مقالة منهجية

عزل وتوصيف ماوس الغارية البويضات واستنادا إلى منظمة ونين نويي

DOI:

10.3791/53616

⸱

يناير 7, 2016

 , 
1Research Center for Regenerative Medicine, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, 2Department of Biology and Biotechnology "L. Spallanzani", University of Pavia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول لتوصيف البويضات غاري الماوس على أساس تنظيم نويي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسريعة لعزل وتوصيف بويضات الفأر الجنائي GV (الحويصلة الجرثومة) على أنها قادرة (SN ، النواة المحاطة) أو غير قادرة (NSN ، غير النواة المحااطة) على التطور إلى مرحلة الكيسة الأريمية بعد النضج في المختبر (IVM) والتخصيب في المختبر (IVF). إنه يستخدم Hoeschst33342 (أو أي صبغة أخرى لإقحام الحمض النووي) قادرة على الارتباط بالكروماتين غير المتغاير للنواة التي تظهر حلقة في بويضات SN أم لا ، كما هو الحال في بويضات NSN. يمثل هذا أسهل وأسرع طريقة لفرز كل من البويضات الأذينية التي يمكن استخدامها في النهاية لإجراءات IVM أو IVF.

باختصار ، يتكون البروتوكول من الخطوات التالية: حقن الهرمونات لتحفيز نمو البصيلات ؛ عزل البويضات في مرحلة GV عن الحجرة التاجية عن طريق ثقب المبيض بإبرة معقمة ؛ تحضير ماصات زجاجية رقيقة لسحب البويضات عن طريق الفم ؛ فرز البويضات باستخدام Hoechst33342 المحضرة بتركيز فوق حيوي ؛ IVM أو التلقيح الاصطناعي أو أي تحليل جزيئي / خلوي آخر.

لسوء الحظ ، لا يزال هناك القليل من الأدلة لفرز بويضات SN و NSN باستخدام تقنيات أقل توغلا. وإذا تم تحديدها وبمجرد تحديدها، فمن المحتمل أن تطبق على تكنولوجيات الإنجاب بمساعدة الإنسان، وإن كان ذلك مع وجود العديد من الجوانب التي ينبغي تعديلها. حتى الآن ، هذه التقنية لها آثار محتملة لزيادة الإجراءات الناجحة للإدارة المتكاملة للنواب، والتلقيح الاصطناعي بشكل كبير في كل من الأنواع المهددة بالانقراض وذات الأهمية الاقتصادية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم غاري البويضات نمت بشكل كامل (GV، الحويصلة الجرثومية) معزولة عن مقصورة الغارية من المبيض بشكل روتيني لأغراض مختلفة مثل، على سبيل المثال، ودراسة الآليات الجزيئية والخلوية وراء في المختبر النضج حتى مرحلة الطورية II.

وعلى الرغم من ظهور البويضات الأكثر الغارية جميلة، ولكن ليس كل شيء، هي قادرة على استكمال الانقسام الاختزالي والوصول إلى مرحلة الكيسة الأريمية. في الواقع، في كثير من أنواع الثدييات، بما في ذلك البشر 1،2، ما يقرب من 30٪ منهم تعتقل تنميتها في المرحلة 2-الخلية، في حالة حدوث الإخصاب 3-5. حتى الآن، تستخدم بعض المعلمات للتمييز بين البويضات قادرة على الحفاظ على التطور الجنيني من أولئك الذين لا يستطيعون القيام بذلك.

على سبيل المثال، الكريزيل تلطيخ الأزرق (BCB) هو وسيلة صالحة لفرز البويضات على أساس النشاط الجلوكوز 6 فوسفات نازعة-على الرغم من أن فائدة هذه الطريقة فرز المتعلقة BCB + أو تلطيخ BCB- هيلا يزال المختبرات تعتمد 6-8.

يوجد طريقة أخرى راسخة في المؤسسة لونين بها: إذا ملطخة أي الأصباغ الإقحام الحمض النووي (مثل Hoechst33342)، و 70٪ من البويضات الغارية تظهر حلقة صبغ إيجابي حول نوية وتسمى تحيط نوية (SN) في حين أن 30٪ المتبقية تظهر إشارات إيجابية أكثر رصدت وتسمى ليس تحيط نوية (NSN) 3-5. أظهرنا مؤخرا أن غياب السياج حشوية 9 (CPLs، مواقع تخزين هامة لمرنا وريبوسوم المستمدة أمهات في كل من البويضات في الثدييات والأجنة) (10) وأسفل تنظيم MATER (ضروري لتشكيل CPLs 11)، جنبا إلى جنب مع وجود قطرات الدهون في cytoplasms من 9،12، يمكن أن يكون لأسباب أخرى تتعلق البويضات عدم NSN المضي قدما إلى ما بعد مرحلة 2-الخلية.

للأسف، عدد من التقنيات يمكن تطبيقها على فرز SN الغار والبويضات NSN و،لهذا السبب، يمكن تطوير أسلوب أقل الغازية (دون تلطيخ النووي، إجراءات تثبيت أو التلاعب مع ماصات الفم) أصبحت مهمة جدا لزيادة معدلات كلا تطور الجنين الإنسان والحيوان.

في هذه الورقة، ونحن بالتفصيل بروتوكول بسيطة وسريعة تستخدم لعزل الإعلان نوع SN وNSN البويضات الغارية من إناث الفئران وموجهة الى جميع العلماء المهتمين في دراسة عملية تكوين الأمشاج الإناث، نضوج البويضة وتطور الجنين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويجري هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية لالأوروبي (EU 63/2010) والإيطالية (26/2014) قوانين حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض البحث العلمي. يستخدم عنق الرحم التفكك القتل الرحيم لالمبايض العزلة، ويتم تنفيذها من قبل الخبراء والأفراد المدرجة في بروتوكول المعتمد تغطي هذه الدراسة تدريب.

1. الحيوانات

  1. الحفاظ على الكبار 3- لإناث الفئران عمره 6 أسابيع في غرفة مع درجة الحرارة للرقابة والرطوبة (مع مراحل 12L: 12D وبالمال وبالشهرة أيضا إعلان البنك المركزي الامريكي).
  2. حقن الفئران داخل الصفاق مع 2.5 وحدة دولية من الحوامل موجهة الغدد التناسلية مصل الفرس (PMSG) لتحفيز النمو الجريبي عن طريق محاكاة آثار هرمون تحفيز الجريبات (FSH). عزل المبيضين البويضات لالغارية 48hrs جمع في وقت لاحق. الموت ببطء الماوس الإناث حقن سابقا مع PMSG، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية الخاصة بك.
  3. بسرعة إزالة المبيضين من تجويف الجسم ووضعها في طبق بتري تابعaining M2 المتوسطة لاحقة عزل البويضات (انظر القسم 3).
    1. إجراء شق في الجلد الذي يغطي جدار البطن تليها شق في الغشاء البريتوني باستخدام مقص تشريح العقيمة. فتح شق لكشف البطن، نقل الشجاعة على جانب واحد باستخدام الملقط معقمة وتوطين أنابيب الرحم، وتشكيل شكل V بدءا من المثانة.
    2. مراقبة المبايض تقع تحت الكلى. عقد كل أنبوب مع منتاش معقم وإجراء شق صغير في الجزء السفلي من المبيض للافراج عنهم. نقل كلا المبيضين في الجزء السفلي من طبق بتري تحتوي على المتوسط ​​قبل معايرتها.

2. إعداد هرمون

  1. تمييع PMSG (متوفر في تركيزات مختلفة الأسهم) مع محلول معقم المالحة متساوي التوتر للحصول على تركيز العمل من 2.5 وحدة دولية الهرمون في 0.1 مل لحجم الحقن المناسب.
    يجب aliquoted حلول هرمون في 0.5 مل الأنابيب وتخزينها في -2: ملاحظة0 درجة مئوية حتى اليوم من الاستخدام. لا تبقي قسامات المخفف أطول من ثلاثة أشهر في -20 ° C. إذابة مرة واحدة، إذا تم إجراء حقن المسلسل، وتخزين aliquots من الحلول الهرمون في +4 درجة مئوية واستخدامها في غضون 4 أيام.

3. الغارية البويضات عزل

لعزل البويضات السليمة:

  1. تتوازن M2 المتوسطة 13 (M2) في CO 2 و 37 ° C 5٪ لا يقل عن 1 ساعة قبل البدء في إجراء البويضات العزلة. إعداد طبقين بتري (35 مم × 10 مم)، واحدة مع 1 مل من M2 لتعطيب المبيض والثانية مع قطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية (~ 1.5 مل) لنقل البويضات بعد بمعزل عن المبيض (انظر 3،4-3،6). تبقي على حد سواء أطباق بتري في حاضنة في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  2. استخدام stereomicroscope خلال إجراءات عزل البويضات.
  3. إعداد رقيقة الماصات الزجاجية الفم لجمع البويضات تمتد لفيلمأبقى هينج الزجاج الماصات باستور أفقيا (عقد ينتهي من ماصة بكلتا يديه)، فوق لهب العمودي القادمة من موقد بنسن (الشكل 1).
    1. بمجرد أن يبدأ الزجاج في الذوبان، واتخاذ الماصة للخروج من اللهب وإجراء حركة سحب سريعة للحصول على ماصة المطلوب. قطع بحزم الزجاج الزائد على مقربة من نقطة ضيقة من ماصة مع الأظافر لضبط طول وقطر الشعرية الداخلي. ضمان الشعرية رقيقة لديه القطر الداخلي لل~ 100 ميكرون، أكبر قليلا من قطر البويضة ل(~ 80 ميكرون).
    2. إلى الفم ماصة، قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب الشافطة لماصة سحبت باستخدام طرف المناسب ووضع الطرف الآخر في الفم، وتأمين ذلك مع الأسنان.
  4. جمع المبايض باستخدام الملقط معقمة وإيداعها في الجزء السفلي من طبق خلية ثقافة بتري (35 ملم × 10 ملم). غطاء لهم مع 1 مل من M2 سبق معايرتها عند 37 ° Cو 5٪ CO 2 (الشكل 2).
  5. ثقب بلطف الجريبات الغارية المبيضين مع العقيمة إبرة حقنة الانسولين لاطلاق سراح البويضات الغارية في M2 (الشكل 3).
  6. بلطف الفم الماصة البويضات من خلال ماصة باستور الضيقة لإزالة خلايا بصيلات وأي حطام الأنسجة المحتمل الآخر (الشكل 4A) ومن ثم تسويتها في الجزء السفلي من قطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية مناسبة للثقافة الجنين (سابقا إعداد؛ الشكل 4B).
    ملاحظة: من المهم لإزالة جميع الخلايا الركامية التي تعلق على المنطقة الشفافة من البويضات قبل pipetting المستمر من خلال عدة ومختلفة قطرات من M2. تنفيذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن لتجنب التغيرات في الرقم الهيدروجيني للمتوسط.

4. الغارية البويضات تلطيخ مع Hoechst33342

ملاحظة: البويضات الغارية ويمكن التمييز في SN (تحيط نوية)، NSN (لا تحيط نوية) أوفي أي شكل وسيط آخر، استنادا إلى منظمة ونين بهم بعد تلطيخ مع تركيز فوق حيوي من Hoechst33342 (أو أي علامات أخرى محددة لقواعد AT) 14. في الواقع، تظهر البويضات SN حلقة هويشت إيجابية حول نوية في حين أن NSN لا، ومن هنا اسمها.

لتلطيخ البويضات السليم:

  1. نقل البويضات باستخدام ماصة الفم إلى قطرات من Hoechst33342 (20 ميكرولتر) المخفف في M2 في تركيز فوق حيوي من 50 نانوغرام / ميكرولتر لمدة 10 دقيقة في الظلام.
  2. بعد الحضانة مع Hoechst33342، ونقل كل بويضة واحدة مع ماصة الفم في الجزء السفلي من قطرات صغيرة (5 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية، والفرز على أساس تنظيم لونين (SN أو NSN). استخدام أي المجهر مضان مجهزة مرشح Hoechst33342 (الطول الموجي انبعاث 486 نانومتر) لتصور التكوين لونين من البويضات.
    ملاحظة: اعتمادا على نوع المجهر مضان المستخدمة، طر قد يصبح من الضروري استخدام الزجاج طبق بتري أسفل لالتقاط صور. المجهري متحد البؤر أوليمبوس Fluoview Fv10i عندما مجهزة حامل العينة لمدة 35 ملم طبق يتطلب الزجاج الوحيدة أسفل أطباق لالتقاط صور مع 0.17 مم القياسية ومجموعة 0،13-0،21 مم مقبولة.
  3. تثير البويضات لمدة لا تزيد 5-10 ثانية، من المحتمل ما يكفي من الوقت لتصور وجود أو عدم وجود حلقة حول نوية (الشكل 5).
  4. بعد الفرز، وثقافة SN غاري والبويضات NSN في M2 في 5٪ CO 2 و 37 ° C للحث في المختبر النضج أو الاحتفاظ بها في مخازن مناسبة للالتحليلات الجزيئية أو الخلوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر الصور التالية الطريقة المستخدمة لعزل البويضات الغارية من المبيض الماوس، بدءا من إعداد الماصات لفرز البويضات عن طريق وسائل Hoechst33342. هذا الأسلوب هو بسيط جدا ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مجهز حاضنة CO 2، stereomicroscope والمجهر مضان مجهزة مرشح الصحيح للمراقبة من Hoechst33342 الشكل 1 يوضح الخطوة الأولى لإعداد ماصة: كما الزجاج تبدأ في الذوبان وتصبح لينة، لا بد من سحب طرفي ماصة، وبصرف النظر، في الوقت نفسه، يجب أن تؤ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول الطريقة المستخدمة لعزل وتصنيف الماوس غاري البويضات GV. لا توجد خطوات حاسمة خاصة أن نؤكد، مع استثناءات قليلة. أولا: يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن بما يلي: أ) الحفاظ على حيوية البويضات وب) تجنب التغييرات درجة الحموضة في الوسيلة المستخدمة. ثانيا: يجب أن تكون البويضات متحمس لفترة وجيزة (5-10 ثانية) لHoechst33342 لتجنب الضرر لونين والموت لاحق من البويضات، وخاصة إذا IVM وIVF هي الخطوات التالية. حتى الآن، وهذا هو أسرع طريقة لفرز SN وNSN الماوس البويضات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.M. و C.A.R. يقرون بالدعم المالي المقدم من Ministero della Salute ، Ricerca Finalizzata / giovani ricercatori anno 2009 من Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo ، Pavia (I). يرغب M.M و C.A.R. في شكر ماريانا لونغو على المساعدة في إعداد الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PMSGSigmaG4527
EmbrioMax M2MilliporeMR-015-PD
Hoechst33342Thermo Scientific62249
الزيوت المعدنيةSigmaM8410
طبق ثقافة الخلية 35 مم × 10 ممCorning430165
& micro ؛ طبق 35 مم ، قاع زجاجي عاليالمرجع نفسه81158
ماصة باستور البورسليكاتCorning7095D-9
مجموعات أنابيب الشفاط للماصات الحلقية الدقيقة المعايرةSigmaA5177

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
  2. Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
  3. Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
  4. Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
  5. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
  6. Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
  7. Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
  8. Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
  9. Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
  10. Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
  11. Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
  12. Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
  13. Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
  14. Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
  15. Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Hoechst 33342 StainingMouth Pipette PreparationOocyte IsolationIn Vitro MaturationIn Vitro FertilizationSurrounded NucleolusNot Surrounded NucleolusFollicle Puncture

مقالات ذات صلة