مقالة منهجية

توليد "أنسنة" ذبابة الفاكهة S2 خط خلية حساسة للالدوائية تثبيط كينيسين-5

DOI:

10.3791/53594

⸱

يناير 20, 2016

 , 
1Molecular and Cellular Biology Graduate Group, Biology Department, University of Massachusetts, Amherst

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء خط خلية ذبابة الفاكهة S2 حساس لمثبطات الجزيئات الصغيرة ل kinesin-5. كما تم توضيح استخدام هذه الخلايا في مقايسة تصحيح الأخطاء المستندة إلى الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinetochores هي هياكل كبيرة قائمة على البروتين تتجمع على السنتروميرات أثناء انقسام الخلية وتربط الكروموسومات بالأنابيب الدقيقة المغزل. يتطلب التوزيع الصحيح للمادة الوراثية أن تصبح الحركية الشقيقة على كل كروموسوم ثنائية الاتجاه عن طريق الارتباط بالأنابيب الدقيقة من أقطاب المغزل المتقابلة قبل التقدم إلى الطور. ومع ذلك ، فإن حالات التعلق الخاطئة وغير ثنائية الاتجاه شائعة وتوجد مسارات خلوية لاكتشاف وتصحيح مثل هذه المرفقات أثناء انقسام الخلية. يشار إلى العملية التي يتم من خلالها زعزعة استقرار التفاعلات الحركية والأنابيب الدقيقة غير الصحيحة باسم تصحيح الخطأ. لدراسة تصحيح الخطأ في الخلايا الحية ، يتم إنشاء المرفقات غير الصحيحة عن قصد عن طريق التثبيط الكيميائي لمحرك كينيسين -5 ، مما يؤدي إلى تجميع المغزل أحادي القطب ، ويلاحظ الانتقال من سوء الاتجاه إلى ثنائي الاتجاه بعد غسل المخدرات. يشكل العدد الكبير من الكروموسومات في العديد من أنواع خلايا زراعة الأنسجة النموذجية تحديا في مراقبة أحداث تصحيح الخطأ الفردية. ذبابة الفاكهة تعتبر خلايا S2 موضوعات أفضل لمثل هذه الدراسات لأنها تمتلك ما لا يقل عن 4 أزواج من الكروموسومات. ومع ذلك ، فإن مثبطات كينيسين 5 الجزيئية الصغيرة غير فعالة ضد ذبابة الفاكهة كينيسين -5 (Klp61F). نصف هنا كيفية بناء خط خلية ذبابة الفاكهة الذي يستبدل بشكل فعال Klp61F بكينيسين 5 البشري ، مما يجعل الخلايا حساسة للتثبيط الدوائي للمحرك ومناسبة للاستخدام في مقايسة تصحيح الخطأ القائم على الخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفصل المتساوي للجينوم خلال انقسام الخلايا يتطلب التفاعل الصحيح بين الحمض النووي والمغزل الأنابيب الدقيقة منسوخة. الأنابيب الدقيقة التفاعل بأنفسهم مع الكروموسومات من خلال مجموعة متكاملة من البروتينات التي تجمع في القسيم المعروفة باسم الحيز الحركي 1. التوزيع الصحيح للكروموزومات يتطلب أن kinetochores الشقيقة وbioriented، التي يرتبط كل أخت مع الأنابيب الدقيقة النابعة من أقطاب المغزل المعاكس. الحيز الحركي أنيبيب (MT كيلوطن) المرفقات التي ليست في التشكل bioriented يتم بسرعة وكفاءة زعزعة استقرار لإتاحة الفرصة لإقامة biorientation في عملية تعرف باسم تصحيح الخطأ. مقايسة تصحيح الخطأ الذي أنشئ في السابق خلايا الثدييات 5 يتطلب تجميع مغزل أحادي باستخدام مثبطات جزيء صغير عكسها ضد Eg5 (كينيسين-5). العلاج من تعاطي المخدرات يولد العديد من المرفقات syntelic الخاطئة التي بوتkinetochores ح شقيقة نعلق على نفس القطب المغزل. وفشل لاحق من هذا الدواء يسمح لرؤية عملية تصحيح الخطأ. ويمكن أن يتم فحص تصحيح الخطأ في وجود مثبطات جزيء صغير أو knockdowns لدراسة مساهمة البروتينات مرشح لتصحيح الخاطئة إرفاق ملفات KT-MT.

