، والتي يمكن دمجها مع الوقت الفاصل بين الصور باستخدام برمجيات تحليل الصور. ويمكن أيضا أن المطلوب الفاصل الزمني التصوير من إدارة ديكستران، وهذا يتوقف على الاحتياجات البحثية من مختبرات الفردية. في هذه الحالة، يجب أن يتم تعيين الصور تصل كما في الخطوات 4.2.3-4.3.2.
  6. بعد الانتهاء من التصوير، وإزالة بعناية الماوس من تحت هدف وبسط بطانية المياه. إزالة ساترة من منصة التصوير عن طريق قطع الشريط بلطف ورفع الزجاج حتى يفصل. في حين لا يزال تخدير الماوس، فصل الأذن من ساترة. إذا كان هذا هو أن يكون الإجراء محطة، الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. إذا إنقاذ هذا الفأر للتصوير المتكررة، إعادته إلى قفص نظيف فصل من الفئران الأخرى، ونلاحظ حتى الماوس يمكن أن حق حد ذاتها، ولاالعيادات الخارجية. مرة واحدة تعافى من التخدير، والماوس يمكن أن تعاد إلى قفص مع غيرها من الحيوانات.
  7. استيراد ملفات التصوير في برنامج تحليل الصور وإجراء أية تصحيحات المطلوبة. ويوصى بتجنب التحسينات غير الخطية وبرامج الحد من تجانس أو الضوضاء الآلي والخوارزميات. عادة، صور تحتاج فقط لتصحيح خلفية طفيفة عن طريق زيادة النقطة السوداء في الصورة يدويا قبل التحليل. تحليل البيانات التصوير باستخدام برنامج خلية تتبع الآلي مع التصحيح اليدوي، كما هو الحال في Overstreet، Gaylo وآخرون 30.
    ملاحظة: هناك العديد من الأجنحة تحليل الصور المتاحة، سواء مصدر الملكية والمفتوحة، والتي يمكن استخدامها لقياس ديناميكية خلية من الصور multiphoton المستمدة من هذا البروتوكول. طريقة الدقيق للتحليل الصور وحزم البرمجيات المثلى لاستخدامها يتوقف على الاحتياجات البحثية من مختبرات الفردية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على دراسة الاستجابات المناعية في الموقع دون تغيير البيئة المناعة أمر ضروري في دراسة التفاعلات في الوقت الحقيقي من الخلايا التائية المستجيب مع الأنسجة الملتهبة. التصوير من الأدمة الأذن سليمة من هذا البروتوكول، والموضحة في الشكل 1A و B، يسمح التصور من نقل الخلايا التائية المستجيب fluorescently المسمى في الخلالي عن طريق الجلد. هذا يسمح كلا عالية الدقة (الشكل 1C)، والوقت الفاصل بين

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أهمية

هنا نقدم بروتوكول كامل لتصور 4D من نقلها، مستضد معين المستجيب خلايا TH1 في الأدمة الماوس الأذن سليمة. وهذه الطريقة توفر المزايا على بعض طرائق التصوير الحالية لعدة أسباب. عن طريق التصوير الأدمة الأذن بطني، ونحن قادرون على التخلي عن إزالة الشعر ما هو مطلوب لبروتوكولات التصوير التي تنطوي على مواقع الجلدية الأخرى. على الرغم من مزيلات الشعر خفيفة عموما، وقد تبين لهم أن يسبب تعطل حاجز الجلد 42،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر جامعة روتشستر منشأة Multiphoton مجهر الأساسية للمساعدة في التصوير الحي. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة AI072690 وAI02851 إلى DJF. AI114036 لAG وAI089079 لMGO.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

تم تربية الجسم تقنيات CFSE Life الدقيقة للموظفين شريط طبي الأيزوفلوران التصوير أغطية شحم متعدد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفئران BALB / cJackson Laboratories000651الفئران المستخدمة في المنزل
DO11.10 الفئرانمختبرات جاكسون003303الفئران المستخدمة تم تربيتها في المنزل
HBSSFisher10-013-CVمصل
عجل حديثي الولادة متعدد المكافئ (NCS)Thermo / HyCloneSH30118.03الحرارة معطلة عند 56 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقة
خنزير غينيا مكملCedarlaneCL-5000
الجسم المضاد المضاد ل CD8ATCC3.155 (ATCC TIB-211)الأجسام المضادة المشتقة من  هذا الورم الهجين
