يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

18.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53620

⸱

يناير 27, 2016

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا هنا مقايسة وذلك بربط تحديد الأدينين DNA ناقلة الميثيل (DamID) الى ارتفاع التسلسل الإنتاجية (DamID وما يليها). يوفر هذا الأسلوب تحسين دقة أعلى وأوسع نطاق الدينامية، ويسمح تحليل البيانات DamID وما يليها بالاشتراك مع غيرها من البيانات التسلسل إنتاجية عالية مثل رقاقة وما يليها، RNA وما يليها، الخ

الملخص

يعد اختبار تحديد ميثيل ترانسفيراز الأدينين (DamID) طريقة قوية للكشف عن تفاعلات البروتين والحمض النووي محليا وعلى مستوى الجينوم. إنه نهج بديل للترسيب المناعي للكروماتين (ChIP). بروتين اندماج معبرا يتكون من البروتين محل الاهتمام والإشريكية القولونية يمكن أن يؤدي ميثيل ميثيل الأدينين إلى الحمض النووي بكتريا قولونية في ميثيل قاعدة الأدينين في أشكال GATC بالقرب من مواقع تفاعلات البروتين والحمض النووي. يمكن بعد ذلك تضخيم شظايا الحمض النووي الميثيل للأدينين واكتشافها على وجه التحديد. يكتشف اختبار DamID الأصلي المواقع الجينومية لشظايا الحمض النووي الميثيلية عن طريق التهجين إلى المصفوفات الدقيقة للحمض النووي ، والتي تقتصر على توافر المصفوفات الدقيقة وكثافة المجسات المحددة مسبقا. في هذه الورقة ، نبلغ عن البروتوكول التفصيلي لدمج تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية في DamID (DamID-seq). يتيح العدد الكبير من القراءات القصيرة التي تم إنشاؤها من DamID-seq اكتشاف وتوطين تفاعلات البروتين والحمض النووي على مستوى الجينوم بدقة وحساسية عالية. لقد استخدمنا اختبار DamID-seq لدراسة تفاعلات الجينوم والصفيحة النووية (NL) في خلايا الثدييات ، ولاحظنا أن DamID-seq يوفر دقة عالية ونطاقا ديناميكيا واسعا في الكشف عن تفاعلات الجينوم و NELL. يتيح نهج DamID-seq فحص ارتباطات NL داخل الهياكل الجينية ويسمح بمقارنة خرائط تفاعل الجينوم و NL مع البيانات الجينومية الوظيفية الأخرى ، مثل ChIP-seq و RNA-seq.

المقدمة

DNA تحديد الأدينين ناقلة الميثيل (DamID) 1،2 هو وسيلة للكشف عن التفاعلات DNA البروتين في الجسم الحي وغير نهج بديل للمناعي لونين (رقاقة) 3. ويستخدم كمية قليلة نسبيا من الخلايا و لا يتطلب الكيميائية عبر ربط البروتين مع الحمض النووي أو الأجسام المضادة محددة للغاية. هذا الأخير هو مفيدة بشكل خاص عندما فضفاضة أو غير مباشر ويرتبط البروتين الهدف مع DNA. وقد استخدم DamID بنجاح لرسم خريطة للمواقع الربط من مجموعة متنوعة من البروتينات بما في ذلك البروتينات المغلف النووي 10/04، لونين المرتبطة البروتينات 11-13، لونين تعديل الانزيمات 14، عوامل النسخ وشارك في العوامل 15-18 والأجهزة رني 19. طريقة قابلة للتطبيق في الكائنات متعددة بما في ذلك S. الخباز 13، S. pombe 7، C. ايليجانس 9،17، D. البطن 5،11،18،20، A. thaliana 21،22 فضلا عن الماوس والخلايا البشرية خطوط 6،8،10،23،24.