القدرة على تصور تصحيح الخطأ في الخلايا الحية هي أداة قوية لمزيد من فهم الآلية الجزيئية تشارك في هذه العملية المعقدة. ومع ذلك، فإن عددا كبيرا من الكروموسومات الموجودة في معظم خطوط الخلايا يشكل تحديا في مراقبة الفردية إرفاق ملفات KT-MT. فإن خلايا ذبابة الفاكهة S2 يكون مثاليا لتطبيق فحص تصحيح الخطأ لأنها تحتوي على عدد قليل من 4 الكروموزومات 6، ولكن مثبطات جزيء صغير من كينيسين 5 مثل S-trityl-L-السيستين (STLC) وmonastrol 7-9 لا تؤثر التجمع المغزل أو كينيسين-5 وظيفة الحركة في خلايا ذبابة الفاكهة. وبالتالي فإننا أجناستيد خط خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن كينيسين-5 البشري تحت المروج محرض التي تعتبر حساسة لكينيسين-5 مثبطات. يصف هذا البروتوكول كيفية ضربة قاضية للالذاتية ذبابة الفاكهة كينيسين-5 نديد، Klp61F، واستخدام هذا الخط خلية في خلية القاعدة تصحيح الخطأ الفحص.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلايا Transfecting S2

  1. من مثقف سابقا 25 سم 2 قارورة، إضافة α معربا عن تويولين-GFP الخلايا S2 10 إلى الحجم النهائي من 2 مل ب 100٪ confluency، والسماح لهم شبه التمسك الجزء السفلي من 35 ملم صحن زراعة الأنسجة ل حوالي 1 ساعة.
  2. إزالة وسائل الإعلام من الطبق. Transfect 2 ميكروغرام من Eg5-mCherry بناء 11 مع 1 مل من وسائل الإعلام شنايدر تستكمل مع 10٪ FBS (المشار إليها فيما يلي باسم سائل الإعلام شنايدر) وترنسفكأيشن الكاشف، بعد بروتوكول الشركة المصنعة. ختم الطبق مع parafilm واحتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
  3. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام شنايدر. عودة الخلايا إلى 25 درجة مئوية الحاضنة.
  4. في يوم 3 بعد ترنسفكأيشن، ونقل 500 ميكرولتر من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى الجديد 35 مم طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1.5 مل من وسائل الإعلام شنايدر لتحريض الاختبار. حمل تعبيرا عن Eg5-mCherry بإضافة كبريتات النحاس 4 إلى تركيز النهائي من 500 ميكرومتر. ختم طبق في Parafilm واحتضان عند 25 درجة CO / N.
  5. لجعل كونكانافالين coverslips المغلفة A، ماصة حجم ما يكفي من كونكانافالين حلا (0.5 ملغ / مل المنحل في H 2 O) إلى معطف حمض غسلها ساترة، وإزالة الزائدة، والسماح للساترة للهواء الجاف.
  6. وضع 22 ملم × 22 ملم كونكانافالين المغلفة ساترة في نظيفة 35 مم طبق زراعة الأنسجة، ثم البذور 500 ميكرولتر في 100٪ confluency من الخلايا التي يسببها على ساترة والسماح للخلايا الالتزام لمدة 1 ساعة على RT.
  7. للتحقق من Eg5-mCherry التعبير والتجمع ساترة إلى غرفة تعالى (أو وعاء التصوير المناسبة) مع وسائل الإعلام للتصوير في RT على المجهر مضان. استخدام مصادر الضوء المناسبة ومجموعات مرشح لتصور الخلايا. على سبيل المثال، والاداة المستخدمة في هذه الدراسة لديه مصدر الضوء الأبيض الصمام وEGFP (FITC / Cy2) وDSRed (TRITC / CY3) مكعبات التصفية. Eg5-mCherry يموضع إلى الأنابيب الدقيقة وغير المخصب وكالة الطاقة النوويةأقطاب ص المغزل.
  8. بعد التأكد من أن الخلايا التعبير عن كل Eg5-mCherry وGFP-α تويولين، ونقل ما تبقى من transfected الخلايا uninduced إلى 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة التي تحتوي على 4 مل من وسائل الإعلام شنايدر.
  9. إضافة Blasticidin S HCL في تركيز النهائي من 25 ميكروغرام / مل إلى قارورة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل ومواصلة تقسيم في ظل وجود 25 ميكروغرام / مل Blasticidin S حمض الهيدروكلوريك حتى يتوقف موت الخلايا ويجري التأكد من تحقق للتعبير عن Eg5-mCherry بشكل دوري. احتضان خطوط الخلايا في 25 ° C الحاضنة.
    ملاحظة: نسبة الخلايا معربا عن زيادات Eg5-mCherry مع مرور الوقت.
  10. مرة واحدة و transfected الخلايا مستقر، والاستمرار في تقسيم في غياب المخدرات وتجميد 12 الخلايا لاستخدامها في المستقبل.

