يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية

8.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53647

⸱

يناير 14, 2016

1Department of Radiation Oncology, Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

في هذا البروتوكول ، نصف تقنية BrdU-ChIP-Slot-Western جديدة لفحص البروتينات وتعديلات الهيستون المرتبطة بالحمض النووي المركب حديثا أو الناشئ.

الملخص

deacetylases هيستون 1 و 2 (HDAC1،2) تعريب لمواقع تكرار الحمض النووي. في الدراسة السابقة، وذلك باستخدام مثبطات انتقائية ونظام ضربة قاضية الجيني، أظهرنا وظائف جديدة لHDAC1،2 في النسخ المتماثل شوكة التقدم والاستقرار لونين الوليدة في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا تقنية BrdU رقاقة فتحة للغرب الذي يجمع بين لونين مناعي (رقاقة) من برومو-deoxyuridine (BrdU) DNA -labeled مع فتحة لطخة والتحليلات الغربية لقياس كميا البروتينات أو تعديل هيستون المرتبطة الحمض النووي الناشئ.

بنشاط تم علاج الخلايا المنقسمة مع HDAC1،2 مثبط انتقائي أو مع transfected الرناوات siRNAs ضد Hdac1 وHDAC2 ثم وصفت DNA تصنيعه حديثا مع bromodeoxyuridine التيميدين التناظرية (BrdU). وقد تم وضع العلامات BrdU في نقطة زمنية عندما لم يكن هناك دورة الخلية القبض كبير أو موت الخلايا المبرمج بسبب فقدان الوظائف HDAC1،2. التالي لتم تنفيذ abeling من الخلايا مع BrdU، مناعي لونين (رقاقة) من علامات أستلة هيستون أو لونين-remodeler مع الاجسام المضادة المحددة. ثم رصدت المسمى BrdU DNA المدخلات وimmunoprecipitated (أو ChIPed) DNA على غشاء باستخدام تقنية فتحة وصمة عار وثبتوا باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. ثم تم تقييم كمية الحمض النووي الناشئ في كل فتحة كميا باستخدام التحليل الغربي مع الأجسام المضادة لمكافحة BrdU. ثم تم تحديد تأثير فقدان الوظائف HDAC1،2 على مستويات تصنيعه حديثا هيستون علامات أستلة المرتبطة الحمض النووي والكروماتين remodeler عن طريق تطبيع إشارة BrdU رقاقة تم الحصول عليها من العينات المعالجة إلى عينات السيطرة.

المقدمة

إصلاح الحمض النووي عيب و / أو تكرار الحمض النووي هي السبب الرئيسي لعدم الاستقرار الجينوم، والتي يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا. وحيد دون اصلاح كسر حبلا مزدوج يكفي ليسبب موت الخلايا 1. يتم تبديل المنظمة لونين عابر خلال كل تكرار وإصلاح 2،3، والفشل في الحفاظ على المعلومات جينية خلال هذه العمليات سوف يؤدي إلى تهديد للسلامة الجينوم. فقدان HDAC3 أو وظيفة HDAC1،2 يعوق التقدم S-المرحلة، والنسخ وإصلاح الحمض النووي مما يؤدي إلى إجهاد السمية (تلف DNA) وموت الخلايا 4-9. وبالتالي فإنه من استراتيجية عملية لاستخدام مثبطات انتقائية HDAC لتعطيل النسخ المتماثل إصلاح والكروماتين في الخلايا السرطانية وتسبب التلف في الحمض النووي، والتي بدورها يمكن أن يوقف النمو ولحث على موت الخلايا بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية سريعة النمو.

خلال تكرار الحمض النووي، وتفكيكها لونين بسرعة ومن ثم تجميعها بعد تكرار الحمض النووي. سي حديثاوالأسيتيل nthesized هيستون H4 في K5 والمخلفات K12 (H4K5K12ac) وترسب التالية على لونين، وdeacetylated أنها بسرعة عن طريق deacetylases هيستون (HDACs) 10،11. يمكن فشل الخلايا للحفاظ على لونين سلامة الوليدة التي كتبها هيستون deacetylation يؤدي إلى انهيار شوكة، وهذا بدوره يمكن أن يؤدي إلى تلف الحمض النووي وموت الخلايا. أظهرنا مؤخرا أن تثبيط انتقائي من HDAC1،2 يزيد هيستون أستلة (H4K5ac، H4K12ac وH4K16ac) ويمنع SMARCA5 النشاط لونين remodeler على لونين الناشئ، الذي يرتبط مع انخفاض تطور تكرار مفترق الطرق، وزيادة انهيار شوكة وزيادة تكرار التوتر الناجم عن الحمض النووي من التلف 6 . وبالتالي، يمكن HDAC العلاج المانع يغير هيكل لونين الناشئ لتحريك الحمض النووي من التلف والموت بسرعة كبيرة في خلايا السرطان، حيث أن هذه الخلايا دورة بسرعة وتمرير عدة مرات خلال المرحلة S. ولذلك فمن المهم أن نفهم كيف تعمل HDACs لتنظيم أستلة هيستون والبروتين بيندينانوغرام للحفاظ على تكرار الحمض النووي في خلايا الثدييات.

لقياس كمي لمقدار أستلة هيستون وSMARCA5 remodeler ونين المرتبطة الحمض النووي الناشئ خلال تكرار الحمض النووي، ونحن وضعت دعا مقايسة الشذرة تعديل أسلوب BrdU رقاقة فتحة للغرب. بعد مناعي لونين (رقاقة) من المطلوب البروتين أو هيستون تعديل، وكمية من الحمض النووي الناشئ (المسمى باستخدام التناظرية ثيميدين، BrdU) في العينة رقاقة يمكن الكشف عنها باستخدام التحليل الغربي من المسمى BrdU الشذرة DNA نقل على غشاء باستخدام فتحة جهاز لطخة. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا أن H4K16ac (علامة تشارك في التعبئة والتغليف لونين) وأفراد الأسرة ISWI SMARCA5 (المتعلقة SNF-SWI / المصاحب المصفوفة التي تعتمد على الأكتين منظم من لونين) remodeler ونين ترتبط مع الحمض النووي الناشئ في خلايا S-المرحلة 6. وجدنا أيضا أن العلامة H4K16ac الوليدة وdeacetylated التي كتبها HDAC1،2 خلال تكرار الحمض النووي (6). يمنع H4K16acالنشاط remodeler لونين من أفراد الأسرة ISWI SMARCA5 12. وبالتالي، وذلك باستخدام تقنية BrdU-CHIP فتحة للغرب، فإننا لا يمكن ربط وظائف لHDAC1،2 في تنظيم الكروماتين إعادة عرض خلال تكرار الحمض النووي. وبالتالي، فإن تقنية BrdU رقاقة فتحة للغرب وصمة عار هو طريقة فعالة لقياس كمي لتكوين الجمعيات والتفكك ديناميات البروتينات أو تعديلات في مرحلة ما بعد متعدية التي لا بد أن الحمض النووي الناشئ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. لونين مناعي (رقاقة) بعد BrdU وصفها

  1. ثقافة الخلايا NIH3T3 في وجود إما DMSO أو مثبطات HDAC1،2 انتقائية كما هو موضح سابقا 6.
  2. بعد العلاج مع DMSO أو مثبطات انتقائية HDAC1،2، إضافة BrdU إلى الخلايا في نسيج الثقافة العقيمة غطاء محرك السيارة. احتضان 2 × 10 6 NIH3T3 خلايا مطلي في 10 مل سائل الإعلام NIH3T3 مع 20 ميكرومتر تركيز النهائي من bromodeoxyuridine (BrdU) لمدة 60 دقيقة في العقيمة 37 ° C زراعة الأنسجة الحاضنة.
  3. تشعبي البروتينات داخل الخلايا لDNA عن طريق إضافة الفورمالدهيد مباشرة إلى وسائل الإعلام الثقافة بتركيز نهائي من 1٪. احتضان 2 × 10 6 خلايا NIH3T3 مع الفورمالديهايد في RT لمدة 10 دقيقة على شاكر.
  4. إخماد عبر ربط بإضافة الجلايسين إلى التركيز النهائي من 125 ملم. في احتضان RT لمدة 5 دقائق على شاكر.
  5. إزالة وسائل الإعلام وجمع الخلايا في برنامج تلفزيوني في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تدور سلليرة سورية في 956 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. غسل بيليه الخلية مرتين مع PBS الجليد الباردة. إزالة PBS من الأنبوب. تخزين بيليه الخلية عبر ربط دون PBS (طاف) في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. إعداد المحللة من بيليه الخلية crosslinked بإضافة 500 ميكرولتر العازلة FA140 (50 ملم من HEPES KOH درجة الحموضة 7.5، 140 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم من EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 1٪ تريتون-X-100 و 0.1٪ deoxycholate الصوديوم) تستكمل مع مثبط البروتياز كوكتيل.
  7. القص لونين من قبل sonicating عينات خمس مرات في السلطة 35٪ مع وجود نبض 15 ثانية، 0.9 ثانية على والإعداد 0.1 ثانية قبالة. إبقاء الأنابيب على الجليد بعد كل جولة من صوتنة لتجنب تسخين العينات.
    1. تحقق من القص على هلام DNA كما كفاءة القص تتنوع بين sonicators مختلفة. للتحقق صوتنة، عكس تشعبي عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.16 M وتنفيذ الخطوات 1.17.1. - 1.22. تشغيل مزال 10 DNA ميكرولتر على 1.5٪ هلام الاغاروز للتحقق ما إذا كان القص هوبين 300-700 سنة مضت بمتوسط ​​كثافة في 500 سنة مضت.
  8. وبعد صوتنة، وعينات من أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 17949 x ج في 4 درجات مئوية، وطاف لنقل أنبوب جديد.
    1. أداء تقدير البروتين باستخدام عدة فحص البروتين التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. استخدام كمية مساوية من المحللة للرقاقة الرقابة والعينات التجريبية. عموما، استخدم 1 ملغ من المحللة الكلي في رد الفعل الشذرة.
  9. تجهيز 50٪ من البروتين الطين A-الاغاروز باستخدام العازلة FA140 تحتوي على مثبط البروتياز كوكتيل. إضافة 10/01 حجم كوكتيل مثبط البروتياز. حساب حجم حبات اللازمة استنادا إلى عدد من العينات في المجموع.
    1. غسل البروتين الخرز A-الاغاروز مع العازلة FA140 مرتين لإزالة العازلة التخزين وإضافة حجم مساو لعازلة FA140 إلى حبات لجعل 50٪ الطين.
    2. لإزالة البروتينات التي تربط غير تحديدا إلى الخرز، وإضافة 50 ميكرولتر من 50٪ من البروتين الطين A-الاغاروز وcubate العينات عند 4 درجات مئوية مع ثابت نهاية الإفراط في نهاية التناوب في خلاط المشواة لمدة 30 دقيقة.
  10. تدور العينات في 956 x ج في 4 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. جمع طاف وأداء مناعي عن طريق إضافة 8 ميكرولتر H4K16ac الأجسام المضادة أو 5 ميكرولتر (5 ميكروغرام) من 1 ملغ / مل الأجسام المضادة SMARCA5 لطاف. احتضان عند 4 درجات CO / N مع ثابت التناوب نهاية الإفراط في نهاية في خلاط المشواة.
  11. حفظ 1/10 للاستخراج من أجل السيطرة "الإدخال" وتعيينه جانبا في -20 ° C. المدخلات يجب أن يكون العكس يرتبط العابرة جنبا إلى جنب مع عينات IP.
  12. استخدام كمية مساوية من أرنب مفتش (5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل) على أنها سلبية العينة الضابطة مناعي.
  13. في اليوم التالي، إضافة 50 ميكرولتر من 50٪ بروتين-A الاغاروز الطين لاستخراج واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع دوران.
  14. بيليه الخرز agarose بواسطة الطرد المركزي في 956 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة بعناية وطاف واSH حبات مع المخازن المؤقتة التالية بالتتابع. في الاستعدادات العازلة، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني الحق قبل الاستخدام.
    1. يغسل مع منخفضة الملح المناعي مجمع الاحتياطي اغسل (FA140؛ تركيز النهائي من 50 ملم من HEPES KOH درجة الحموضة 7.5، 140 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم من EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 1٪ تريتون-X-100 و 0.1٪ deoxycholate الصوديوم) ل 5 دقائق عند 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب.
    2. يغسل عالية من الملح المناعي مجمع الاحتياطي اغسل (FA500؛ تركيز النهائي من 50 ملم من HEPES KOH درجة الحموضة 7.5، 500 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم من EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 1٪ تريتون-X-100 و 0.1٪ deoxycholate الصوديوم) ل 5 دقائق عند 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب.
    3. يغسل LiCl المناعي مجمع الاحتياطي اغسل (تركيز النهائي من 10 ملم من تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0، 250 ملي من LiCl، و 0.5٪ و 0.5٪ NP40 deoxycholate الصوديوم) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب.
  15. وبعد يغسل كما هو موضح أعلاه، إضافة 200 حل شطف ميكرولتر (تركيز النهائي من 1٪ SDS وبيكربونات الصوديوم 100 ملم) وincubatه في RT لمدة 15 دقيقة مع نهاية الإفراط في نهاية تناوب على RT.
  16. تدور العينات في 956 x ج في RT ونقل شطافة لأنبوب جديد 1.5 مل. كرر الخطوة 1.15 مع إضافي الحل شطف 200 ميكرولتر.
  17. 400 ميكرولتر من شطافة، إضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.16 M وتخلط جيدا.
    1. بالإضافة إلى ذلك، إضافة 400 ميكرولتر حل شطف إلى 10 ميكرولتر المدخلات التي تم تعيينها جانبا (الخطوة 1.11) وإضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.16 M لعكس عينات المدخلات تشعبي كذلك. عكس تشعبي العينات التي يحتضنها في 65 ° C حمام الماء لمدة 5 ساعة.
  18. إضافة 1 مل من 100٪ ETOH إلى شطافة crosslinked للعكس. تخلط جيدا واحتضان عند -80 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة أو في -20 درجة CO / N. تدور العينات في 17949 x ج لمدة 15 دقيقة، وتجاهل الايثانول.
  19. إضافة 800 ميكرولتر 70٪ من الإيثانول لغسل بيليه. تدور في 17949 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل الايثانول. تدور لفترة وجيزة لإزالة أي الإيثانول المتبقية. الهواء الجاف العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإزالة الإيثانول المتبقية.
  20. حل الحمض النووي في 90 ميكرولتر ريبونوكلياز والدناز المياه المجانية وإضافة 2 ميكرولتر 10 ملغ / مل ريبونوكلياز في 0.2 ملغ / مل تركيز النهائي. احتضان عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة.
  21. إضافة 10 ميكرولتر 10X بروتين K العازلة (100 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0، 5٪ SDS). تخلط جيدا وإضافة 1 ميكرولتر بروتين K. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  22. تنقية المدخلات ورقاقة الحمض النووي باستخدام PCR تجارية عدة تنقية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة وأزل الحمض النووي في 50 ميكرولتر المياه. متجر DNA في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

2. فتحة تحليل لطخة من رقاقة الحمض النووي

  1. قياس العائد من المدخلات ورقاقة الحمض النووي مزال في 50 ميكرولتر المياه كما هو موضح في الخطوة 1.22 باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 280 نانومتر وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  2. أخذ كميات متساوية (50 ميكرولتر) من المدخلات أو DNA immunoprecipitated التي هي ضمن مجموعة خطية من الكشف.
    1. على سبيل المثال، إذا كان الإدخالالعائد DNA هو 1.5 نانوغرام / ميكرولتر، ثم تأخذ 30 ميكرولتر (أو 45 نانوغرام DNA الكلي) وجعل حجم 50 ميكرولتر بالماء. للعامل رقاقة، واتخاذ كامل شطافة 50 ميكرولتر من الخطوة 2.1 وانتقل إلى الخطوة 2.3.
  3. تفسد 50 ميكرولتر المدخلات أو DNA immunoprecipitated بإضافة 2.5 حجم 0.4 N هيدروكسيد الصوديوم، دوامة لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي ل956 x ج لمدة 10 ثانية، واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
  4. تحييد الحمض النووي التشويه والتحريف عن طريق إضافة 175 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، دوامة، الطرد المركزي لمدة 956 x ج لمدة 10 ثانية، ووضع العينات في الثلج.
  5. إعداد التخفيف المتسلسل من المدخلات وDNA immunoprecipitated للفتحة وصمة عار الفحص كما هو موضح أدناه.
    1. اتبع الخطوات 2،3-2،4 للحصول على حجم العينة الكلي 350 ميكرولتر (أي 50 ميكرولتر الإدخال / رقاقة الحمض النووي، 125 ميكرولتر 0.4 N هيدروكسيد الصوديوم، 175 ميكرولتر 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8).
      ملاحظة: للحصول على سبيل المثال ذكر أعلاه، فإن 45 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات في نهاية الأمر 0،129 نانوغرام / ميكرولتر.
    2. لDNA المدخلات، وتسمية ثلاثة أنبوبالصورة الى 100 و 50 و 25 و إضافة 100 ميكرولتر، 50 ميكرولتر و 25 ميكرولتر من عينة DNA التشويه والتحريف وتحييدها. جعل الحجم النهائي إلى 100 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه. لرقاقة الحمض النووي، وتسمية ثلاثة أنابيب إلى 200 و 100 و 50 و 200 إضافة ميكرولتر 100 ميكرولتر و 50 ميكرولتر من عينة DNA التشويه والتحريف وتحييدها. جعل الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر مع المياه مجانا نوكلياز.
  6. قطع غشاء لحجم الجهاز فتحة وصمة عار. قبل الرطب الغشاء وأوراق النشاف في 20x وSSC قبل وقبل إضافة DNA. تجميعها في الجهاز فتحة وصمة عار وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  7. DNA الماصة من الخطوة 2.5.2 في فتحات مناسبة. تطبيق فراغ ببطء لسحب DNA على الغشاء زيتا التحقيق. وقف فراغ بعد مرور جميع العينات من خلال جهاز.
    1. تفكيك الجهاز وشل على الفور DNA على الغشاء باستخدام crosslinker الأشعة فوق البنفسجية. هل لديك الجانب DNA حتى في crosslinker الأشعة فوق البنفسجية واستخدام الاتحاد الافريقيtocrosslink وضع في crosslinker. اتبع بروتوكول الشركة الصانعة.
  8. كشف BrdU على فتحة لطخة عن طريق أداء الغربية النشاف.
    1. منع الغشاء مع 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم في PBS تحتوي على 0.1٪ توين-20 (PBST) لمدة 1 ساعة على RT لمنع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة للغشاء.
    2. إضافة الابتدائي الأجسام المضادة لمكافحة BrdU (1: 500 تمييع) المخفف في 1٪ الحليب المجفف منزوع الدسم في PBST واحتضان وصمة عار مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 3 ساعة على RT على شاكر. يغسل الغشاء مع PBST ثلاث مرات بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية.
