كيفية تحضير وإجراء الرحلان الكهربائي لانحباس الكسر السائل الأصلي الواضح (CN-GELFrEE) ، وهي تقنية فصل أصلية للتجميعات الجزيئية الحيوية غير التساهمية والبروتينات من العينات غير المتجانسة المتوافقة مع تقنيات تحليل البروتين النهائية المختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
CN-GELFrEE - واضح الأصلية جل مزال-جزء السائل الفخ الكهربائي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
يصف هذا البروتوكول
الملخص
مجمعات البروتين أداء مجموعة من الوظائف الخلوية حاسمة. توضيح التفاعلات والديناميات غير التساهمية من الأهمية بمكان لفهم دور المجمعات في النظم البيولوجية. في حين أن توصيف المباشر من التجمعات الجزيئية البيولوجية أصبحت ذات أهمية متزايدة في السنوات الأخيرة، وتقنيات تجزئة الأم التي تتوافق مع تقنيات تحليل المصب، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي والتي تكون ضرورية لتوسيع هذه الدراسات. ومع ذلك، فإن المجال يفتقر إلى الإنتاجية العالية، مجموعة واسعة، وارتفاع انتعاش طريقة فصل للجمعيات البروتين الأم. هنا، نقدم اضح أصلي مزال هلام السائل جزء انحباس الكهربائي (CN-GELFrEE)، وهي طريقة فصل جديدة لالمجالس بروتين غير التساهمية. وقد تجلى أداء الفصل CN-GELFrEE من المجمعات تجزئة المستخرجة من قلب فأر. تم جمع الكسور أكثر من 2 ساعة وعرض أشرطة منفصلة تتراوح بين ~ 30-500 كيلو دالتون. ويخدعوقد لوحظ نمط sistent زيادة عرض النطاق الترددي الوزن الجزيئي، كل بدءا ~ 100 كيلو دالتون. وعلاوة على ذلك، أظهرت إعادة تحليل لاحق من كسور الأم عبر SDS-PAGE الوزن الجزيئي التحولات يتفق مع تمسخ من المجمعات البروتين. لذلك، وقد ثبت CN-GELFrEE إلى توفر القدرة على أداء عالية الدقة وعالية انتعاش فصل الأم عن مجمعات البروتين من مجموعة كبيرة الوزن الجزيئي، وتوفير الكسور التي تتوافق مع ويحلل البروتين المصب.
المقدمة
ويعتقد غالبية العمليات البيولوجية يحدث داخل الخلية التي يتعين الاضطلاع بها من قبل المجالس البروتين بدلا من البروتينات واحدة 1. ونتيجة لذلك، من أجل توضيح دور حيوي معين من وحدة فرعية من البروتين في الخلية لا بد من فهم التفاعلات البنيوية مع البروتينات أو بروابط أخرى في المجمعات 2. ومع ذلك، ودراسة البروتينات أصلا، والحفاظ على تفاعلاتها غير التساهمية والنشاط، لا يزال تحديا. واحد من أوجه القصور في الدراسات البروتين الأم هي تقنية فصل الأم المناسبة التي تتوافق مع مختلف تقنيات تحليل البروتين المصب. لذلك، ازداد الاهتمام مؤخرا في تقنيات الفصل قادرة على تميز المجالس غير التساهمية الجزيئات الحيوية بشكل حاد 3.
تقنيات فصل البروتين أمر لا بد منه لوالكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية وغيرها من الدراسات المختلفة. تقنيات الفصل الأم الحالية لها intrinsiأوجه القصور ج التي تقلل من التوافق مع التحليلات المصب، مثل دقة منخفضة، وانخفاض الإنتاجية، وفقدان لهطول الأمطار، وشرط كميات كبيرة من عينة أولية. يستخدم تنقية تقارب جنبا إلى جنب عادة للدراسات التفاعل البروتين، ولكن لا بد من تنفيذها بشكل منفصل لكل هدف من البروتين، الامر الذي ادى الى تكون غير متوافقة مع تحليل الإنتاجية العالية 4. استبعاد حجم اللوني 5، هطول انتقائية مع أيون تقارب اللوني 5 وكثافة التدرج الفصل 6 وفرت كل فصل الأم، ولكن هي بطبيعتها تقنيات منخفضة الدقة وتتطلب عالية كميات عينة أولية.