2. RNA التدخل

  1. PCR تضخيم المنطقة BP ~ 500 من Klp61F من كدنا] (LD15641) باستخدام التمهيدي مع إضافة تسلسل T7 المروج (التسلسل الموضح في قائمة المواد) أن يكونتستخدم كنموذج لالرنا المزدوج الجديلة التوليف.
    1. تشكيل أربع لردود الفعل PCR، 50 ميكرولتر لكل منهما، تحتوي على 100 نانوغرام من الحمض النووي القالب، 25 ميكرومتر لكل التمهيدي، العازلة المناسبة، والبلمرة. ضبط بروتوكول PCR على thermocycler وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للالبلمرة في ل.
    2. تجمع ونظيفة أربعة تفاعلات PCR باستخدام PCR تنظيف عدة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تخزين قالب نظيفة في -20 ° C.
  2. إعداد مزدوج RNA (الرنا المزدوج الجديلة) الذين تقطعت بهم السبل من قالب باستخدام النسخ عدة T7 RNA، بعد تعليمات الشركة الصانعة. نتوقع ~ تركيز 5-15 ملغ / مل من الرنا المزدوج الجديلة. تخزين الرنا المزدوج الجديلة في -20 ° C.
  3. لضربة قاضية Klp61F مع الرنا المزدوج الجديلة، تسمح للخلايا S2 معربا عن Eg5-mCherry بنسبة 25٪ confluency إلى شبه الانضمام إلى الجزء السفلي من 35 ملم الأنسجة صحن الثقافة لمدة 1 ساعة.
  4. إزالة وسائل الإعلام من الأطباق وإضافة 5 ميكروغرام من الرنا المزدوج الجديلة ضد Klp61F (ذبابة الفاكهة كينيسين-5) المخفف في 1 مل من مصل خالية شنايدر "الصورة سائل الإعلام.
  5. في احتضان RT لمدة 1 ساعة، ثم يضاف 1 مل من وسائل الإعلام شنايدر مع 10٪ FBS. احتضان الخلايا عند 25 ° C.
  6. 24 ساعة بعد العلاج الرنا المزدوج الجديلة، لحث على التعبير عن Eg5-mCherry بإضافة كبريتات النحاس 4 إلى تركيز النهائي من 500 ميكرومتر. احتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أخرى.