واستند تطوير فحص DamID على كشف محدد من شظايا الحمض النووي ميثليته الأدنين في الخلايا حقيقية النواة التي تفتقر الأدينين الذاتية مثيلة 2. بروتين الانصهار أعرب، التي تتكون من بروتين ملزمة DNA من الفائدة وE. القولونية DNA الأدينين ناقلة الميثيل (السد)، ويمكن ميثيل قاعدة الأدينين في تسلسل GATC التي هي في القرب المكاني (الأهم في حدود 1 كيلو بايت وتصل إلى ما يقرب من 5 كيلو بايت) إلى مواقع الربط من البروتين في الجينوم 2. شظايا الحمض النووي تعديل يمكن أن تتضخم على وجه التحديد وتهجين لالمجهرية للكشف عن مواقع الربط الجينومية من البروتين من الفائدة 1،25،26. وهذه الطريقة DamID الأصلي محدودة بسبب توافر المجهرية وكثافة تحقيقات محددة سلفا. لذا قمنا متكاملة إنتاجية عالية التسلسل فيلDamID 10 وعينت الأسلوب كما DamID وما يليها. عدد كبير من باختصار يقرأ ولدت من DamID وما يليها تمكن التعريب الدقيق للتفاعلات-DNA البروتين على نطاق الجينوم. وجدنا أن DamID وما يليها توفير دقة أعلى ومجموعة ديناميكية أوسع من DamID من قبل ميكروأري لدراسة الجينوم النووي الصفيحة (NL) جمعيات (10). وتسمح هذه الطريقة تحسن التحقيق الجمعيات NL داخل هياكل الجين 10 ويسهل مقارنات مع غيرها من البيانات التسلسل إنتاجية عالية، مثل رقاقة وما يليها وRNA وما يليها.

بروتوكول DamID تسلسل وصفها هنا وضعت في البداية لرسم خرائط الجينوم NL الجمعيات 10. ولدت لنا بروتين الانصهار بواسطة تشغيل ربط الماوس أو لامين البشري B1 إلى E. القولونية DNA الأدينين ناقلة الميثيل واختبار البروتوكول في 3T3 الخلايا الليفية الماوس الجنينية، C2C12 الماوس myoblasts 10 و IMR90 الليفية رئة الجنين الإنسان (بيانات غير منشورة). في هذا البروتوكول، ونحن نبدأ مع جonstructing النواقل والتعبير عن البروتينات الانصهار سد-المربوطة عن طريق العدوى lentiviral في خلايا الثدييات 24. المقبل، وصفنا بروتوكولات مفصلة لتضخيم شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين وإعداد مكتبات التسلسل الذي ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق في الكائنات الحية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. جيل والتعبير عن البروتينات الانصهار والسد الحرة البروتينات

  1. البروتين استنساخ المصالح في ناقلات DamID.
    1. تضخيم [كدنا من البروتين ذات الاهتمام (POI) باستخدام عالية الدقة DNA بوليميريز المطلوب والاشعال المناسبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تجريبيا تحديد شروط التضخيم المثلى لضمان التضخيم السليم للتدرج.
    2. تشغيل agarose هلام وتنقية تضخيم [كدنا من POI من قبل مجموعة استخراج الهلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. استنساخ [كدنا من POI في ناقلات pDONR201 باستخدام BP Clonase الثاني وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. استنساخ [كدنا من POI من ناقلات المانحة في ناقلات جهة pLGW-RFC1-V5-EcoDam أو pLGW-EcoDam-V5-RFC1 جهة ناقلات 27 باستخدام LR Clonase الثاني وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، اعتمادا على الاتجاه المطلوب من الصمامات POI إلى N-محطة أو عشرالبريد C-محطة من E. القولونية DNA الأدينين ناقلة الميثيل (EcoDam) 27.
    5. التحقق من قبل تسلسل أن كدنا] المستنسخة لديها التسلسل الصحيح والنماذج في إطار الاندماج في EcoDam.
  2. توليد الأسهم lentiviral.