بدلا من ذلك، التقنيات المعتمدة هلام، مثل الأزرق الأصلية (الجبهة الوطنية) واضح الأصلية (CN) PAGE (إما 1-D أو 2-D)، عرض عالية الدقة الانفصال. وعلاوة على ذلك، المتناقضة مع غيرها من التقنيات المذكورة، على حد سواء فصل PAGE الأم الحفاظ على الذوبان والتشكل الأصلي لص اسعانجى الأنواع جزيء، بما في ذلك البروتينات مسعور. يوسع هذه القدرة كذلك تغطية بروتيوم التي توصلت إليها هذه الأساليب 7،8 ويتحقق من خلال الكيمياء مختلفة بين CN وBN-PAGE. CN-PAGE تعتمد عادة على المنظفات اتهم لينة مثل جزيئات الناقل، لتحل محل صبغ Coomassie الأزرق في BN-PAGE. BN-PAGE، على الرغم من أن يرتبط مع دقة أعلى، له محاذير مثل انخفاض النشاط الأنزيمي في البروتينات فصل 8 و تشكيل ناتج إضافة Coomassie الجزيء، وهذا الأخير هو يمس بشكل كبير في مرض التصلب العصبي المتعدد المصب يحلل 9. كل من هذه الطرق، ومع ذلك، وترتبط تقليديا مع بطء انتعاش وتغطية بروتيوم ضيقة بسبب تلطيخ والقيود استخراج الهلام 7.
لدراسة البروتينات التشويه والتحريف، وهناك العديد من التقنيات التي تحافظ على جزيء الذوبان أثناء أداء عالية الدقة تجزئة مع استعادة نسبة عالية من البروتين والتي تكون متوافقة مع دiverse تقنيات تحليل البروتين في مرحلة ما بعد الانفصال. هلام مزال السائل جزء الفخ الكهربائي (GELFrEE) هي واحدة من أساليب التجزئة التي تتلاءم مع كل هذه الخصائص. يتم تطبيق هذا الأسلوب إلى حد كبير في دراسات البروتينات من أعلى إلى أسفل عالية الإنتاجية، مشيرا إلى أنه سريع وتنوعا. في GELFrEE والبروتينات هي التشويه والتحريف ومنعزلة على أساس الوزن الجزيئي من خلال مصفوفة هلام أنبوبي، والمسامية والتي يمكن أن تختلف على أساس متطلبات العينات ونتائج تجزئة المطلوب. ومزال كسور في الطور السائل، وبالتالي تقليل القيود الانتعاش المرتبطة SDS-PAGE مع الحفاظ على دقة عالية. ومن ثم يمكن تحليلها قسامات جزء من 1-D PAGE عن الوزن الجزيئي اختيار عرض النطاق الترددي 11. وهناك طلب كبير على المزايا المرتبطة GELFrEE في تقنيات الفصل الأم. الطريقة الموصوفة هنا، واضح الأصلية GELFrEE (CN-GELFrEE)، هو التكيف الأصلي من GELFrEE. من أجل أن تكون متوافقة مع الصورة واسعpectrum من الجزيئات في دولتهم الأم، ويعتمد هذا الأسلوب ليس فقط على لينة الكيمياء CN-PAGE، ولكن أيضا على الفصل المسامية الانحدار، مما يقلل من هطول الأمطار البروتين من خلال القضاء على انتقال قاسية بين مسام موجودة في أنظمة هلام متقطعة 9. عندما يطبق على يجزئ مجمعات البروتين المستخرج من قلب فأر، عرض كسور مزال استرداد عالية وفصل عالية الدقة من مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، الكسور الناتجة متوافقة مع معظم التحليلات المصب البروتين والكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يستند هذا البروتوكول الفيديو على نشر المرتبطة 9. وترد الكواشف محددة والمواد والمعدات اللازمة لتنفيذ كافة الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول في قسم المواد. يتم تصنيف الوصفات والمعلومات لإعداد جميع الحلول المطلوبة في الجدول 1.