3. يعيش التصوير خلية

  1. وضع 22 ملم × 22 ملم كونكانافالين ساترة المغلفة في نظيفة 35 مم طبق زراعة الأنسجة.
  2. البذور 500 ميكرولتر من الخلايا التي تم التعامل مع الرنا المزدوج الجديلة والتي يسببها O / N على كونكانافالين ساترة المغلفة، وتمكينهم من الانضمام لمدة 1 ساعة.
  3. تجميع ساترة إلى غرفة تعالى (أو وعاء المناسبة) للتصوير.
  4. البحث عن الخلايا الإنقسامية التعبير عن كل Eg5-mCherry وGFP-α تويولين.
    ملاحظة: خلايا الميتوزى يعبر فقط GFP-α تويولين ينبغي أن يكون محور دوران أحادي منذ Klp61F، وهو مطلوب للقطبين المغزل، وترسيتها 10،13.
  5. جمع الوقت الفاصل بين الصور من مغزل القطبين (على سبيل المثال، 1 الإطار في الدقيقة الواحدة) في الخلايا التعبير عن كل Eg5-mCherry وGFP-α تويولين.
  6. بينما التصوير، وإزالة وسائل الإعلام من غرفة ردة، واستبدالها مع وسائل الإعلام شنايدر تحتوي على 1 ميكرومتر STLC أكثر من 3 التبادلات الاعلامية متتالية (~ 5 مل الكل) في غرفة لتصور انهيار المغزل.
  7. لتبييض المخدرات وعكس انهيار المغزل، وإزالة بعناية وسائل الإعلام التي تحتوي على STLC من غرفة ردة، ويغسل في وسائل الإعلام شنايدر 4X (المجموع 6-8 مل) قبل إعادة تعبئة غرفة ردة للمرة الأخيرة مع وسائل الإعلام الجديدة. مواصلة التصوير.