المضاد لمعقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانيةATCCM5 / 114.15.2 (ATCC TIB-120)الأجسام المضادة المشتقة من  هذا
المضاد للورم الهجين المضاد ل CD24ATCCJ11d.2 (ATCC TIB-183)الأجسام المضادة المشتقة من  هذا الورم الهجين
المضاد للجسم المضاد Thy1.2ATCCJ1j.10 (ATCC TIB-184)الأجسام المضادة المشتقة من   هذا الورم الهجين
Ficoll (Fico / Lite-LM)Atlanta BiologicalsI40650
PBSFisher21-040-CVمتعدد المكافئ
EDTAفيشر15323591
جسم مضاد مضاد للبيوتينيل CD62L (استنساخ MEL-14)BD553149
حبات الفصل المغناطيسي ستربتافيدينMiltenyi130-048-101
MACS LS عمود الفصلMiltenyi130-042-401
مؤتلف بشري IL-2Peprotech200-02
ماوس مؤتلف IL-4Peprotech214-14
ماوس مؤتلف IL-12Peprotech210-12
الأجسام المضادة ل IFNg (استنساخ XMG 1.2)eBioscience16-7311-85
الجسم المضاد ل IL-4 (استنساخ 11b11)eBioscience16-7041-85
RPMIVWR45000-412
البنسلين / الستربتومايسينفيشر15303641
L-glutamineFisher15323671
2-mercaptoethanolBio-Rad161-0710
ببتيد أولبومينبيوببتيدISQAVHAAHAEINEAGR-OH الببتيد
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)Thermo / HyCloneSV30014.03تعطيل الحرارة عند 56 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقة
لوحة ثقافة 24 بئرLPS3526المكافئة
المتعددة C34554
CMTMRLife TechnologiesC2927
28 G1 / 2 محاقن الأنسولين ، 1 ملBD329420
28 G1 / 2 محاقن الأنسولين ، 300 & mu ؛ لBD309301
27 G1 / 2 TB محاقن ، 1 ملBD309623
30 G1 / 2 إبرBD305106
PE-10 أنابيب طبيةBD427400
مادة لاصقة بيطرية سيانواكريليت (Vetbond)3M1469SB
لوحة تسخينWPI61830
وحدة تحكم لوحة التسخينWPIATC-2000
وحدة تحكم بطانية المياهGaymarTP500لم يعد قيد الإنتاج ، بطانية مياه متوفرة أحدث مكافئة
Kent ScientificTP3E
Isoflurane مبخرLEI MedicalIsotec 4لم يعد قيد الإنتاج ، مكافئ أحدث متاح
isofluraneHenry Scheinتم طلبه من خلال الطب البيطري
أنابيب الطرد المركزيVWR20170-038مكافئ متعدد
3M1538-0
مخروطمدمج في المنزل ، انظر الشكل 2
منصةالمدمجة في المنزل ، انظر الشكل 2
ملقط منحنيWPI15915-G
مقصمكافئ متعددRobozRS-6802زجاجية مكافئة
متعددة VWRمكافئ
عاليالفراغ فيشر146355D
مسحات قطنية مناديلمهمة حساسة متعددة مكافئة
فيشر34155مجهر مستقيم متعدد المكافئ
أوليمبوس فلوفيو 1000 AOM-MPM مع أطياف الفيزياء MaiTai HP DeepSee Ti: Sa laserOlympusدعوة لعرض أسعار
جدول بصري مع التحكم في الاهتزازنيوبورتمكالمة للحصول على عرض أسعار
25x NA 1.05 هدف الغمر في الماء للتصوير متعدد الفوتونأوليمبوسXLPLN25XWMP2
سخان موضوعيBioptechsPN 150815
مكعب مرشح الكشفأوليمبوسFV10-MRVGR / XRمكعب مملوك ، يمكن تقريبه من المرشحات الفردية / ثنائي اللون
المضادة للإنتجرين وبيتا ؛ 1 جسم مضاد (استنساخ hMb1-1)eBioscience16-0291-85خالي من Azide ، منخفض السموم
الداخلية مضاد للإنتجرين & بيتا ؛ 3 أجسام مضادة (استنساخ 2C9. G3)eBioscience16-0611-82خالي من السموم الداخلية من أزيد ، منخفض
السموم الداخلية تكساس ريد ديكستران (70،000 ميجاوات) LifeTechnologiesD-1830

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
  2. Gehad, A., et al. Differing requirements for CCR4, E-selectin, and alpha4beta1 for the migration of memory CD4 and activated T cells to dermal inflammation. Journal of immunology. 189 (1), 337-346 (2012).
  3. Park, E. J., et al. Distinct roles for LFA-1 affinity regulation during T-cell adhesion, diapedesis, and interstitial migration in lymph nodes. Blood. 115 (8), 1572-1581 (2010).