1. صب من هلام أنبوب التدرج
- تجميع نظام الصب
- باستخدام لسخونة اللهب شفرة حلاقة أو مشرط، وقطع ماصة 20 مل المصلية على طول القسم متعامد 10 سم من أعلى قمة صرفها. تأكد من أن سطح قطع على نحو سلس. إبقاء أسفل قطعة (مع طرف) والتخلص من قطعة أعلى. المشبك قطعة ماصة أسفل عموديا (نصيحة مخروطي لأسفل) إلى موقف الدعم.
تنبيه: لا تلمس شفرة معدنية ساخنة، استخدم مقابض المناسبة أو ذو طيات لتجنب الحروق. - قطع 3 سم من أنابيب مرنة وتوصيله إلى قطع الماصة التي تمتد على مدىغيض صرفها. ربط صمام التحكم في التدفق في الطرف الآخر من الأنبوب.
- ربط الجزء السفلي من صمام للطرف الاستغناء عن خلاط التدرج باستخدام قطعة من الأنبوب. إبقاء صمام مفتوحة.
- تعيين خلاط التدرج على رأس محرك مغناطيسي. وضع القضبان المغناطيسية داخل غرف الخلط.
- ضع طرف الاستغناء عن خلاط التدرج 5-10 سم أعلى من الجزء العلوي من قطعة ماصة للسماح للهلام أن سكب عن طريق الجاذبية.
- اختبار نظام للكشف عن التسربات مع الماء منزوع الأيونات. إذا تم العثور على أي تسرب، تجفيف النظام عن طريق نفخ الهواء داخله قبل المتابعة.
- تغطية الجزء العلوي من قطعة ماصة مع اثنين أو أكثر من طبقات من الشريط. ثقب ثقبا في طبقات الشريط في وسط فتحة دائرية. تأكد من أن ثقب كبير بما فيه الكفاية لأنبوب زجاجي لتمرير بإحكام من خلال.
- حرك أنبوب زجاجي، حيث سيتم يلقي هلام، من خلال ثقب ثقب، وتمتد على الشريط حتى الزجاج يناسب بإحكام. أناnsert أنبوب زجاجي بحيث الجزء السفلي من أنبوب 2 مم فوق الجزء السفلي ماصة.
- تحقق لمعرفة ما إذا كان عقد أنبوب زجاجي ومركزية وعدم لمس الجدار ماصة بعد الانتهاء من إعداد النظام. هذا النظام هو الآن على استعداد لالصب.
- باستخدام لسخونة اللهب شفرة حلاقة أو مشرط، وقطع ماصة 20 مل المصلية على طول القسم متعامد 10 سم من أعلى قمة صرفها. تأكد من أن سطح قطع على نحو سلس. إبقاء أسفل قطعة (مع طرف) والتخلص من قطعة أعلى. المشبك قطعة ماصة أسفل عموديا (نصيحة مخروطي لأسفل) إلى موقف الدعم.
- جل الصب
- إعداد عازلة هلام، وكالة الأنباء الجزائرية والحلول Coomassie (حلول 1-3، الجدول 1).
- إعداد 12٪ T (حل 4، الجدول 1) و 1٪ T (حل 5، الجدول 1) فصل حلول هلام. إضافة 10 ميكرولتر من حل Coomassie في 12٪ من محلول تي فصل هلام. إضافة وكالة الأنباء الجزائرية وTEMED في كل الحلول مباشرة قبل صب في خلاط التدرج.