4. تصحيح الخطأ الفحص

  1. وضع 22 ملم × 22 ملم كونكانافالين A coverslips المغلفة إلى 35 ملم أطباق زراعة الأنسجة نظيفة.
  2. البذور 500 ميكرولتر من الخلايا التي تم التعامل مع Klp61F الرنا المزدوج الجديلة على كونكانافالين ساترة المغلفة، والسماح لهم التمسك بها.
  3. بعد الخلايا هي adherالطبعه، إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام شنايدر إلى كل طبق لجلب الحجم النهائي لتصل إلى 2 مل.
  4. إلقاء القبض على الخلايا في الانقسام، إضافة MG132 إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى كل من الأطباق، واحتضان لمدة 1 ساعة.
  5. إضافة 1 ميكرومتر STLC واحتضان لمدة 1 ساعة للسماح لتشكيل القطب.
  6. تغسل STLC قبل الشطف coverslips 3X مع 2 مل من وسائل الإعلام شنايدر جديدة في كل مرة.
  7. احتضان coverslips مع وسائل الإعلام شنايدر بالإضافة إلى أية عقاقير الدوائية (على سبيل المثال، أورورا كيناز مثبطات) أو DMSO كعنصر تحكم.
    ملاحظة: تركيزات مثبط تختلف ويجب تحديد تركيزات النهائي المناسبة من قبل المجرب. مصنوعة حلول الأسهم عادة مثل هذا أن المانع هو تمييع 1: 1000 في وسائل الإعلام. في هذه الحالة 1: 1000 تخفيف من DMSO (أو مذيب مناسب) بمثابة السيطرة على السيارة. نستخدم أورورا B المانع Binucleine 2 بتركيز نهائي 40 ميكرومتر.
  8. إصلاح الخلايا في مختلف نقاط زمنية رس مراقبة تطور تكوين المغزل بين القطبين وتقييم الدول مرفق الحيز الحركي. لإصلاح:
    1. شطف بسرعة لل coverslips مع 2 مل من 1X BRB-80.
    2. إصلاح الخلايا بإضافة 2 مل من 10٪ امتصاص العرق مخففة في 1X BRB-80 لمدة 10 دقيقة. الماصة لامتصاص العرق بعناية في غطاء الكيميائية.
    3. Permeabilize الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X + 1٪ تريتون-X لمدة 8 دقائق.
    4. غسل الشرائح 3X مع 2 مل من 1X PBS + 0.1٪ تريتون-X.
    5. نقل coverslips جانب خلية تواجه حتى على ورقة من parafilm (استخدام علامة لتسمية Parafilm مناسب لتتبع الشرائح) في 150 مم طبق بتري.
    6. تغطية لل coverslips مع 150 ميكرولتر المغلي المصل حمار (BDS)، واحتضان في RT لمدة 1 ساعة لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة.
      ملاحظة: وهنا، يمكن إيقاف بروتوكول تثبيت أن يستمر في مرحلة لاحقة. ويمكن تخزين Coverslips في غرفة الرطوبة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. لجعل الغرفة الرطوبة، خط حافة طبق 150 ملممع مختبر الرطب يمسح، وتغطي مع غطاء صحن بيتري.
    7. إزالة كتلة، ولاحتضان coverslips لمدة 1 ساعة على RT مع 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة بشكل مناسب في BDS إلى وصمة عار لkinetochores والأنابيب الدقيقة لتركيزات النهائي من 2 ميكروغرام / مل (أو وفقا لتوصيات الشركة الصانعة) و1 ميكروغرام / مل على التوالي .
      ملاحظة: وهنا، يمكن إيقاف بروتوكول تثبيت أن يستمر في مرحلة لاحقة. ويمكن تخزين Coverslips في غرفة الرطوبة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
    8. غسل coverslips بقوة 3x مع 500 ميكرولتر من 1X PBS + 0.1٪ تريتون-X.
    9. احتضان coverslips لمدة 30-60 دقيقة في RT مع الأجسام المضادة الثانوية fluorophore مترافق المناسبة المخفف في BDS.
    10. غسل coverslips بقوة 3x مع 500 ميكرولتر من 1X PBS + 0.1٪ تريتون-X.
    11. احتضان coverslips مع 150 ميكرولتر من BDS التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل دابي التركيز النهائي لمدة 5 دقائق.
    12. غسل coverslips 2X مع برنامج تلفزيوني 1X + 0.1٪ تريتون-X، وجبل جoverslips الجانب الخلية أسفل على "الشريحة 3X1 مع 8 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام. طلاء زوايا بطلاء الأظافر لشل لل coverslips على الشرائح.
  9. خلايا صورة مع مغزل القطبين التي يتم التعبير عن Eg5-mCherry. اتخاذ سلسلة Z يتألف من 30 طائرة في 0.2 ميكرون فترات في جميع القنوات باستخدام الهدف 100X. تحليل دقيق للkinetochores والأنابيب الدقيقة لتحديد الدول المرفق (bioriented أو المرفقات syntelic).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مطلوب Klp61F لتشكيل مغزل القطبين. كينيسين-5 البشري، Eg5، يمكن إنقاذ وظيفة Klp61F في خلايا ذبابة الفاكهة S2 (الشكل 1A و D). على إضافة المانع كينيسين-5 (STLC)، ومستويات المرتبط أنيبيب من الانخفاض محرك (1B الشكل وE)، وانهيارات المغزل، مما أدى إلى احتكار (الشكل 1C وF) في الخلايا التي تفتقر الذاتية Klp61F على رني الناجح (فيلم التكميلي 1). ومن الجدير بالذكر أن مغزل القطبين تنهار على إضافة STLC في الخلايا S2 أنسنة لكينيسين-5 النشاط غير مطلوب للحفاظ على الثنائية القطبية المغزل في الخلايا البشرية. قد يكون هذا التناقض المثير للاهتمام نتيجة للاختلافات في تداخل بين القطبين أنيبيب و / أو الاستقرار في النظم نموذج اثنين 14. كينيسين-5 تثبيط (الشكل 2A وE) يمكن ريف rsed عن طريق الغسيل من المخدرات والتعافي من المغزل القطبين يمكن اتباعها مع مرور الوقت. على إزالة المانع (الشكل 2B وF)، وإعادة الزميلة-Eg5-mCherry مع ميكروتثبول بمثابة تجميع المغزل القطبين (الشكل 2C وG)، وخلايا يمكن أن تتطور إلى طور الصعود ثنائي القطب (الشكل 2D و H، فيلم التكميلي 2 ).