    1. توليد الأسهم lentiviral معربا عن سد-V5-POI وV5-السد (من ناقلات pLGW-V5-EcoDam 27) باستخدام نظم التعبير lentiviral. استخدم الإجراء ترنسفكأيشن إلى الأمام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      1. استخدام الخلايا 293T وlipofection لتوليد الأسهم lentiviral وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لترنسفكأيشن.
      2. تتضمن الخطوة مرشح 0.45 ميكرومتر PVDF.
  3. تصيب الخلايا مع الفيروسة البطيئة.
    1. قبل يوم واحد العدوى (يوم 0)، تمر الخلايا الملتصقة مثقف في وسائل الإعلام نمو مناسب لهذا النوع من الخلايا إلى 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة باستخدام وسائط النمو نفسه من دون مضادات حيوية لتحقيق 50٪ التقاء في اليوم من العدوى. خلايا مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    2. في يوم من العدوى (يوم 1)، وإزالة 2 cryovials كل من سد-V5-POI وV5-سد supernatants lentiviral من -80 ° C الفريزر والمكان في 37 ° C حمام الماء لذوبان الجليد.
      1. إزالة وسائط النمو من خلايا واستبدالها مع 0.5 مل من وسائط النمو الطازجة بدون المضادات الحيوية.
      2. إضافة 1 مل من الفيروسة البطيئة إذابة إلى كل بئر (2 الآبار مع V5 السدود والآبار 2 مع سد-V5-POI). إضافة 1 مل من وسائط النمو دون المضادات الحيوية إلى 2 المتبقية آبار هذا سيكون بمثابة سيطرة سلبية. يهز بلطف لوحة 6 جيدا لخلط ووضع مرة أخرى في 37 ° C حاضنة O / N.
    3. بعد يوم من العدوى (يوم 2)، وإزالة تعليق الفيروسية من الخلايا واستبدالها مع 2 مل وسائط النمو دون المضادات الحيوية. خلايا المكان مرة أخرى في C الحاضنة 37 درجة لمدة 48 ساعة.
  4. عزل gDNA.
    1. وسائل الإعلام نضح من كل بئر وديخلايا تاش باستخدام 250 ميكرولتر 0.05٪ التربسين-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    2. غسل الخلايا قبالة اللوحة مع 1 مل وسائط النمو والخلايا ماصة من كل بئر في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    3. غسل الخلايا مكعبات مع 500 ميكرولتر PBS وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
    4. الخلايا resuspend مكعبات في 200 ميكرولتر PBS.
    5. عزل gDNA من قبل مجموعة الدم والأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل gDNA في 200 العازلة ميكرولتر AE وتحديد تركيز من خلال قياس OD 260 باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: gDNA من الخلايا المصابة غير المصابة أو وهمية يمكن أن تكون معزولة عن ضوابط السلبية. يعجل gDNA لتركيزات أعلى للتخزين على المدى الطويل.
      1. إضافة 3 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪ و 0.1 حجم 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.5)، وتخلط بواسطة قلب أنابيب 4-6 مرات.
      2. مخزن في -20 درجة CO / N.
      3. الطرد المركزي في 16000 سز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      4. إزالة طاف بعناية. غسل الكريات مع 70٪ (حجم / حجم) الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      5. إزالة بعناية الايثانول والسماح للهواء الجاف الكريات لمدة 3 دقائق على RT.
      6. حل gDNA في T 10 E 0.1 (7.5 درجة الحموضة) إلى ما يقرب من 1 ميكروغرام / ميكرولتر. تجمع gDNA من كل عينة تجريبية أو سيطرة سلبية وقياس تركيز. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

2. أسهب الأدينين ميثليته-شظايا الحمض النووي

  1. ملخص gDNA مع DpnI الذي يمر فقط GATCs-ميثليته الأدينين.
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع 2.5 ميكروغرام gDNA، 1 ميكرولتر 10X العازلة، 0.5 ميكرولتر DpnI (20 U / ميكرولتر) وملء مع H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 10 ميكرولتر. لكل عينة gDNA، وإعداد ثلاثة ردود الفعل - واحدة من دون DpnI ("لا DpnI"، استبدل DpnI مع 0.5 ميكرولتر H 2 O) واثنين ثإيث DpnI ("مع DpnI").
    2. ملخص O / N عند 37 درجة مئوية وتعطيل DpnI في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. Ligate محولات DamID.
    1. إعداد محولات DamID.
      1. resuspend كل من الاثنين DamID محول oligos 24 في H 2 O إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر.
      2. الجمع بين كميات متساوية من اثنين DamID محول oligos، ومزيج وضع في أنبوب مغلق بإحكام. ختم أنبوب مع parafilm، والجلوس في رفوف وضعها في كوب مملوء بالماء عند 90 ° C. الحفاظ على مستوى الماء أقل من الحد الأقصى للأنبوب (لتجنب الحصول على الماء في أنبوب) ولكن فوق سطح مزيج بنسبة ضئيلة.
      3. دع الماء البارد لRT حتى يصلب محولات ببطء.
      4. قسامة محولات صلب (50 ميكرومتر) وتخزينها في -20 ° C.
    2. إعداد رد فعل على الجليد. في كل أنبوب من 2.1.2، إضافة 6.2 ميكرولتر H 2 O، 2 ميكرولتر 10X العازلة ربط، 0.8 ميكرولتر 50 ميكرومتر DamID الإعلانaptors (إذابة على الجليد) و 1 ميكرولتر T4 DNA يغاز (5 U / ميكرولتر). الحجم الكلي هو 20 ميكرولتر. في واحد من اثنين "مع DpnI" الأنابيب، استبدال يغاز مع 1 ميكرولتر H 2 O ("لا يغاز") لاحظ أن كل عينة gDNA اثنين ضوابط السلبية - "لا DpnI" و "لا يغاز".
    3. Ligate O / N في 16 ° C ووقف نشاط يغاز عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. ملخص DNA مع DpnII لتدمير شظايا التي تحتوي على GATCs unmethylated.
    1. إعداد رد فعل على الجليد. في كل أنبوب من 2.2.3، إضافة 24 ميكرولتر H 2 O و 5 ميكرولتر 10X DpnII العازلة و1 ميكرولتر DpnII (10 U / ميكرولتر). الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر.
    2. ملخص عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة وتعطيل DpnII عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. تضخيم شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين.
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع 5 ميكرولتر DpnII الهضم من 2.3.2، 5 μل 10X العازلة PCR، 12.5 ميكرولتر 5 ميكرومتر DamID PCR التمهيدي 24، 4 ميكرولتر 10 ملي dNTP المزيج، 1 ميكرولتر 50X مزيج البلمرة و 22.5 ميكرولتر H 2 O. الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر.
    2. تشغيل PCR على النحو التالي: 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 5 دقائق، 68 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 4 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 1 دقيقة، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. 17 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 1 دقيقة، 68 ° C لمدة 2 دقيقة.
    3. تحليل 5 منتجات ميكرولتر PCR من كل رد فعل على هلام الاغاروز 1٪. يجب أن تظهر منتجات PCR كما مسحة يتراوح بين 0.2 و 2 كيلو بايت (الشكل 2). يجب أن يكون التحكم "لا DpnI" و "لا يغاز" لا أو بوضوح أقل التضخيم.
    4. إذا كانت النتيجة من الخطوة 2.4.3 مرضية، كرر الخطوات 2.4.1-2.4.3 مع اثنين أو ثلاثة ردود الفعل للعينة التجريبية ورد فعل واحد لكل اثنين من الضوابط السلبية.
    5. تجمع وتنقية المنتجات PCR من نفسالعينة التجريبية باستخدام أدوات تنقية PCR أو المرحلة الصلبة عكسية الشلل (سبري) الخرز وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. لا تنقي "لا DpnI" أو ضوابط "لا يغاز". أزل الحمض النووي مع العازلة EB.
    6. قياس تركيز الحمض النووي تنقيته عن طريق قياس OD 260 باستخدام مقياس الطيف الضوئي، التي ينبغي أن تكون نحو 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر أو أعلى. جمع ما لا يقل عن 10 ميكروغرام DNA لكل عينة. إذا باستخدام أدوات تنقية PCR، وتنقية كل 50 ميكرولتر المنتجات PCR مع عمود واحد، أزل في 30 العازلة ميكرولتر EB وتجميع eluates.
  5. ملخص DNA مع DpnII لمنع الاشعال DamID PCR من أن التسلسل.
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع DNA النقي 5 ميكروغرام من 2.4.6، 5 ميكرولتر 10X DpnII العازلة، 1 ميكرولتر DpnII (10 U / ميكرولتر) وملء مع H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 ميكرولتر. إعداد اثنين أو ثلاثة من ردود الفعل لكل عينة.
    2. الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعةوتعطيل DpnII عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    3. تجمع وتنقية هضم من نفس العينة مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل الحمض النووي مع العازلة EB.
    4. قياس تركيز الحمض النووي المنقى الذي ينبغي أن يكون حول 0.06 ميكروغرام / ميكرولتر أو أعلى. جمع ما لا يقل عن 6 ميكروغرام DNA لكل عينة. إذا باستخدام أدوات تنقية PCR، وتنقية كل 50 ميكرولتر الهضم مع عمود واحد، أزل في 30 العازلة ميكرولتر EB وتجميع eluates.

3. إعداد مكتبة للإنتاجية عالية التسلسل

  1. جزء DNA
    1. تجريبيا تحديد الوقت الهضم المناسب لكل دفعة جديدة من dsDNA Fragmentase. كما قد يقلل من نشاط انزيم مع مرور الوقت، كرر الاختبار قبل تنفيذ تجربة جديدة. لحفظ الحمض النووي من 2.5.4 لتفتيت الفعلي، استخدم تنقية المنتجات PCR الميثيل من 2.4.6 أو DNA اضافية من experime السابقاليلة في هذه الخطوة.
      1. إعداد مزيج الرئيسي مع DNA 6 ميكروغرام، 12 ميكرولتر 10X Fragmentase العازلة وملء مع H 2 O إلى الحجم الإجمالي من 114 ميكرولتر.
      2. دوامة القارورة الأسهم Fragmentase لمدة 3 ثانية، إضافة إلى 6 ميكرولتر مزيج الرئيسي ودوامة مزيج الرئيسي لمدة 3 ثانية. الحجم الكلي هو 120 ميكرولتر.
      3. قسامة 20 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لكل من 5 أنابيب جديدة. احتضان جميع أنابيب 6 إلى 37 درجة مئوية لمدة 5-55 دقائق على زيادة قدرها 10 دقيقة. إضافة 5 ميكرولتر 0.5 M EDTA لوقف التفاعل.
      4. تحليل 12.5 الهضم ميكرولتر (0.5 ميكروغرام DNA) من كل رد فعل وكذلك 0.5 ميكروغرام DNA عسر الهضم على هلام الاغاروز (الشكل 3). تحديد الحد الأدنى من الوقت (T 0.2kb) اللازمة لهضم معظم مسحة إلى حوالي 0.2 كيلو بايت. 6 حدد فترات زمنية بين 5 دقائق و T 0.2kb (بما في ذلك 5 دقائق وT 0.2kb) مع زيادات متساوية للتجزئة الفعلي.
    2. إعداد fragmen الفعليةالكساء كما هو موضح في 3.1.1.1-3.1.1.3. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لفترات زمنية تحددها في 3.1.1.4.
    3. تجمع 6 ردود الفعل وتنقية هضم مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 51 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 50 ميكرولتر.
  2. إصلاح ينتهي من الحمض النووي مجزأة
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.1.3، 25 ميكرولتر H 2 O، 10 ميكرولتر 10X T4 DNA يغاز العازلة مع 10 ملي ATP، 4 ميكرولتر 10 ملي مزيج dNTP، 5 ميكرولتر DNA T4 البلمرة (3 U / ميكرولتر) ، 1 ميكرولتر Klenow DNA البلمرة (5 U / ميكرولتر)، و 5 ميكرولتر T4 كيناز عديد النوكليوتيد. الحجم الكلي هو 100 ميكرولتر. تخلط جيدا مع ماصة. تجنب رغوة وفقاعات.
    2. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 33 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 32 & #181؛ ل.
  3. إضافة "A" يتدلى
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.2.3، 5 ميكرولتر 10X Klenow العازلة، 10 ميكرولتر 1 ملي dNTP، و 3 ميكرولتر Klenow (3 '→ 5' exo-) (5 U / ميكرولتر). الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر. تخلط جيدا مع ماصة. تجنب رغوة وفقاعات.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 22 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 21 ميكرولتر.
  4. محولات التسلسل Ligate
    1. إعداد محولات تسلسل 28.
      1. resuspend كل محول بنسبة ضئيلة إلى تركيز 100 ميكرومتر في 10 ملي تريس، الكلور (درجة الحموضة 7.8)، 0.1 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة) و 50 ملي كلوريد الصوديوم.
      2. خلط كميات متساوية من محول عالمي 28 ومحول مفهرسة 28.
      3. يصلب محولات في cycler الحرارية بما يليالبرنامج: 95 ° C لمدة 2 دقيقة. 140 دورات لمدة 30 ثانية ابتداء من 95 درجة مئوية، وتنخفض بنسبة 0.5 ° C كل دورة. عقد في 4 درجات مئوية.
      4. محولات قسامة وتخزينها في -20 ° C.
    2. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.3.3، 25 ميكرولتر 2X العازلة ربط، 1.5 ميكرولتر 50 ميكرومتر صلب محولات التسلسل (إذابة على الجليد) من 3.4.1.4 و 2.5 ميكرولتر DNA T4 يغاز. تخلط جيدا مع ماصة. تجنب رغوة وفقاعات. إذا كان المطلوب تسلسل متعددة، استخدام محول مفهرسة مختلفة لكل عينة.
    3. في احتضان RT لمدة 1 ساعة.
    4. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 24 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 23 ميكرولتر.
  5. تحويل محولات على شكل Y لdsDNA لتمكين بدقة تحديد جزء DNA أحجام 28
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.4.4، 12.5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 1 28، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 2 28، 1.5 ميكرولتر dNTP 10MM، 10 ميكرولتر 5X PCR العازلة و 1 ميكرولتر البلمرة DNA (1 U / ميكرولتر).
    2. تشغيل PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 5 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 72 ° C لمدة 1 دقيقة. 4 درجات مئوية على الانتظار.
    3. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 11 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 10 ميكرولتر.
  6. حجم اختيار المكتبة
    1. إعداد 2٪ agarose هلام مع العازلة 1X TAE. إضافة إيثيديوم بروميد (تنبيه!) لتركيز النهائي من 500 نانوغرام / مل عندما يبرد ذاب حل تاي-الاغاروز لتجنب استنشاق بروميد إيثيديوم. تأكد من أن لديك ما يكفي الممرات لجميع العينات، سلم DNA وممرات فارغة.
    2. إضافة 8 ميكرولتر صبغ 6X تحميل لشطافة من 3.5.3.
      3. <لى> إعداد سلم DNA عن طريق خلط 1 كيلوبايت زائد سلم DNA (1.0 ميكروغرام / ميكرولتر)، 6X صبغ التحميل وH 2 O في نسبة 1: 1: 4.
    3. تحميل 6 ميكرولتر سلم DNA، وعينات من الحمض النووي 3.6.2 وسلم 6 ميكرولتر آخر، كل في ممر منفصل ومع واحد على الأقل ممر فارغ من عينات المجاورة / سلالم.
    4. تشغيل هلام في 120 V لمدة 60 دقيقة.
    5. عرض الجل على نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية (تقليل زمن التعرض للأشعة فوق البنفسجية). ارتداء النظارات الواقية ودرع الوجه. تأكد من واحد على الأقل من سلالم DNA تعمل بشكل جيد مع تباعد المناسب (ما يكفي لاستئصال 3 شرائح هلام) بين 300 و 400 نقطة أساس العصابات مضت. تباعد ضيق يزيد من صعوبات في استئصال شرائح هلام متعددة، بينما تباعد واسعة يزيد من حجم شرائح هلام رفعه.
    6. استخدام مشرط جديد أو شفرة حلاقة لكل حارة. المكوس ثلاث شرائح رقيقة جل ما بين 300 و 400 نقطة أساس من كل حارة (الشكل 4) ووضعها في كل أنبوب microcentrifuge. الحفاظ على حجم كل الصورة هلامالقمل عند أدنى مستوى ممكن (<100 ميكرولتر).
    7. قياس حجم كل شريحة هلام (1 ميكرولتر هلام يزن حوالي 1 ملغ)، إضافة وحدات 6X العازلة QG واحتضان عند 50 ° C.
    8. دوامة الخليط QG جل كل 2-3 دقائق حتى يذوب شريحة هلام تماما. إضافة وحدات جل 2X من الأيزوبروبانول وتخلط.
    9. من هذه الخطوة، اتبع البروتوكول من مجموعات استخراج الهلام. أزل DNA العازلة في 51 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 50 ميكرولتر.
  7. إثراء محول تعديل تسلسل الحمض النووي شظايا
    1. تحسين عدد من دورات PCR 29.
      1. إعداد رد فعل على الجليد مع 1 ميكرولتر شطافة من 3.6.10، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 1 28، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 2 28، 7 ميكرولتر H 2 O و 10 ميكرولتر SYBR الخضراء Supermix. الحجم الكلي هو 20 ميكرولتر.