تنبيه: بولي أكريلاميد هو أعصاب للغاية ويجب ارتداء القفازات. - تأكد من إغلاق صمام الاستغناء عن خلاط التدرج. إضافة T 12٪ يفصل حل الجل على خلط الأبعد الغرفة من طرف صرفها. فتح صمام بين المجلسين، والسماح للط تدفق الحلn إلى الغرفة التالية.
- إغلاق صمام وماصة للخلع 12٪ من محلول هلام تي الفاصل إلى الغرفة السابقة. ويتم ذلك لتجنب فقاعات الهواء بين المجلسين.
- إضافة T 1٪ يفصل حل هلام لغرفة الخلط الأقرب إلى طرف صرفها. تشغيل محرك مغناطيسي.
- مفتوحة على حد سواء التدرج صمامات خلاط في نفس الوقت للسماح للحلول هلام فصل إلى أن تكون مختلطة وتصب في أنبوب ماصة والزجاج.
- وحالما يتم استنفاد الحلول هلام فصل في خلاط التدرج، فك الارتباط بين أنابيب من الخلاط وزوجين لحقنة 10 مل. تأكد من أن نهاية الأنبوب تبقى فوق مستوى السائل في ماصة حتى يتم إرفاق حقنة بحزم.
- استخدام حقنة لدفع بلطف فصل حل جل ما تبقى من الأنبوب في الأنبوب ماصة والزجاج. إغلاق صمام ماصة قبل السماح فقاعات الهواء فيه.
- إضافة بلطف طبقة من حوالي 0.25 مل من butano الماء المشبعل (الحل 6، الجدول رقم 1) على رأس حل هلام داخل أنبوب زجاجي لختم رد فعل البلمرة من الأوكسجين في الهواء ولشد الغضروف المفصلي العلوي.
- تنظيف جهاز صب على الفور مع الماء منزوع الأيونات (لا تستخدم المنظفات).
- الانتظار بين عشية وضحاها لالبلمرة هلام كاملة في درجة حرارة الغرفة.
- فصل جل أنبوب من الأجهزة وتخزين
- في اليوم التالي، قشر بعناية قبالة الشريط الجزء العلوي من الجهاز.
- افصل صمام من الأنابيب تحت ماصة. الافراج عن ماصة من المشبك وتنفيذ الخطوات 1.3.3. و1.3.4. أكثر من بالوعة.
- زوجان حقنة 10 مل مملوءة بالماء منزوع الأيونات إلى أنابيب مرنة. دفع المياه عبر الأنابيب إلى ماصة، ينزلق ببطء الجل بلمرة من ماصة.
- عقد ماصة أفقيا وتأمين بعناية هلام انزلاق من نهاية مفتوحة.
- قطع بولي أكريلاميد الزائد تحت وآرواوند أنبوب زجاجي باستخدام شفرة حلاقة. تأكد من إنشاء نهاية سلس على هلام داخل أنبوب، بجعله مطاردة مع غيض من أنبوب زجاجي.
- الاستغناء عن أي بيوتانول المتبقية من الجانب العلوي من هلام وتعيين أنبوب هلام في 15 مل أنبوب الطرد المركزي لم يسبق لهم اللعب. خلط 0.5 مل العازلة هلام (محلول 1، الجدول 1) مع 4.5 مل ماء نقي للغاية وإضافة حوالي 2 مل من محلول على كل من الجانب العلوي (داخل أنبوب زجاجي) والجانب السفلي (في أنبوب الطرد المركزي) من أنبوب هلام.
- تغطية الجانب العلوي الكامل للأنبوب الطرد المركزي، بما في ذلك فتح أنبوب زجاجي، مع بارافيلم لمنع التبخر العازلة. ويمكن تخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة حوالي 2 أسابيع.
إعداد 2. عينة
- تزن اثنين من قلوب الماوس وتخطر لهم في طبق بيتري باستخدام شفرة حلاقة.