figure-results-1
الشكل 1. إضافة 1 ميكرومتر STLC يؤدي إلى مغزل أحادي في خلايا ذبابة الفاكهة S2. صور الممثل من الوقت الفاصل بين التصوير من خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن Eg5-mCherry (AC) وGFP-α تويولين (DF) خلال إضافة 1 ميكرومتر STLC. وأضاف Eg5 المانع في 3 دقائق. مقياس شريط = 5 ميكرون. الطابع الزمني = دقيقة: ثانية. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. الإصلاحات المغزل بين القطبين على إزالة STLC. صور الممثل من الوقت الفاصل بين التصوير من خلية ذبابة الفاكهة 2 معربا عن Eg5-mCherry (AD) وGFP-α تويولين (EH) خلال تجربة STLC فشل. وجرفت STLC بها في 5 دقائق. A الإصلاحات المغزل القطبين في حدود 1 ساعة من إزالة STLC. مقياس شريط = 5 ميكرون. الطابع الزمني: الحد الأدنى: ثانية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "الهدف =" _ فارغة "> الفيلم التكميلي 1. (انقر بزر الماوس للتحميل). Widefield التصوير مضان من مثال ممثل خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن Eg5-mCherry ( اليسار) وGFP-α تويولين (يمين). وأضيف 1 ميكرومتر STLC في 2 دقيقة، وأشكال المغزل احتكار في غضون 10 دقيقة بعد إضافة المانع. تم الحصول على الصور كل 1 دقيقة ولعب بمعدل 10 لقطة في الثانية مقياس بار = 5 ميكرون.

figure-results-4
الفيلم التكميلي 2. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). التصوير Widefield مضان مثالا نموذجيا للخلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن Eg5-mCherry (يسار) وGFP-α تويولين (يمين). تمت إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على 1 ميكرومتر STLC وتشطف في 5 دقائق. A الإصلاحات المغزل القطبين في حدود 1 ساعة لإزالة المانع. تم الحصول على الصور كل 1 دقيقة ولعب بمعدل 10 لقطة في الثانية. مقياس شريط = 5 ميكرون.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصور تصحيح الخطأ هو أسلوب قيمة لدراسة الخطوات المتبعة في هذه العملية الخلوية الهامة والمعقدة. للقيام بذلك، يتم إنشاء المرفقات الخاطئة باستخدام مثبطات عكسها، ورصدت تصحيح الخطأ على فشل الدواء. وقد تم تطوير هذا الفحص أصلا باستخدام خلايا الثقافة أنسجة الثدييات 5. ومع وجود عدد كبير من kinetochores في العديد من نموذج أنواع خلايا الثدييات يشكل تحديا في مراقبة الأحداث الفردية تصحيح الخطأ. خلايا ذبابة الفاكهة S2 تمتلك عدد قليل من 4 أزواج من kinetochores، مما يجعلها خط الخلية أكثر الأفضل لمراقبة تصحيح الخطأ. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي هو أن العديد من مثبطات غير فعالة في خلايا ذبابة الفاكهة S2. وهكذا، والقدرة على توليد خط خلية ذبابة الفاكهة S2 أنسنة الإنسان معربا عن كينيسين-5 يوفر أداة قيمة لدراسة تصحيح الخطأ.

على الرغم من أن خلايا ذبابة الفاكهة S2 يمكن أن يكونخط الخلية أفضل لدراسة تصحيح الخطأ، والخطوات المتعددة التي ينطوي عليها الحصول على خط الخلية وهدمت الجينات الأساسية تطرح بعض التحديات التي تواجه هذه التقنية. على سبيل المثال، يمكن أن يكون كفاءة ترنسفكأيشن منخفضة جدا. إذا كانت أقل من 20٪ من الخلايا تعبر عن Eg5-mCherry، وينبغي تكرار ترنسفكأيشن كما عملية الاختيار سوف يستغرق وقتا أطول. أيضا، فإن النسبة المئوية للخلايا التعبير عن كل البروتينات الفلورية قد ينخفض ​​مع مرور الوقت. يمكن التغلب على ذلك عن طريق تقسيم الخلايا في وجود Blasticidin S حمض الهيدروكلوريك وهيغروميسين B لتحديد الخلايا معربا عن Eg5-mCherry وGFP-α تويولين، على التوالي. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن الخلايا ذبابة الفاكهة S2 لها orthologues إلى العديد من البروتينات البشرية و. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحسين ظروف ضربة قاضية للبروتينات الذاتية. قد تختلف الظروف المثلى ضربة قاضية في كمية الرنا المزدوج الجديلة وطول فترة العلاج. وبالنظر إلى ظهور والتحسن السريع للكريسبر-Cas9 تكنولوجىوفاق 15-17، وتوليد خط خلية ذبابة الفاكهة مع الجين Klp61F استبداله Eg5 البشري يقدم بديلا قويا من شأنه التغلب على القيود المفروضة على ترنسفكأيشن ونهج ضربة قاضية. يوضح عملنا أن ذبابة لالبشري استبدال الجينات يجب أن يكون خيارا قابلا للتطبيق في هذه الحالة على الرغم من الكواشف اللازمة للقيام بذلك في خلايا ذبابة الفاكهة S2 يجري حاليا تطويرها.

