مقالة منهجية

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

DOI:

10.3791/53638

⸱

يناير 25, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول الهضم الأنزيمي لجلد الفأر في وسط غني بالمغذيات متبوعا بفصل التدرج لعزل الكريات البيض. يمكن استخدام الخلايا المشتقة بهذه الطريقة في تطبيقات نهائية متنوعة. هذا بديل فعال واقتصادي ومحسن لآلات تفكك الأنسجة وبروتوكولات هضم الأنسجة الأكثر قسوة والتربسين والأنسجة القائمة على التباين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فصل جلد الفئران في معلق خلية واحدة أمرا ضروريا للتحليل الخلوي النهائي مثل توصيف الخلايا المناعية المتسللة في نماذج القوارض لالتهاب الجلد. هنا ، نصف بروتوكولا لهضم جلد الفأر في محلول غني بالمغذيات مع الكولاجيناز D ، متبوعا بفصل الخلايا المكونة للدم باستخدام تدرج كثافة متقطع. يمكن استخدام الخلايا التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة في الدراسات المختبرية ، والنقل في الجسم الحي ، وغيرها من التحليلات الخلوية والجزيئية النهائية بما في ذلك قياس التدفق الخلوي. يعد هذا البروتوكول بديلا فعالا واقتصاديا للمفككينات الميكانيكية باهظة الثمن ، وأعمدة الفصل المتخصصة ، وطرق الهضم الأكثر قسوة القائمة على التربسين والتباين ، والتي قد تضر بالجدوى الخلوية أو كثافة البروتينات السطحية ذات الصلة بتوصيف النمط الظاهري أو الوظيفة الخلوية. كما هو موضح هنا في بياناتنا التمثيلية ، أنتج هذا البروتوكول خلايا عالية البقاء ، ويحتوي على مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية ، ولم يكن له أي تأثير على سلامة بروتينات علامات السطح الشائعة المستخدمة في تحليل قياس التدفق الخلوي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم العثور على الأمراض الجلدية التي تتراوح بين التهاب الجلد التماسي، والأكزيما، الصدفية، التهاب النسيج الخلوي، والالتهابات الفطرية وخراجات لسرطانات الجلد غير القتامي لتكون من بين 50 الأمراض الأكثر انتشارا في جميع أنحاء العالم، ورابع السبب الرئيسي العالمي للأمراض غير المميتة في عام 2010 1. وفقا لذلك، والتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء أمراض الجلد المختلفة هي منطقة الضرورية ونشطة للبحث. وكانت نماذج القوارض مفيدة بشكل ملحوظ في فهم الأمراض الجلدية الالتهابية مثل التهاب الجلد التأتبي 2، 3 الصدفية، أو عدوى المكورات العنقودية الذهبية (4). يمكن البروتوكولات غير مكلفة وفعالة وبسيطة لعملية الهضم الأنزيمي من أنسجة الجلد الماوس توفر الاستعدادات من الخلايا التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب من أجل فهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الجلد. هنا، يتم وصف طريقة بسيطة واقتصادية لالأنزيمية ملخص من الجلد الماوسالأنسجة وعزل الجلد الكريات البيض التسلل التي يمكن استخدامها لزراعة الخلايا، في الجسم الحي نقل بالتبني، وتدفق تحليل cytometric والفرز أو دراسات التعبير الجيني. الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد تعليق خلية واحدة من الكريات البيض-التسلل الجلد مع بقاء الخلية عالية مع تقليل التكاليف المرتبطة عادة مع مجموعات كاشف العرف وdissociators الميكانيكية.