      2. تشغيل QPCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 20 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وقراءة اللوحة.
      3. تحليل البيانات باستخدام برامج التحليل QPCR وتحديد دورة الكمي (CQ) أو دورة عتبة (CT) لكل عينة باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. تواصل مع العينات التي لديها CQ / ط م ≤ 14. استخدام الأقصى CQ (CQ 0) ناقص 1 (مقربا إلى العدد الصحيح الأعلى الذي يليه) بصيغتها النهائية PCR عدد دورة (N PCR).
      4. ضبط كميات من قوالب DNA بحيث يتم تضخيم عينات مختلفة لكميات متساوية تقريبا بعد تشغيل نفس عدد دورات PCR. استخدام 8 قالب ميكرولتر لعينة وفقا لأعلى CQ (CQ 0)، وحساب حجم القالب من عينات أخرى مع الصيغة التالية:
        المجلد الأول = 8 × 1.8 CQ ط -Cq 0
    2. إعداد ردود الفعل PCR على الجليد مع وحدات التخزين قالب تحسب من 3.7.1.4: 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 1 28، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 2 28، 1.5ميكرولتر 10 ملي dNTP، 10 ميكرولتر 5X العازلة، 1 ميكرولتر البلمرة DNA (1 U / ميكرولتر) وملء مع H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 ميكرولتر.
    3. تشغيل PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ دورات N PCR (تحديد في 3.7.1.3) من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 72 ° C لمدة 1 دقيقة. 4 درجات مئوية على الانتظار.
    4. تحليل 5 منتجات ميكرولتر PCR في هلام الاغاروز 2٪ (الشكل 5A). وتشير واضحة الفرقة "واحدة" أن شظايا تضخيم الحمض النووي هي ضمن نطاق ضيق طول وأن مكتبة DNA يمكن أن تخضع لمزيد من التحليل.
    5. تكرار رد فعل واحد للحصول على عينات مختارة وتجمع المكتبات تضخيم الحمض النووي من نفس العينة.
    6. تنقية المكتبات DNA تم اختيارها لالتسلسل.
      1. إذا dimers التمهيدي / محول غير مرئية في 3.7.4، تنقية مكتبات الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 21 ميكرولتر EB. الشطافة النهائي ~ 20 ميكرولتر. إذا منشأة التسلسل المستخدم لديه تعليمات محددة على شطف العازلة، والحجم النهائي، وما إلى ذلك، وإعداد العينات وفقا لذلك.
      2. إذا dimers التمهيدي / محول واضحة للعيان في 3.7.4، تنقية المكتبات على النحو التالي.
        1. DNA تحميل من 3.7.5 وسلم DNA في 2٪ هلام الاغاروز الجاهزة. يمكن تنقية عينات كما هو موضح في 3.7.6.1 للحد من حجم أو يمكن تحميلها في الآبار متعددة. وضع الجل الاغاروز في نظام الطاقة المناسب. السماح للهلام لتشغيل لمدة 15 دقيقة.
        2. باستخدام نقل transilluminator المناسب، قطع الفرقة المطلوب مع نظيفة مشرط / الحلاقة لكل عينة ووضع شريحة جل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
        3. عزل DNA باستخدام أدوات استخراج الهلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع تعديلين: احتضان العازلة خليط QG-جل في خلاط الحرارية عند 37 درجة مئوية و 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة، وإضافة وحدات جل 2X من الأيزوبروبانول.
  8. إرسال المكتبات DNA النقاء إلى مرفق التسلسل. اتبع جميع المبادئ التوجيهية المرفق.
    ملاحظة: تحليل نوعية من قبل Bioanalyzer (الشكل 5B) يجب أن يتم تنفيذ قبل التسلسل من أجل تحديد مدى حجم الدقيق وتركيز مكتبة DNA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم التحقق من انصهار بروتين سد-V5-LMNB1 يشترك المترجمة مع البروتين الذاتية لامين B المناعي تلطيخ (الشكل 1).