- إضافة الأنسجة المصنعة لبمدافع الهاون وإضافة ما يكفي من النيتروجين السائل لتغطية العينة. يطحنون الأنسجة مع مدقة، إضافة المزيدالنيتروجين السائل عندما يتبخر.
- بمجرد الأرض الأنسجة بدقة، والسماح لليتبخر النيتروجين وإضافة 1 مل من تحلل العازلة (حل 7، الجدول 1) في 4 درجات مئوية لكل 100 ملغ من الأنسجة. نقل الحل في أنبوب الطرد المركزي.
- أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بعناية جمع طاف في أنبوب جديد وتجاهل بيليه. قياس تركيز البروتين في طاف باستخدام طريقة حمض bicinchoninic 12، أو كما يفضل. ملاحظة: قد يكون مستعدا لست] خلية الأم أو الكسور التحت خلوية كما يفضل. CN-GELFrEE متوافق مع مختلف مختلفة الاستعدادات العينة الأصلية.
- تحضير محلول منظم الإذابة والحل تحميل (الحلول 8 و 9، الجدول 1).
- إذا كانت العينة بيليه، و resuspend في 50-150 ميكرولتر من العازلة الإذابة. نأخذ عينة على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- عازلة تبادل العينة معلق أو المحللة الخلية مع solubilizatعازلة أيون باستخدام 30 كيلو دالتون-MWCO مرشح الطرد المركزي فائقة.
- أجهزة الطرد المركزي لعينة البروتين في 4 درجات مئوية و 10،000 x ج لمدة 5-10 دقائق أو حتى جزء حجم احتفظ وصولا الى ما يقرب من 20 ميكرولتر. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 400 ميكرولتر من العازلة الإذابة للجزء المدورة ومزيج من قبل pipetting. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 10،000 x ج لمدة 5-10 دقائق أو حتى جزء الاحتفاظ وصولا الى ما يقرب من 20 ميكرولتر. تجاهل التدفق من خلال.
- كرر الخطوة 2.9 مرتين إضافية.
- تمييع العينة التي تمت تصفيتها (حوالي 20 ميكرولتر) في 100 ميكرولتر من العازلة الإذابة.
- إضافة 20 ميكرولتر من محلول تحميل لعينة.
جهاز 3. CN-GELFrEE
- لأداء CN-GELFrEE التجزئة وتصنيع أجزاء الجهاز من خلال الإشارة إلى متجر للآلات. تصنيع أجزاء الجهاز في تفلون. يرجى الرجوع إلى الشكل 1 لكافة المعلومات اللازمة لتصنيع قطع الغيار ورس الجدول (2) لعدد من قطع الغيار اللازمة لجهاز واحد.
اعتبارات السلامة: ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. ينبغي توخي الحذر حول إمدادات الطاقة عالية الجهد، وجميع تقاطعات يجب أن يتم تنظيمها بشكل صحيح. لا تلمس الجهاز أو أي منطقة الرطبة المجاورة بينما الجهد في والحفاظ على المنطقة المحيطة بها مقاعد البدلاء الجافة خلال الكهربائي. وعلاوة على ذلك، وإمدادات الطاقة وينبغي أن تتحول خارج تماما عند التعامل مع الجهاز و / أو جمع الكسور. - إعداد المخزن المؤقت الأنود والكاثود عازلة (حلول 11/10، الجدول 1) والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية أو في الجليد.
- تناسب الطرف العلوي من الأنبوب هلام (النهاية دون هلام) من خلال فاصل، وهو الدائري يا وفاصل الثاني، بطريقة "ساندويتش".
- إضافة غرفة عازلة (الكاثود) بعد الفاصل الثاني، وتمرير مسامير بشكل كامل من خلال الثقوب الجانبية، إضافة وتشديد المكسرات لكلا الجانبين. تأكد من أن الطرف العلوي من الزجاجتم إصلاح الصورة أنبوب قبل الفتحة العلوية للغرفة عازلة، وليس مباشرة تحته أو الماضي عليه.