أنسجة الجلد طرق تفكك القائمة 5-7 قد يؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية وسلامة سطح علامة، أو تتطلب مجموعات انزيم العرف ومكلفة آلات تفكك النسيج 11/08. في حين أن هضم أذن الفأر أنسجة الجلد منتشر بشكل معقول 12-13، وهضم أنسجة الجلد الكيراتينية للغاية (على سبيل المثال من الجهة) يمكن أن يؤدي إلى الاستعدادات الخلية الملوثة مع كميات كبيرة من الحطام غير الخلوية. في دراسة حديثة، يهضم زيد وزملاؤه الماوس الجناح البشرة لمدة 90 دقيقة في 2.5 ملغ / مل dispase، FOLLOتزوجا قبل 45 دقيقة في 3 ملغ / مل كولاجيناز 7. في دراسة أخرى، استخدم هؤلاء الباحثون حضانات متعددة مع الهضم مجتمعة من 2.5 ساعة، بما في ذلك استخدام التربسين / EDTA، كولاجيناز الثالث، وdispase 5. لا ينصح استخدام التربسين لالأنزيمية الهضم الجلد، كما أظهرت المعاملة مع التربسين من مختلف الصانعين لتؤثر بشكل ملموس على سلامة بروتينات سطح الخلية في خلايا الثدييات 14-15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون dispase آثار كبيرة على قدرات التكاثري خلايا CD4 وCD8α T وتؤثر على وفرة سطح لا يقل عن 20 الجزيئات، بما في ذلك T مشترك علامات تنشيط الخلايا مثل CD62L 16. بروتوكولات أخرى تستخدم RPMI 1640 في المتوسط ​​6 الهضم. ومع ذلك، فإن وجود من المغنيسيوم والكالسيوم 2+ 2+ في RPMI يمكن أن يسبب الخلايا واسعة التجميع 17.

وينبغي أن يهدف بروتوكول مثالية للتفكك الأنسجة لبقاء الخلية عالية، وانخفاضمستويات تجميع الخلية، والحد الأدنى من الضرر إلى الخلية البروتينات السطحية. وقد تم إنجاز جودة عالية التحضيرات خلية العقدة الليمفاوية انسجة مع البروتوكولات التي تستخدم حضانات انزيم أقصر، الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ سائل الإعلام الحرة، وتجنب التربسين وdispase 18. ومع ذلك، لم تثبت البروتوكولات من هذا النوع لتفكك الجلد الماوس كله.

هنا، يتم وصف بروتوكول لفصل وعزل، وإثراء الكريات البيضاء-التسلل الجلد من تحدى حساسية الماوس الجناح الجلد. لفترة وجيزة، وحضنت قبل رفعه الجلد في محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) مع 10٪ مصل بقري جنيني لمدة 1 ساعة لتليين الأنسجة لعملية الهضم وإزالة أي جلد أو الدهنية الميتة الأنسجة الزائدة. وأعقب ذلك 30 دقيقة خطوة الأنزيمية الهضم مع 0.7 ملغ / مل كولاجيناز D. كولاجيناز D ديه الحد الأدنى من الآثار على كثافة علامات سطح الخلية، وليس له تأثير على T تكاثر الخلايا في المختبر 16،18، مما يجعلهامناسبة جدا للتطبيقات التي تنطوي على توصيف البروتينات السطحية. بعد الهضم الأنزيمي، وكان يستخدم متقطع التدرج الكثافة الطرد المركزي لإزالة الخلايا الظهارية والحطام من تعليق وحيد الخلية وإثراء لالخلايا المكونة للدم. الأهم من ذلك، هذا الإجراء يتجنب الخلايا المغناطيسية الكواشف الفصل القائم على عمود مكلفة وآلات تفكك النسيج 11/8، ويمكن أن يؤديها مع المعدات والمواد الموجودة في مختبر البحوث الطبية الحيوية الأساسية. هنا تم استخدام هذا البروتوكول لعزل الكريات البيض من الجلد الجناح تحدى ثلاث مرات مع oxazolone ناشبة (الثور) في المتحسسة سابقا الفئران ND4 السويسري (مقتبس من 19). وقد تم تحليل الخلايا باستخدام متعددة حدودي التدفق الخلوي. هذه التقنية أسفرت تعليق خلية مع الحد الأدنى من الحطام و> 95٪ قابلية الخلايا الليمفاوية المعزولة التي تم تحليلها من قبل التدفق متعدد حدودي الخلوي لقياس تسلل الخلايا الليمفاوية T والعدلات في كورونا المتضررينفي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: الفئران الأسبوع 8-12 أنثى القديمة ND4 بستر السويسرية، ويضم تقليديا مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء، واستخدمت لهذه الدراسات تمت الموافقة على بروتوكول تجريبي المستخدمة (B13S1) من خلال IACUC ماك ألستر الكلية.

1. توعية وتحدي مع Oxazolone

  1. اليوم 0
    1. إعداد غرفة التخدير عن طريق إضافة 3 مل الأيزوفلورين إلى المناشف الماصة وضعت تحت شبكة في الجزء السفلي من 4 L بغطاء جرة الزجاج. لإناث الفئران ND4 المستخدمة هنا، والوقت في الغرفة هو 30-60 ثانية حتى يتم تخدير موضوع بشكل كاف. تحسين إدارة مخدر للسلالة الماوس المستخدمة.
    2. حلاقة يعود كل فأر تخدير والجناح باستخدام الانتهازي وبر.
  2. اليوم 1
    1. جعل حل 2٪ من 4 ethoxymethylene-2-فينيل-2-oxazolin-5-واحد (الثور) إلى إيثانول المطلق، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على طبق من الدورية في حاضنة.
    2. تخدير لفترة وجيزةالفئران باستخدام التخدير الأيزوفلورين كما هو موضح في 1.1.1 وتطبيق 100 ميكرولتر من 2٪ الثور إلى حلق مرة أخرى في العديد من التطبيقات المسلسل حول 20 ميكرولتر لكل منهما. انتظر 5-10 ثانية بين التطبيقات التسلسلية للحل لتجف.
    3. الحرص على تجنب إراقة 2٪ الحل الثور في مناطق أخرى من الخلف، وانتظر الحل لتجف بين التطبيقات.
  3. أيام 5-7
    1. جعل حل 1٪ من (الثور) في الايثانول المطلق، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على طبق من الدورية في حاضنة.
    2. بلطف ولكن لشل حركة بحزم الماوس على القفا من قاعدة العنق والذيل مع البطن مواجهة والرقبة يميل قليلا إلى الأسفل (على غرار على عقد لحقن داخل الصفاق) وتطبيق 100 ميكرولتر من 1٪ الثور إلى الجناح حلق في العديد من التطبيقات التسلسلية وأخذ الوقت لتجفيف الجلد بعد ذلك كما هو موضح أعلاه.
    3. لالسيطرة على الفئران، وتطبيق 100 ميكرولتر من المركبات الإيثانول المطلقة لفلان حلقك.

2. الجناح الجلد الحصاد

  1. الموت ببطء الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون استنشاق، واستئصال بعناية المنطقة المرغوبة من الجلد الجناح (~ 25 ملم × 25 ملم من الجلد) مع 10 سم مقص جراحي.
  2. باستخدام نظيفة، شفرة جراحية حادة، كشط بعيدا الدهون الزائدة والنسيج الضام من الجلد الجناح.
  3. ضع 3 قطع من الجلد الجناح من 3 الفئران إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل RT HBSS [مع الفينول الأحمر، بدون الكالسيوم أو المغنسيوم، 5 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، 10 ملي 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1- حمض piperazineethanesulfonic (HEPES)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)].

3. قبل الهضم الأنسجة الغسل

  1. مكان أنبوب يحتوي على أجزاء الجلد على لوحة الدورية لمدة 30 دقيقة في حاضنة الجافة غير بالغاز-الحفاظ على 37 درجة مئوية.
  2. دوامة بقوة لمدة 10 ثانية في نهاية فترة الحضانة.
  3. سلالة محتويات الأنبوب خلال 70 ميكرونمصفاة للتخلص من المنطقة العازلة غسل وجمع الأنسجة. يمكن إعادة استخدامها مصفاة واحدة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله ضمن مجموعة المعالجة البيولوجية.
  4. باستخدام زوج من الملقط، ونقل الجلد الجناح من مصفاة الى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد تحتوي على 10 مل من جديد، ووسائل الإعلام RT HBSS (التي تحتوي على EDTA، HEPES، وFBS كما هو موضح أعلاه).
  5. مع 12،5 سم مقص تشريح الجراحية مغمورة في أنبوب، تخطر على كل قطعة من الجلد الجناح حتى أن متوسط ​​قطعة من النسيج حوالي 2.2 مم × 2.2 مم في المنطقة.
  6. مكان أنبوب يحتوي على أجزاء الجلد على لوحة الدورية لمدة 30 دقيقة في حاضنة الجافة غير بالغاز-الحفاظ على 37 درجة مئوية.
  7. دوامة بقوة لمدة 10 ثانية على نهاية الحضانة

4. كولاجيناز الهضم من الجلد

  1. سلالة محتويات أنبوب من خلال مصفاة 70 ميكرون، وجمع ونقل القطع الجلد الجناح إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد تحتوي على 10 مل الصحائفش، RT HBSS وسائل الإعلام تستكمل مع 0.7 ملغ / مل كولاجيناز D.
  2. مكان أنبوب يحتوي على الهضم المتوسطة وشظايا الجلد على لوحة الدورية لمدة 30 دقيقة في حاضنة الجافة غير بالغاز-الحفاظ على 37 درجة مئوية.
  3. محتويات دوامة أنبوب بقوة لمدة 10 ثانية على نهاية الحضانة.
  4. تصفية محتويات أنبوب من خلال مصفاة 70 ميكرومتر إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد؛ الحفاظ على التدفق من خلال تحتوي على الأنسجة هضمها والتخلص من مصفاة والجناح الحطام الجلد.
  5. تغسل من خلال تدفق في 50 مل من HBSS وسائل الإعلام، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 غرام، وصب طاف.

5. كثافة الطرد المركزي التدرج

  1. باستخدام ماصة المصلية، إضافة 3 مل RT 67٪ كثافة التدرج وسائل الإعلام الطرد المركزي في الفوسفات 1X مخزنة المالحة (PBS) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد لكل عينة.
  2. resuspend الكرية خلية في 5 مل RT 44٪ كثافة وسائل الإعلام الطرد المركزي التدرج في HBSS مع الفينول الأحمر.
  3. شخص مهذبطبقة لاي 5 مل من 44٪ كثافة التدرج وسائل الإعلام الطرد المركزي التي تحتوي على الخلايا على أعلى من 67٪ من عينة سائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي باستخدام ماصة المصلية. تأكد من تعيين pipettor إلى أبطأ سرعة، ووضع ماصة على طول جدار أنبوب مخروطي الشكل. يجب الحرص على عدم اهتزاز، وتعطيل، أو عكس التدرج.
  4. تعيين تسارع إلى أدنى الإعداد، فك الارتباط على الفرامل، وأجهزة الطرد المركزي التدرج في 931 x ج لمدة 20 دقيقة في RT التأكد من أن أجهزة الطرد المركزي غير متوازن.
  5. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية التدرج من أجهزة الطرد المركزي، ونقل بلطف على مقاعد البدلاء مختبر عقد أنبوب تستقيم. باستخدام 5 مل نقل البلاستيك ماصة، وإزالة طبقة الخلايا في واجهة من 44٪ و 67٪ التدرج الكثافة الطرد المركزي وسائل الإعلام ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. إذا واجهة غير مرئية، ببساطة إزالة حوالي 2 مل من السائل في 67٪ -44٪ الحدود.
  6. ملء أنبوب مخروطي يحتوي على خلايا من الأسواق العالمية ضغطهاrface مع 2٪ FBS في 1X PBS المثلج، والخلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ج، وصب طاف.
    ملاحظة: هذه هي المرة الأولى التي تقوم فيها الخلايا يمكن أن تبرد / أبقى الباردة منذ الخطوات الهضم هي 37 درجة مئوية، والخطوات وسائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي هي في RT. الخلايا يمكن معلق في 1: 1 التريبان تخفيف الأزرق والتهم ومعلومات حيوية يمكن الحصول عليها في هذه المرحلة.

6. الحجب وتلطيخ لتحليل تدفق Cytometric

  1. كتلة FcγRII / مستقبلات الثالث على خلايا لمنع تلطيخ الجسم المضاد غير محددة. لوصف التجارب هنا، وجعل يمزج سيد الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني مع 2٪ FBS تحتوي على 1: 100 التخفيف من الأجسام المضادة ضد اللامقترن CD16 / 32 (2.4G2) لربط وكتلة FcγRII / III مستقبلات.
  2. احتضان خلايا سدت مع يمزج رئيسية مناسبة من الأجسام المضادة ضد CD3ɛ (145-2C11)، CD4 (RM4-5)، CD8α (53 حتي 6،7)، CD11b (M1 / 70)، CD11c و(N418)، CD44 (IM7)، CD45 ( 30-F11)، CD45R(RA3-6B2)، CD62L (MEL-14)، ولي-6G / لي-6C (GR-1) (RB6-8C5)، وكذلك رائعة البنفسج 510 الحية / وصمة عار الميتة لتحديد الخلايا الميتة. استخدام جميع الأجسام المضادة إما في التخفيف الموصى بها من قبل الشركات المصنعة أو الأمثل من قبل الباحثين في السابق. لوصف التجارب هنا، استخدم كل الأجسام المضادة في التخفيف 1: 100.
  3. غسل الخلايا و resuspend في 50 ميكرولتر 1X PBS عازلة تلطيخ مع 2٪ FBS. الحفاظ على الجليد حتى يمكن الحصول على البيانات مضان على تدفق عداد الكريات.
    ملاحظة: من المهم أن يكون المعلمات تعويض ما قبل الأمثل مع الأنسجة اللمفاوية ومستضد سطح الخلية المشتركة (مثل CD4 أو CD8) قبل الحصول على البيانات مضان.
  4. لزيادة عدد الخلايا لتدفق المصب تحليل الخلوي، والحصول على البيانات من عينة كاملة من الخلايا الملون.

7. تحليل التدفق الخلوي البيانات باستخدام الطرق القياسية لإنجاز الخطوات المذكورة أدناه

  1. الأولى، بوابة على المنطقة اللمفاويات مبعثر إلى الأمام(منطقة) من خلال الجانب مبعثر (منطقة) المؤامرة.
  2. ثم، حدد الخلايا واحدة باستخدام مبعثر إلى الأمام (العرض) من خلال الجانب مبعثر (العرض)، لتجنب تحليل الحلل. هذا ويمكن أيضا أن يتحقق مع ارتفاع مبعثر إلى الأمام إلى جنب ارتفاع مبعثر المؤامرة.
  3. ثم، البوابة على النسب (CD11b، CD11c و، وCD45R / B220) -negative وCD3 إيجابية الأحداث، على أن تستبعد الضامة، والخلايا الخلايا الجذعية، وB، على التوالي، ويحلل تحصر إلى الخلية حجرة T، إذا كان الهدف هو، كما هو الحال هنا، لتقييم اختراق خلايا T.
  4. المقبل، بوابة على الخلايا الحية التي تستبعد / وصمة عار الميتة الحية.
  5. وأخيرا، بوابة على السكان خلية من الفائدة (انظر القسم ممثل النتائج).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعامل كولاجيناز D splenocytes تظهر مستويات مماثلة من CD4 و CD8 α على خلايا T بالمقارنة مع الضوابط المعالجة الإعلامية
أولا، تم تقييم أي آثار محتملة من كولاجيناز D على وتيرة والسطحية وفرة من النسب وتفعيل علامات على T فرعية الخلية باستخدام الأنسجة اللمفاوية الثانوية كمجموعة تحكم. تم الحصول على تعليق من splenocytes من الفئران ND4 وغسلها لمدة 1 ساعة مع HBSS وسائل الإعلام. المقبل، نصف الخلايا تتعرض ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تميز التغيرات في الكريات البيضاء والجلد المقيمين في نماذج القوارض من الأمراض الجلدية مثل الاكزيما أو الصدفية المهم لفهم الاتصالات الآلية بين تدفق الخلايا الالتهابية وعلم الأمراض. نحن هنا وصف تقنية اقتصادية لعزل الكريات البيض من أنسجة الجلد مع المعدات الأساسية الموجودة في معظم مختبرات الأبحاث الطبية الحيوية. هذه التقنية السريعة نسبيا يتجنب استخدام آلات تفارق الأنسجة مكلفة وأنابيب مخصصة والكواشف، مما يساعد على الحفاظ على الموارد وتقليل الأيدي في الوقت المحدد على مقاعد البدلاء المختب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية أو غيرها في الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعاهد الوطنية للصحة (NIH R15 NS067536-01A1 لDC)، والرابطة الوطنية التهاب الأعضاء الأنثوية (الجائزة لDC)، وماك ألستر كلية دعمت هذا العمل. تلقى CB زمالة من برنامج بيكمان علماء ماك ألستر كلية، بتمويل من مؤسسة أرنولد ومابيل بيكمان. معتمدة BTF وTM التي كتبها JDRF 2-2011-662. نشكر الدكتور جيسون شنكل والدكتور جوليانا لويس للحصول على المشورة التقنية، وجميع الأعضاء الحاليين والسابقين في المختبر Chatterjea لما قدموه من مساعدة والدعم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
HBSS مع الفينول الأحمر ، بدون الكالسيوم ، بدون المغنيسيوم ، السائلSigma Aldrich55021Cيحفظ معقما حتى يوم الاستخدام.
HEPES ، & 99.5٪ (معايرة بالتحليل الحجمي)Sigma AldrichH3375
EDTA محلول ملح ثنائي الصوديومSigma AldrichE7889يحفظ معقما حتى يوم الاستخدام.
مصل الأبقار الجنيني ، وزارة الزراعة الأمريكية ، معطل بالحرارة ، Premium SelectMidSciS01520HIيحافظ على تعقيمه حتى يوم الاستخدام.
بيركول ، درجة الحموضة 8.5-9.5 (25 درجة ؛ ج)سيجما ألدريتشP1644حافظ على العقيم. يجب أن يكون Percoll متساوي التوتر مع 10X PBS معقم قبل الاستخدام.
ماكينة تشذيب مجموعة كومبوكينت العلميةCL9990-1201 استخدم أداة التشذيب الأكبر لحلاقة الجناح والظهر.
4-إيثوكسي ميثيلين -2-فينيل -2-أوكسازولين -5-واحدسيجما ألدريتشE0753-10Gيذوب في 100٪ EtOH عند 50 درجة ؛ C لمدة 15 دقيقة على لوحة دوارة.
منقى مضاد للفأر CD16 / CD32 (2.4G2)Tonbo Biosciences70-0161جسم مضاد يستخدم لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة أثناء تلطيخ الأجسام المضادة لقياس التدفق
المضاد CD3 & epsilon ؛ -BV650 (145-2C11)Becton Dickinson564378الجسم المضاد المستخدم في تلطيخ الخلايا لقياس التدفق
المضاد CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)eBioscience47-0042-80الجسم المضاد المستخدم لتلطيخ الخلايا من أجل التدفق القياس الخلوي
المضاد ل CD8 & alpha ; -BV785 (53-6.7)BioLegend100749الجسم المضاد المستخدم في تلطيخ الخلايا لقياس التدفق
المضاد ل CD11b-eFluor450 (M1 / 70)eBioscience48-0112-80الجسم المضاد المستخدم في تلطيخ الخلايا لقياس التدفق
المضاد ل CD11c-eFluor450 (N418)eBioscience48-0114-80الجسم المضاد المستخدم لتلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي
المضاد ل CD44-BV711 (IM7)Becton Dickinson563971الجسم المضاد المستخدم في تلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي
المضاد ل CD45-FITC (30-F11)Tonbo Biosciences35-0451-U025الجسم المضاد المستخدم في تلطيخ الخلايا لقياس التدفق
المضاد CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)eBioscience48-0452-80الجسم المضاد المستخدم في تلطيخ الخلايا لقياس التدفق
المضاد CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)BioLegend104431الجسم المضاد المستخدم في تلطيخ الخلايا لقياس التدفق
مضاد ل Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) -PE (RB6-8C5) BioLegend108407الجسم المضاد المستخدم في تلطيخ الخلايا لقياس التدفق
الخلوي Ghost Dye-BV510Tonbo Biosciences13-0870-T100صبغة الجدوى لقياس التدفق
الخلوي LSR FortessaBecton DickinsonN / Aمحلل الخلية (18 معلمة)
كولاجيناز D من كلوستريديوم 11088858001 Histolyticum< / I>Roche Applied Scienceإنزيم Aliquot المجفف بالتجميد عند 5 مجم / مل في HBSS مع أحمر الفينول ، بدون كالسيوم ، وبدون مغنيسيوم في 1 مل aliquots. يخزن على الفور في -20 درجة ؛ ج لمدة تصل إلى ستة أشهر.
ND4 إناث الفئران السويسريةهارلان0-328-12 أسبوعا ؛ مقيدة تقليديا مع إمكانية الوصول المجاني إلى الطعام والماء وتستخدم وفقا لإرشادات IACUC الخاصة بكلية ماكاليستر.
الخلوي الخلوي الخلوي الخلوي الخلوي الخلوي الخلوي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
  2. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
  3. Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
  4. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
  5. Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
  6. Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
  7. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
  8. Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
  9. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029(2008).
  10. Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
  11. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).
  12. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
  13. Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
  14. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
  15. Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311(2013).
  18. Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803(2014).
  19. Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673(2013).
  20. Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
  21. Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
  22. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

D CD45

مقالات ذات صلة