  4. Masopust, D., Schenkel, J. M. The integration of T cell migration, differentiation and function. Nature reviews. Immunology. 13 (5), 309-320 (2013).
  5. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  6. Schon, M. P., Ludwig, R. J. Lymphocyte trafficking to inflamed skin--molecular mechanisms and implications for therapeutic target molecules. Expert opinion on therapeutic targets. 9 (2), 225-243 (2005).
  7. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  8. Friedl, P., Entschladen, F., Conrad, C., Niggemann, B., Zanker, K. S. CD4+ T lymphocytes migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1 integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and locomotion. European journal of immunology. 28 (8), 2331-2343 (1998).
  9. Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102 (9), 3262-3269 (2003).
  10. Lammermann, T., et al. Cdc42-dependent leading edge coordination is essential for interstitial dendritic cell migration. Blood. 113 (23), 5703-5710 (2009).
  11. Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nature immunology. 11 (10), 953-961 (2010).
  12. Jacobelli, J., Bennett, F. C., Pandurangi, P., Tooley, A. J., Krummel, M. F. Myosin-IIA and ICAM-1 regulate the interchange between two distinct modes of T cell migration. Journal of immunology. 182 (4), 2041-2050 (2009).
  13. von Andrian, U. H. Immunology. T cell activation in six dimensions. Science. 296 (5574), 1815-1817 (2002).
  14. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296 (5574), 1876-1880 (2002).
  15. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  16. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2604-2609 (2003).
  18. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
  19. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  20. Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nature immunology. 4 (6), 579-585 (2003).
  21. Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 282-291 (2008).
  22. Bajenoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
  23. Kawakami, N., Flugel, A. Knocking at the brain's door: intravital two-photon imaging of autoreactive T cell interactions with CNS structures. Seminars in immunopathology. 32 (3), 275-287 (2010).
  24. Wilson, E. H., et al. Behavior of parasite-specific effector CD8+ T cells in the brain and visualization of a kinesis-associated system of reticular fibers. Immunity. 30 (2), 300-311 (2009).
  25. Schaeffer, M., et al. Dynamic imaging of T cell-parasite interactions in the brains of mice chronically infected with Toxoplasma gondii. Journal of immunology. 182 (10), 6379-6393 (2009).
  26. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  27. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  28. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nature medicine. 17 (6), 744-749 (2011).
  29. Matheu, M. P., et al. Imaging of effector memory T cells during a delayed-type hypersensitivity reaction and suppression by Kv1.3 channel block. Immunity. 29 (4), 602-614 (2008).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
  32. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  33. Teijeira, A., et al. Lymphatic endothelium forms integrin-engaging 3D structures during DC transit across inflamed lymphatic vessels. The Journal of investigative dermatology. 133 (9), 2276-2285 (2013).
  34. Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I., Cahalan, M. D. Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8334-8339 (2010).
  35. Gray, E. E., Suzuki, K., Cyster, J. G. Cutting edge: Identification of a motile IL-17-producing gammadelta T cell population in the dermis. Journal of immunology. 186 (11), 6091-6095 (2011).
  36. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  37. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of investigative dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  38. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PloS one. 8 (2), 57135(2013).
  39. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  40. Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477 (7363), 216-219 (2011).
  41. Tozer, G. M., et al. Intravital imaging of tumour vascular networks using multi-photon fluorescence microscopy. Advanced drug delivery reviews. 57 (1), 135-152 (2005).
  42. Lee, J. N., et al. The effects of depilatory agents as penetration enhancers on human stratum corneum structures. The Journal of investigative dermatology. 128 (9), 2240-2247 (2008).
  43. Brandt, E. B., Sivaprasad, U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis. Journal of clinical & cellular immunology. 2 (3), (2011).
  44. Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. European journal of immunology. 34 (8), 2100-2109 (2004).
  45. Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular research. 19 (3), 374-379 (1980).
  46. Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. The Journal of investigative dermatology. 135 (1), 84-93 (2015).
  47. Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plastic and reconstructive surgery. 83 (6), 948-959 (1989).
  48. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5307-5312 (2014).
  49. Stetson, D. B., et al. Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. The Journal of experimental medicine. 198 (7), 1069-1076 (2003).
  50. Mohrs, M., Shinkai, K., Mohrs, K., Locksley, R. M. Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15 (2), 303-311 (2001).
  51. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  52. Cummings, R. J., Mitra, S., Lord, E. M., Foster, T. H. Antibody-labeled fluorescence imaging of dendritic cell populations in vivo. Journal of biomedical optics. 13 (4), 044041(2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة