يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليف الذهب الجسيمات النانوية الليبوزومات المتكاملة صور متجاوبة وقياس تلك Microbubble التجويف على نبض الليزر الإثارة

7.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53619

⸱

فبراير 24, 2016

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة تحضير بسيط للجسيمات متناهية الصغر من الذهب متكاملة الجسيمات الشحمية-صور متجاوبة مع المواد المتاحة تجاريا. كما يبين كيفية قياس عملية التجويف microbubble من الجسيمات الشحمية توليفها على علاج ليزر نابض.

الملخص

حظيت الجسيمات النانوية المستجيبة للصور (NPs) < p class = 'jove_content'> باهتمام كبير بسبب قدرتها على توفير التحكم المكاني والزماني والجرعات في إطلاق الدواء. ومع ذلك، فإن معظم التكنولوجيات ذات الصلة لا تزال قيد التطوير ولا يمكن للعيادات شراؤها. هنا ، نصف تلفيقا سهلا لهذه NPs المستجيبة للصور مع NPs الذهبية المتوفرة تجاريا والجسيمات الشحمية المستجيبة للحرارة. يستخدم الكالسيين كدواء نموذجي لتقييم كفاءة التغليف والمظهر الحركي للإفراج عند تحفيز الحرارة / الضوء. أخيرا ، نوضح أن هذا الإطلاق الناتج عن الصور يرجع إلى اضطراب الغشاء الناجم عن تجويف الفقاعات الدقيقة ، والذي يمكن قياسه باستخدام الهيدروفون.

المقدمة

إمكانية لتحريك الافراج عن المخدرات باستخدام مؤثرات الخارجية هو وسيلة جذابة لتقديم الأدوية في الموضات spatial-، temporal- والتي تسيطر عليها الجرعة مع خصوصية مكبر والآثار السلبية الحد الأدنى. من بين مجموعة واسعة من أنظمة خارجية-المحفزات التي تستجيب (ضوء، المجال المغناطيسي والموجات فوق الصوتية، أشعة الميكروويف)، منصات أثار ضوئية جذابة، بسبب من غير الغازية، والبساطة والقدرة على التكيف في العيادات. 1 بحوث مستفيضة في العقد الماضي قدمت مجموعة متنوعة من التقنيات منصة، مثل الذهب مسؤولة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء، الضوء (الاتحاد الافريقي) قفص نانوي المغلفة مع البوليمرات الذكية، 2-صورة عطوب، النانوية البوليمرية (NPS) مترافق مع الأدوية و 3 و nanovesicles porphysome الذاتي تجميعها. 4 ولكن ، هذه التقنيات لا تزال في مراحل ما قبل السريرية للتنمية، وتتطلب فهم واضح والتحسين من المعلمات المشاركين في عملية بدء وتابعالمتداول الافراج عن المخدرات.

واحد من أبسط ويمكن الوصول إليها بسهولة طرق لإعداد مثل هذا النظام هو دمج الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية مع الجسيمات الشحمية حراريا الحساسة 5،6، متاحة على نطاق واسع في السوق وكلاهما وتم التحقيق فيها على نطاق واسع في التجارب قبل السريرية والسريرية حتى. وعلى الرغم من القيود المفروضة على تنشيط الأنسجة العميق من الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية في الطول الموجي من plasmonic، بالمقارنة مع النانو الاتحاد الافريقي الأشعة تحت الحمراء القريبة تنشيط (على سبيل المثال، قفص نانوي)، وهذا النظام لا يزال يحمل وعودا كبيرة عند استخدامها في الحيوانات الصغيرة أو للتسليم الموضعي في البشر. 7 هناك بعض الجهود المبكرة في الجمع بين الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية مع الجسيمات الشحمية لإطلاق أثار خفيفة 8-11 في حين أن معظمهم من التركيز على الجدة من المواد، وتحتاج إلى معالجة المسائل المتعلقة بإمكانية الوصول وتطويره. وعلاوة على ذلك، تقارير عن آليات الإفراج استخدام هذه nanocarriers لا تزال محدودة.

هنا، وتلفيق الصور تستجيبوقد وصفت الجسيمات الشحمية، تحميل في وقت واحد مع المخدرات ومصادر القدرة النووية الاتحاد الافريقي ماء. يستخدم Calcein كمركب نموذج لتقييم كفاءة التغليف والتعريف الافراج عن النظام. وبالإضافة إلى ذلك، في هذا النظام، وعلى ضوء استيعابها من قبل الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية تبدد إلى المكروية المحيطة بها في شكل حرارة، مما أدى إلى زيادة في درجة الحرارة المحلية. يتم إنشاء microbubbles الهواء أثناء التسخين ليزر ويسبب اضطراب الميكانيكية من الجسيمات الشحمية (الشكل 1). وأكد آلية التجويف microbubble بواسطة القياسات مائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد

  1. نظيفة 100 مل جولة قوارير السفلية باستخدام الماء الملكي (1 جزء من حمض النتريك (HNO 3) و 3 أجزاء من حامض الهيدروكلوريك المركز (حمض الهيدروكلوريك)) وغسل القوارير بالماء DI. الأوتوكلاف قوارير وتجفيفها في فرن الهواء الساخن عند 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. التفاف وتخزين قوارير معقمة حتى الاستخدام.
  2. تعقيم مجموعة مصغرة الطارد باليد باستخدام الايثانول 70٪.
  3. بدوره على المبخر الدوار وضبط درجة الحرارة في حمام الماء الساخن وبرج التبريد عند 37 درجة مئوية و 4 درجات مئوية على التوالي.
  4. إعداد 60 ملي calcein حل الأسهم عن طريق إذابة 374 ملغ من calcein في 10 مل من 0.1 ملي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (7.4 درجة الحموضة). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حل.

2. تجميع الليبوزومات

  1. إزالة الدهون (1،2-Dipalmitoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (DPPC)، 1-بالميتويل-2-هيدروكسي التعطيل -glycero-3-phosphochoخط (MPPC) و 1، 2-distearoyl- التعطيل -glycero-3-phosphoethanol-amine- N - [كربوكسي (البولي ايثيلين جلايكول) -2000] (ملح النشادر) (DSPE-PEG2000)) من الثلاجة (-20 درجة مئوية) وذوبان الجليد لهم RT.
  2. تزن 15.9 ملغ DPPC، 1.3 ملغ MPPC، و 2.8 ملغ DSPE-PEG2000. حل لهم معا في 2 مل الكلوروفورم.
  3. نقل الحل الكلوروفورم إلى الجولة معقمة قارورة أسفل وتتبخر المذيب باستخدام المبخر الدوار تحت ضغط منخفض، لتشكيل طبقة رقيقة من المادة الدهنية الجافة.
  4. ترطيب طبقة الدهون عند 45 درجة مئوية مع 2 مل من محلول مائي لمدة 30 دقيقة تحتوي على 1.95 مل 60 ملي calcein أعدت في الخطوة 1.4 و 50 ميكرولتر الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية (3.36 × 10 16 الجسيمات / مل).
  5. قبل تسخين كتلة التدفئة إلى 45 درجة مئوية. وضع 200 نانومتر مرشح غشاء البولي بين دعامات تصفية وتجميع مجموعة مصغرة الطارد. فحص التسرب المحتمل بالماء DI.
  6. ملء واحدة من الحقن مع 1 مل من محلول الحويصلية من الخطوة 2.4 و extruدي العينة عن طريق تمرير الحل لحقنة في الطرف الآخر من تجميع مصغرة الطارد. كرر 11 مرة.
  7. تشغيل الجسيمات الشحمية توليفها من خلال عمود تحلية PD-10 لإزالة الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية حرة والدهون وcalcein باستخدام برنامج تلفزيوني كما شاطف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  8. تخزين العينات في أنابيب معقمة في 4 درجات مئوية واستخدامها في 2 يوما.

3. Calcein بيان من الليبوزومات تدفئة

  1. حساب المولية الدهون من محلول المخزون بجمع molarities من DPPC، MPPC، وDSPE-PEG2000 في الخطوة 2.2. تمييع الحل الأسهم الحويصلية إلى 5 ملي تركيز الدهون باستخدام 0.1 عازلة ملي برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). نقل العينات إلى أنبوب الطرد المركزي (2 مل).
  2. وضع الأنبوب في حمام الماء الساخن، ورفع درجة الحرارة تدريجيا 25-70 درجة مئوية. زيادة درجة الحرارة بمعدل 1 ° C / دقيقة هنا.
  3. جمع قسامات (10 ميكرولتر) في نقاط مختلفة في درجة الحرارة (27، 32، 37، 39، 41،43، 45، 52، 57، 62، 67 و 70 درجة مئوية).
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 2٪ تريتون X-100-2 مل قسامة من حل liposomal لهضم الجسيمات الشحمية لمدة 10 دقيقة في RT وتحقيق الإفراج الكامل للcalcein.
  5. نقل 200 ميكرولتر من الحل liposomal إلى كل بئر في صفيحة 96 جيدا وقياس كثافة مضان من العينات التي تم جمعها باستخدام قارئ مضان صفيحة. الإثارة وانبعاث موجات من calcein هي 480 و 515 نانومتر على التوالي.
  6. أخذ كثافة مضان من تريتون X-100 عينة يعامل إطلاق 100٪، وحساب النسبة المئوية للcalcein صدر في كل نقطة زمنية، وذلك باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-1
    قدم هو كثافة مضان من الحل في نقطة زمنية معينة. ط F و F س هي تطبيع كثافة مضان الأولية والنهائية من الحل على التوالي.

4. Calcein إعادةتأجير من الليبوزومات مع ليزر نابض

  1. نقل 100 ميكرولتر حل الحويصلية إلى كفيت الكوارتز ووضعه في حامل كوفيت. استخدام نابض الثانية: YAG الليزر مع مدة نبضة من 6 NSEC في 532 الطول الموجي نانومتر كمصدر للضوء. استخدم ما يلي المعلمات ليزر - معدل التكرار: 1 هرتز؛ كثافة طاقة الليزر: 1 ميغا جول / سم 2. شعاع قطره: 0.5 مم.
  2. توجيه شعاع ليزر موازى من خلال كفيت بحيث يمر الضوء من خلال حل الحويصلية وجمع قسامات بعد مختلف البقول.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من 2٪ تريتون X-100-2 مل قسامة من حل liposomal لهضم الجسيمات الشحمية لمدة 10 دقيقة في RT وتحقيق الإفراج الكامل للcalcein.
  4. النظر calcein حساس للضوء، ويمكن أن يكون ابيض خلال التجربة الليزر، قبل قياس تأثير تبييض ليزر نابض على حل calcein لتطبيع البيانات من الإفراج الحويصلية.
    1. على وجه التحديد، فضح حل calcein (60 ملم) إلى واي ليزر نابضتردد التاسع من 1 هرتز لمدة متفاوتة نبض الأرقام (0، 25، 50 و 100). قياس كثافة مضان من calcein مع الإثارة وانبعاث موجات من 480 و 515 نانومتر على التوالي، وذلك قبل وبعد التعرض لليزر.
    2. حساب كمية تبيض (كثافة مضان من calcein قبل كثافة الليزر التعرض / مضان من calcein بعد عدد معين النبض). استخدام هذا العامل لتطبيع القيم التي تم الحصول عليها من عينات الحويصلية بضرب كثافة مضان من الجسيمات الشحمية مع عامل.
  5. قياس كثافة مضان من العينة التي تم جمعها باستخدام قارئ مضان صفيحة في الإثارة وانبعاث موجات في 480 و 515 نانومتر على التوالي.
  6. أخذ كثافة مضان من تريتون X-100 عينة يعامل إطلاق 100٪، وحساب النسبة المئوية للcalcein صدر في كل عدد النبض، وذلك باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-2
    قدم هو كثافة مضان من الحل في عدد النبض تعطى بعد التطبيع. ط F و F س هي تطبيع كثافة مضان الأولية والنهائية من الحل على التوالي.

5. قياس النبضات الضغط

  1. وضع 100 ميكرولتر من العينة على شريحة مجهرية وتعيين تركيز الليزر على العينة.
  2. تزج مائي إبرة (قطر 1 ملم و 450 حساسية نيفادا / باسكال) إلى الحل.
    تحذير: يجب ألا تكون مضيئة ومائي بواسطة ضوء الليزر لتجنب الضرر.
  3. أشرق العينة مع ليزر نابض مع اختلاف الأرقام النبض (0-100) والطاقة النبض (20-160 μJ / نبض).
  4. تسجيل إشارات الضغط باستخدام الذبذبات الرقمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم إعداد الجسيمات الشحمية باستخدام تقنية رقيقة فيلم الترطيب التقليدية مع DPPC، MPPC وDSPE-PEG2000 في نسبة المولي من 86: 10: 4 أو 7.95: 0.65: 1.39 ملغ / مل 12 حجم الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية أمر بالغ الأهمية لتحديد الضوء للحرارة كفاءة التحويل خلال التجربة الإثارة ليزر التالية. أصغر حجم من الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية، العالي كفاءة transducing. وقد تم اختيار 13 وهكذا 5 نانومتر الاتحاد الافريقي مصادر القدرة الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

رقيقة ترطيب الفيلم هو الأسلوب التقليدي لإعداد الجسيمات الشحمية. استخدمت المذيبات العضوية (كلوروفورم في هذه الحالة) أولا بحل الدهون ومن ثم إزالتها في المبخر الدوار عند 37 درجة مئوية لتوليد طبقة رقيقة الدهون في القارورة. كان رطب هذا الفيلم الدهون مع محلول مائي يحتوي على 60 ملي calcein و 5 نانومتر الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية. أثناء عملية الترطيب، والحفاظ على درجة الحرارة حوالي 50 درجة مئوية، وكانت قارورة تحريكها باستمرار عن طريق تدوير القارورة. المفتاح في هذه الخطوة هو اختي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وأعلن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بحوث العلمية الشق 1 من سنغافورة وزارة التربية والتعليم (RG 64/12 إلى CX) ومعهد جامعة تايوان الوطنية-نورث وسترن من النانوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-Dipalmitoyl-sn< / em>-glycero-3-phosphocholine (DPPC)AvantiPolar Lipids (ألاباما ، الولايات المتحدة)مسحوق 850355P، يحفظ عند -20 درجة ؛ C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn< em>-glycero-3-phosphocholine (MPPC)AvantiPolar Lipids (ألاباما ، الولايات المتحدة)مسحوق 855675P، يحفظ عند -20 درجة ؛ C
1،2-distearoyl-sn< / em>-glycero-3-phosphoethanol-amine-N< / em>-[ميثوكسي(بولي إيثيلين جلايكول)-2000] (ملح الأمونيوم) (DSPE-PEG2000) AvantiPolar Lipids (ألاباما ، الولايات المتحدة)مسحوق 880120P، يحفظ عند -20 درجة ؛ جسيمات
النانو الذهبيةC سيجما ألدريتش752568-100 مل5   ؛ جسيمات نانومتر ، استقرت عند 0.1 & nbsp ؛ mM PBS
CalceinSigma AldrichC0875-10g60  ملي مولار ، درجة الحموضة 7.4 (معدلة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم) محلول
ملحي مخزن الفوسفات (PBS)سيجما ألدريتشP54930.1 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.4
ماء مقطر مزدوجنظام تنقية
تريتون X100 & nbsp ؛  سيجما ، علوم الحياةX-100لتعطيل الجسيمات الشحمية لحساب التغليف الكلي
Rotavapor   ؛  Buchi (سويسرا)R 210يستخدم لإعداد Lipososme
حمام التدفئةBuchi (سويسرا)B 491يستخدم لإعداد Lipososme
وحدة تحكم الفراغ   ؛  بوتشي (سويسرا)V-850تستخدم لتحضير الشحم
مضخة فراغبوتشي (سويسرا)V-700تستخدم لتحضير الشحم
حمام إعادة التدوير مع وحدة التحكم في درجة الحرارةPolyscienceالمستخدمة لإعداد الشحم
تجميع الطارد الصغير مع كتلة التسخين   ؛Avanti Polar Lipids (ألاباما ، الولايات المتحدة)610000تستخدم لبثق المحاقن الشحمية
، 1,000 &# 956 ؛ لAvanti Polar Lipids (ألاباما ، الولايات المتحدة)610017تستخدم لبثق الجسيمات الشحمية
غشاء مرشح البولي كربونات ، 200 & nbsp ؛ nmWhatmann800281يستخدم لبثق الجسيمات الشحمية
دعمAvanti Polar Lipids (ألاباما ، الولايات المتحدة)610014يستخدم لبثق الجسيمات الشحمية
PD 10 تحلية المياه ، Sephadex G-25 متوسطGE للرعاية الصحية ، علوم الحياة17-0851-01تستخدم لتنقية الجسيمات الشحمية
الطرد المركزي   ؛  أجهزة الطرد المركزي لمختبر سيجما3K30تستخدم لتركيز المحلول الشحمي   ؛
الدوارسيجما19777-Hيستخدم لتركيز المحلول الشحمي  
Zetasizer   Nano ZS Malvernيستخدم لتحديد حجم الجسيمات الشحمية ومقياس
الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجيةShimadzuUV-2450يستخدم لقياس امتصاص العينات
مقياس الطيف الفلوري الفلوري   ؛  الأجهزة الجزيئيةSpectraMax M5تستخدم لقياس انبعاث التألق للعينات
Nd: YAG LaserNewWave Research532 نانومتر ؛ الطاقة القصوى: 17   ميجي ؛ العرض: 406   nsec. تستخدم لإشعاع العينة
HNR HydrophoneONDAHNR-1000قطر 1 مم وحساسية 450 nV / Pa ، نطاق تردد العمل المناسب: 0.25-10 & nbsp ؛ ميغاهيرتز; المعايرة: 50   مللي فولت / بار. تستخدم لقياس الإشارات الصوتية
منظار الذبذبات الرقميLECORY - Wave Runner 64Xi-Aالتردد: 600 ميجا هرتز ؛ معدل العينة الأقصى: 10   ؛ جي إس/ثانية (عند قناتين)؛ تستخدم لتسجيل الإشارات الصوتية المقاسة
المياه ميلي دي مرشح

المراجع

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796(2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

توليف الذهب الجسيمات النانوية الليبوزومات المتكاملة صور متجاوبة وقياس تلك Microbubble التجويف على نبض الليزر الإثارة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.