- تناسب نهاية الجزء السفلي من أنبوب هلام من خلال فاصل، وهو الدائري O، غرفة جمع، وفاصل الثاني.
- إضافة غرفة عازلة (الأنود) بعد الفاصل الثاني، وتمرير مسامير بشكل كامل من خلال الثقوب الجانبية، إضافة وتشديد المكسرات لكلا الجانبين. تأكد من أن نهاية الجزء السفلي من أنبوب هلام هو ثابت الماضي الفتحة العلوية للغرفة عازلة، على مقربة لكن لا لمس الجدار الخلفي.
- ضبط الجهاز CN-GELFrEE عموديا مع غرفة عازلة الكاثود صعودا تستخدم موقفا الدعم مع المشابك.
- إضافة العازلة الأنود إلى غرفة عازلة الأنود (القاع) وعازلة القطب السالب إلى غرفة عازلة الكاثود (أعلى). إبقاء جميع المخازن في 4 درجات مئوية.
- إزالة فقاعات الهواء من داخل أنبوب زجاجي من خلال استغلال بلطف أنبوب زجاجي والتحقق من نظام للتسرب.
- تأكد من الأقطاب البلاتين على اتصال مع المخازن المؤقتة في الدوائر والتي على حد سواءمغمورة طرفي أنبوب هلام في المنطقة العازلة داخل كل غرفة.
- توصيل أسلاك الكهرباء من الطاقة الكهربائية إلى المقابس الموز منها: سلبي على غرفة عازلة الكاثود (أعلى) وإيجابي على غرفة عازلة الأنود (القاع).
- تحميل العينة باستخدام غيض تحميل الجل إلى أعلى سطح هلام، داخل أنبوب هلام.
- تشغيل هلام في 1 W ثابت، لتجنب ارتفاع درجة الحرارة، حتى الجبهة صبغ الحمراء في الجزء السفلي من أنبوب هلام.
تنبيه: إيقاف التيار الكهربائي قبل الاستمرار. - تجاهل الأنود والكاثود المخازن.
- Untighten المكسرات من الغرفة العازلة الأنود وتفكيك هل السفلي وغرفة، والحفاظ على فاصل ويا الدائري. وضع نهاية الجزء السفلي من أنبوب هلام داخل غرفة جمع، قبل الفتحة العليا، وليس في الماضي أو مباشرة تحته. دفع هل ويا الدائري بالقرب من غرفة جمع.
- قطع قطعة من السليلوز غشاء غسيل الكلى وترطيب من قبل immerging في المخزن الأنود. تغطية ا ف بerture بين غرفة جمع وهل السفلي باستخدام غشاء غسيل الكلى.
- غرفة تجميع عازلة الأنود بعد الفاصل الثاني، إضافة وتضييق الخناق والمسامير.
- وضع الجهاز أفقيا فوق دلو الجليد. إضافة الأنود والكاثود جديدة المخازن إلى غرف عازلة والتحقق من نظام للتسرب.
- إضافة 150 ميكرولتر من العازلة الأنود في غرفة جمع. إعادة توصيل أسلاك الكهرباء إلى المقابس الموز منها.
- بدوره على امدادات الطاقة في 3 مللي أمبير تيار مستمر. يجب أن الجبهة صبغ ثم تبدأ أزل في المخزن المؤقت في غرفة جمع.
- عند مزال الجبهة صبغ كامل، وإيقاف إمدادات الطاقة وجمع جزء الأول (0 دقيقة)، نقله إلى منخفض البروتين أنبوب microcentrifuge ملزم.
- إعادة ملء الغرفة مع جمع 150 ميكرولتر من العازلة الأنود. منع جميع الكسور التي تم جمعها على الجليد.