التضخيم PCR الناجح لشظايا الحمض النووي ميثليته الأدنين هو خطوة رئيسية لDamID وما يليها. يجب أن العينات التجريبية تضخيم مسحة من 0،2-2 كيلو بايت في حين أن ضوابط السلبية (بدون DpnI، دون يغاز أو بدون قالب PCR) ينبغي أن يؤدي إلى عد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يجب فحص ما إذا كانت البروتينات الموسومة بالسد تحتفظ بوظائف البروتينات الداخلية قبل تجربة DamID-seq. يجب دائما تحديد التوطين تحت الخلوي لبروتينات الغلاف النووي الموسومة بالسد ومقارنته بتوطين البروتينات الذاتية. لدراسة عوامل النسخ ، يقترح فحص ما إذا كان بروتين اندماج السد يمكنه إنقاذ وظائف البروتين الداخلي في تنظيم التعبير الجيني. يمكن إجراء هذا الاختبار الوظيفي في الكائنات الحية التي تتوفر فيها طفرات بالضربة القاضية من بروتينات ربط الحمض النووي الذاتية. نظرا لأن التقدم في هندسة الجينوم قد سمح بالقضاء على أي جين داخلي محل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور باس فان ستينسل على توفير متجهات تعبير الثدييات DamID. نشكر مركز ييل لتحليل الجينوم ومركز الجينوم في مركز الخلايا الجذعية بجامعة ييل على المشورة بشأن إعداد مكتبات NGS وتنفيذ تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية. تم دعم هذا العمل من خلال تمويل بدء التشغيل من كلية الطب بجامعة ييل ، ومنحة تطوير العلماء من جمعية القلب الأمريكية (12SDG11630031) ومنحة أولية من Connecticut Innovations، Inc. (13-SCA-YALE-15).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ViraPower أنظمة التعبير الفيروسي العصبيتقنيات الحياةK4950-00 و K4960-00 و K4970-00 و K4975-00 و K4980-00 و K4985-00 و K4990-00 و K367-20 و K370-20 و K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme MixLife Technologies11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme MixLife Technologies11791-020
DNeasy Blood & مجموعة المناديل (250)QIAGEN69506 أو 69504   ؛  
Gateway pDONR 201Life Technologies11798-014
293T خلايامجموعة الثقافة من النوع الأمريكيCRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمر < / a>Life Technologies25300-054
DMEM ، ارتفاع الجلوكوز ، تقنيات البيروفاتلايف11995-065
مصل الأبقار الجنينيSigmaF4135
علامة تجارية تريسليست حرجة
ماركة EDTAغير حرجة
200 علامة تجارية EtOHغير حرجة
Isopropanolليست حرجة
أسيتاتليست حرجة
DpnINew England BiolabsR0176بمحولات DamID العازلة
"AdRt" و "AdRb"تسلسلات تقنياتالمتوفرة في المرجع 24 ؛ لا توجد فسفرة للنهاية 5 أو 3 لمنع الربط الذاتي.
10481220001تزويد T4 DNA LigaseRoche Life Scienceبالمخزن المؤقت
DpnIINew England BiolabsR0543مزود بمخزن مؤقت
DamID PCR التمهيدي "AdR_PCR"تسلسلات تقنياتالمتوفرة في المرجع 24
حلول Deoxynucleotide (dNTP)New England BiolabsN0446100 mM لكل من dATP و dCTP و dGTP و dTTP
ميزة 2  639201 تزويد Polymerase MixClontechب 1Kb
Plus DNA LadderLife Technologies107870181.0 & micro ؛ ز /& مايكرو ؛ ل
طقم تنقية QIAquick PCRQIAGEN28104 أو 28106
MinElute PCR Purification KitQIAGEN28004 أو 28006لحجم شطف أقل من 30 وميكرو ؛ ل
حبات SPRI / Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880تطبيق خلط إضافي والمزيد من وقت الشطف إذا كان أقل من 40 & micro ؛ l يتم استخدام المخزن المؤقت للشطف
Buffer EBQIAGEN19086
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348مزود بمخزن مؤقت
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BiolabsB0202
T4 DNA PolymeraseNew England BiolabsM0203
DNA Polymerase I ، جزء كبير (Klenow)New England BiolabsM0210
T4 Polynuleotide KinaseNew England BiolabsM0201
Klenow Fragment (3 '&# 8594; 5' exo-)New England BiolabsM0212مزودة بمحولات تسلسل عازلة
تسلسلات تقنياتمتوفرة في المرجع 28
مجموعة الربطنيو إنجلاند بيولابسM2200المستخدمة في 3.4.3 ؛ مزود بمخزن سريع لتفاعل الربط وبرايمر تسلسل T4 DNA Ligase
1 و 2الحمض النووي المتكاملةالمتوفرة في المرجع 28
KAPA HiFi PCR KitKapa BiosystemsKK2101 أو KK2102المزود ب KAPA HiFi DNA Polymerase و 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer و 10 mM dNTP مزيج
الاغاروزSigma AldrichA4679
بروميدالإيثيديومسيجما ألدريتشE1510-10ML10 مجم / مل
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704 أو 28706
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725121 أو 1725122
علامة تجارية لمقياسليست حرجة
0.45 &# 956 ؛ m PVDF Filterالعلامة التجارية غير حرجة
25 مل ماركة Seringeغير حرجة
10 سم لوحاتالعلامة التجارية ليست حرجة
6-well لوحاتالأنسجة العلامة التجارية غير حرجة
S1000 Thermal CyclerBio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratoriesبالنسبة للعلامة التجارية qPCR
Vortex Mixerليست حرجة
سخان الكتلة الجافة أو العلامة التجارية Thermomixerليست حرجة
ماركةالدقيقة ليست حرجة
نظام الرحلان الكهربائي للهلام مع العلامة التجارية لإمداداتليست حامل مغناطيسي
حرجلتنقية الحمض النووي بخرز SPRI ؛ يجب أن تحتوي على أنابيب 1.5-2 مل ؛ العلامة التجارية ليست حرجة
الأشعة فوق البنفسجية transilluminatorالعلامة التجارية ليست حرجة
نظام الرحلان الكهربائي E-gelLife TechnologiesG6400 ، G6500 ، G6512ST
ماركة العلامة التجارية الصوديوم تم تزويد الحمض النووي المتكاملة الحمض النووي المتكاملة مجموعة الحمض النووي المتكاملة السريع السريع تسلسلات تقنيات الطيف الضوئي زراعة الأنسجة زراعة الطرد المركزي الطاقة

المراجع

  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
  3. Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
  4. Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
  5. Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
  6. Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
  7. Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
  8. Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
  9. Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21(2014).
  10. Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591(2013).
  11. Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  12. Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
  13. Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
  14. Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028(2013).
  15. Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
  16. Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
  17. Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399(2010).
  18. Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178(2004).
  19. Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
  20. Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
  21. Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
  22. Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
  23. Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
  24. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
  25. Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
  26. de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
  27. DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
  28. Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
  29. Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
  30. Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
  31. Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046(2011).
  32. Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
  33. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
  34. Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110(2014).
  35. Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452(2014).
  36. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
  37. Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  38. Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
  39. Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Bioanalyzer
DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.