ولا يقتصر هذا الإجراء لEg5، ولكن يمكن تطبيقها على دراسة وظيفة البروتينات الأخرى ذات الاهتمام. في حالة استخدام مثبطات التي سبق لها أن أنشئت لتكون فعالة في خلايا ذبابة الفاكهة S2، هذا البروتوكول يمكن تعديلها لدراسة التأثير المباشر لمثبطات في الخلايا الحية دون القلق بشأن آثار الهدف خارج. ويمكن أيضا أن خط الخلية المنتجة باستخدام هذا البروتوكول أن تستخدم في فحص عالية الإنتاجية تحليل لتحديد الأدوية التي تستهدف البروتينات المحتملة التي ينطوي عليها تصحيح الخطأ.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نشكر باتريشيا ادز ورث عن هدية من كينيسين-5 بناء. وأيد هذا العمل من منحة المعاهد الوطنية للصحة (5 R01 GM107026) لTJM والبحوث منحة رقم 5 FY13-205 من مارس من مؤسسة مليم لTJM، وكذلك بدعم من مؤسسة تشارلز H. هود، وشركة، بوسطن، MA. لTJM

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف تعداء الفعاليةQiagen301425
Klp61F cDNAذبابة الفاكهة مركز الموارد الجينومية13690اسم الجين LD15641
شنايدر s MediaInvitrogen21720-024
مصل الأبقار الجنيني ، معتمدInvitrogen10082-147معطل بالحرارة ،
كبريتات النحاس (II) من أصل أمريكي (CuSO4< / sub>)SigmaC8027-500G500 & nbsp ؛ مخزون mM
S-trityl-L-cysteineSigma164739-5G1  مخزون mM في DMSO
Blasticidin HClInvitrogenR210015  مخزون ملغ / مل في 1x PBS
Hygromycin BInvitrogen10687010
T7 نظام إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاقPromegaP1320يبلغ تركيز dsRNA التقريبي من كل تفاعل حوالي 5-15   ؛ ومايكرو. ز /& مايكرو ؛ ل
Klp61F RNAi F التمهيديInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA
Klp61F RNAi R التمهيديInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCATTGAAAC
PCR طقم تنظيفMo Bio Laboratories, Inc1250
Concanavalin ASigmaC52750.5  محلول ملغ / مل مصنوع عن طريق الذوبان في 1x PBS.
مصل الحمار المسلوقمختبرات Jackson ImmunoResearch Labs017-000-121محلول مخزون 5٪ في 1x PHEM buffer ، اجلب المحلول حتى يغلي. مخزنة في 4   ؛ درجة مئوية.
تصاعد وسائل الإعلام20   mM تريس الرقم الهيدروجيني 8.0,  0.5٪ N< / em> - بروبيل غالات ، 90٪ جلسرين. مخزنة في 4   ؛ درجة مئوية.
1x BRB-8080 ملي مولار الأنابيب الرقم الهيدروجيني 6.9; 1  ملي إجتا. 1 ملي مولار MgCl2< / sub>
مصدر الضوء الأبيضLumencor Inc
ET EGFP مرشح مكعبChroma49002
DSRed تصفية مكعبChroma49005
الأجسام المضادة NDC80  مخصص من قبل Maresca Lab
DM1 & alpha ؛ (مضاد لألفا توبولين)سيجماT6199
الأجسام المضادة المضادة للإصابة بعدوى الجنونالمضادة AbCamab10887
واسع

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheeseman, I. M., Desai, A. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).
  2. Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
  3. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
  4. Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
  5. Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
  6. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
  7. Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
  8. Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
  9. Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2(2006).
  10. Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
  11. Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187(2013).
  12. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
  13. Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
  14. Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
  15. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  16. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  17. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila S2 5 KLP61F Eg5 mCherry STLC

مقالات ذات صلة