- جمع الكسور بعد فترات الزمنية التالية من جمعجزء الأول: 2 دقيقة، 4 دقائق، 6 دقائق، 8 دقيقة، 10 دقيقة، 15 دقيقة، 20 دقيقة، 25 دقيقة، 30 دقيقة، 45 دقيقة و 60 دقيقة. لا حساب للوقت في حين أن التيار الكهربائي هو خارج. لا ننسى لإيقاف التيار الكهربائي قبل جمع الكسور وإعادة ملء الغرفة مع جمع 150 ميكرولتر من العازلة الأنود بين العينات. تحويل امدادات الطاقة مرة أخرى بعد جمع لبدء يبلغ حجمه جزء القادم.
- الاستغناء عن القطب الموجب والسالب مخازن وإضافة حلول جديدة لغرف عازلة بعد 60 دقيقة. جمع الكسور في 90 دقيقة و 120 دقيقة.
- تغيير الأنود والكاثود مخازن في كل ساعة.
- تشغيل أصلي واضح أو PAGE الأم زرقاء مع الكسور وصمة عار كما تفضل. اتبع إرشادات الشركة المصنعة أو بروتوكول المفضل.
- تشغيل الحد SDS-PAGE وصمة عار كما تفضل. اتبع إرشادات الشركة المصنعة أو بروتوكول المفضل.
- تنظيف الكسور GELFrEE والخضوع لقياس الطيف الكتلي الأصلي التحليلات في ضوء ما وصفه العلاقات العامةeviously 9.
الشكل 1: CN-GELFrEE جهاز (A) جهاز GELFrEE أجزاء الرسومات و (ب) صورة من الأجزاء المصنعة. (C) CN-GELFrEE مخطط تجميع الجهاز: (1) غرفة عازلة، (2) الفاصل، (3) يا الدائري، (4) أنبوب هلام، (5) غرفة جمع، و (6) غشاء غسيل الكلى.
الجدول 1: جدول الحلول.
الجدول 2: جدول أجزاء الجهاز GELFrEE.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
200 ميكروغرام من البروتينات المستخرجة من بالتبريد قلوب الماوس الأرض كانت مجزأة أصلا إلى 14 أجزاء من 150 ميكرولتر لكل منهما، باستخدام طريقة CN-GELFrEE في 1-12٪ أنبوب تي هلام. تم تشغيل قسامة من 10 ميكرولتر من كل جزء على هلام لوح CN-PAGE والفضة الملون. ويرد وصف واضح للتجزئة والقرار الذي حصلت مع تجزئة CN-GELFrEE في الشكل 2A. تم جمع الكسور أكثر من ساعتين ويبين فحص هلام جود نمط ثابت من زيادة الأوزان الجزيئية تتراوح بين ~ 30-500 كيلو دالت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
مشتق CN-GELFrEE من مواليد واضح (CN) PAGE نظام المخزن الذي يستخدم خليط من أنيونية والمنظفات محايدة كما جزيئات الناقل 9 لتجزئة البروتين على أساس الوزن الجزيئي من خلال مصفوفة هلام. تطبيق CN-GELFrEE إلى الأصلي الماوس القلب استخراج البروتين ولدت كسور تعقيد منخفضة مع عرض نطاق ترددي منفصلة مع الحفاظ على التفاعلات غير التساهمية من التجمعات الجزيئية البيولوجية. وأظهرت المقارنة بين الكسور بين CN-PAGE والحد من المواد الهلامية لوح SDS-PAGE التحولات الجماعية التي تثبت فقدان التفاعلا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
قدمت مؤسسة WM كيك بسخاء التمويل لهذا العمل. وتستند هذه المواد على العمل بدعم من FAPERJ منحة بحثية 100.039 / 2014 من حكومة ريو دي جانيرو الدولة - البرازيل لالمبثوثة، علوم بلا حدود منحة دراسية 88٬888،075416 / 2013-00 من التنسيق لتحسين لموظفي التعليم العالي، في ظل الحكومة من البرازيل، لدعم الخدمات الصحية ومؤسسة العلوم العليا زمالة القومي للبحوث تحت الزمالة رقم 2014171659 لمرصد الصحراء والساحل، وCNPq البحوث منحة 202011 / 2012-7 من حكومة البرازيل لLHFDVPCH هي المستفيدة من الكيمياء في جامعة نورث وسترن للحياة العمليات معهد ما بعد الدكتوراه جائزة الزمالة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كواشف < / قوي > | |||
| 30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1 | Bio-Rad | 161-0158 | هذا المحلول سام للأعصاب. |
| 6-حمض أمينوهيكسانويك (&إبسيلون ؛ حمض أمينوكابرويك) | سيجما ألدريتش | A2504 | هذه المادة الكيميائية مهيجة. |
| بيرسلفات الأمونيوم (APS) | فيشر ساينتفيك | 7727-54-0 | هذه المادة الكيميائية قابلة للاشتعال وسامة ومسببة للتآكل. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | هذه المادة الكيميائية مهيجة. |
| حمض الإيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك (EGTA) | FLUKA | 3777 | هذه المادة الكيميائية سامة. |
| حمض الإيثيلين ديامين tetraacetic (EDTA) | فيشر Scientific | BP120 | هذه المادة الكيميائية سامة. |
| الجلسرين | فيشر العلمي | 56-81-5 | |
| إيميدازول | سيجما-ألدريتش | I2399 | |
| النيتروجين السائل | أي مورد | غير | بتخزين النيتروجين السائل في حاويات مصممة للسوائل ذات درجة الحرارة المنخفضة |
| قلب الفأر | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | فيشر Scientific | 71-36-3 | هذه المادة الكيميائية قابلة للاشتعال وسامة. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| مثبط البروتياز | Thermo Fisher Scientific | 78430 | هذه المادة الكيميائية سامة. |
| ديوكسي كولات الصوديوم | سيجما ألدريتش | 30970 | هذه المادة الكيميائية مهيجة. |
| السكروز | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | هذه المادة الكيميائية قابلة للاشتعال ومهيجة. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment< / قوي > | |||
| خلاط متدرج | Hoefer | SG15 | |
| التحريك المغناطيسي ؛ | أي مورد | غير / أ | |
| قضبان مغناطيسية ؛ | أي مورد | صغير | بما يكفي ليناسب غرف خلاط الجراديت. |
| مزود الطاقة | Bio-Rad | 164-5056 | الجهد حتى 1,500 فولت |
| جهاز طرد مركزي مبرد | Eppendorf | 022622552 | ما يصل إلى 15,000 × < |
| > المواد < / قوي > | |||
| 15 مل أنبوب مخروطي | أي مورد | N / A | |
| 30 kDa-MWCO مرشح الطرد المركزي الفائق | Millipore | UFC503096 | |
| أنابيب مرنة | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | بطول 1 متر تقريبا |
| أي مورد | N / A | ||
| صمام معدني أو بلاستيكي سائل / هواء. ( على سبيل المثال < / em> صمام ذراع التحكم في تدفق الهواء / الماء في الحوض) | أي مورد | صمامات حوض السمك غير | متوافقة. |
| هاون ومدقة | أي مورد | N / a | |
| الأصلي PAGE 3-12٪ T بلاطة جل | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| طبق بتري | فيشر Scientific | 08-757-13 | |
| أنبوب البروتين منخفض الربط 1.5 & nbsp ؛ مل | Eppendorf | 022431081 | |
| شفرة الحلاقة | أدوات IDL | TE05-091C | |
| أنابيب غسيل الكلى السليلوز المتجددة 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE بلاطة جل لأي كيلو دالتون | Bio-Rad | 456-9036 | |
| ماصات مصلية (25 & nbsp; مل) | حقنة VWR | 89130-900 | |
| (10 مل) أي | مورد | غير متوفر |
المراجع
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