    3. إضافة HRP-مترافق مكافحة فأر الضد الثانوية إلى وصمة عار (1: 5000 تمييع) واحتضانها في RT لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء مع PBST ثلاث مرات بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية.
      ملاحظة: استخدم حجم ما يكفي من الأجسام المضادة لتغطية كامل الغشاء خلال حضانات الضد الابتدائية والثانوية.
  9. تحضير مزيج ECL وإضافته إلى ميلان وصمة عارحبال لبروتوكول الشركة المصنعة. احتضان الغشاء مع ECL المزيج لمدة 5 دقائق على RT.
    1. وضع الغشاء في كاسيت الأشعة السينية، كشف الغشاء إلى فيلم الأشعة السينية وتطوير وصمة عار باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
    2. قياس إشارة التي تم الحصول عليها لإدخال وDNA ChIPed بعد مسح البقع باستخدام صورة البرنامج J وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. لالكميات، استخدم إشارة إلى أن ضمن مجموعة خطية من الكشف لضمان دقة القياس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتحديد خصوصية مثبطات HDAC1،2 انتقائية، استخدمت Hdac1،2 FL / FL وHdac3 FL / FL خلايا ليفية. واستخدمت لجنة المساواة العرقية recombinase (الإعلان، لجنة المساواة العرقية) التي تحتوي على اتش حذف Hdac1،2 وHdac3 في هذه الخلايا. بعد الإصابة الإعلان، لجنة المساواة العرقية من Hdac1،2 FL / FL الخلايا، لوحظ وجود زيادة قوية في H4K5ac. لم علاج الخلايا خروج المغلوب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول صفها في هذه المخطوطة هي طريقة سريعة نسبيا لإثبات وجود البروتينات أو أشكالها المعدلة بعد translationally على DNA تكرارها حديثا أو الناشئ. بالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه التقنية واحدة لقياس حركية جمعية-تفكك البروتين أو شكله المعدل مع الحمض النووي الناشئ. هذه التقنية هي مكملة لتكنولوجيا أنيقة iPOND 13. في التكنولوجيا iPOND، هو المسمى DNA تصنيعه حديثا مع deoxyuridine الإيثيلي (EDU). ثم يتم إضافة المترافقة البيوتين على EDU باستخدام النقر الكيمياء. ثم يتم immunoprecipita...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدي مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وأيد العمل في هذه المخطوطة من أموال من قسم علاج الأورام بالإشعاع ومعهد هانتسمان للسرطان والمعهد الوطني للصحة منح (R01-CA188520) لSB. أشكر دانييل جونسون وستيفن بينيت في مختبري ليدل على البروتوكول وشرح فوائدها. وأنا ممتن للدكتور ماهيش شاندراسيخاران (معهد هانتسمان للسرطان) للتعليق الحرجة على المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Anti-BrdU (الغربيين)BD BiosciencesB555627
Anti-SMARCA5Abcamab3749
Anti-H4K16acActive Motif39167
Zeta-Probe GT MembraneBio-Rad162-0197
الفورمالديهايدفيشرBP531-500
بروتين أ الاغاروزميليبور16-156
Rnase AQiagen19101
Proteinase KSigmaP4850
PCR Purification KitQiagen28106
GlycineSigmaG7403
كوكتيل مثبط البروتيازRoche11836170001
BrdUSigmaB9285
Rabbit IgG & نب سب.Millipore12-370
HEPESSigmaH3375
NaClSigmaS-3014
Triton-X-100Sigma93443
NP40USB Corporation19628
ديوكسي كولات الصوديومSigmaD6750
بيكربونات الصوديومSigmaS-4019
مختبراتالإيثانول04-355-222
المياه المعالجة DEPCSigma95284
تريسفيشرBP-152-5
EDTAInvitrogen15575-020
SDSAmbionAM9820
هيدروكسيد الصوديومMallinckrodt GenAR & nbsp ؛MAL7772-06
20x SSCLife Technologies15557-036
الحليب الجاف الخالي من الدسممختبر Scientific IncM0841
ECLThermo Fisher80196
فيلم الأشعة السينيةGenesee Sci30-101
المطورKonica MinoltaSRX-101A
UV CrosslinkerStratageneXLE-1000
سونيكاتوربرانسون سونيفاير  نموذج اضطراب الخلايا بالموجات فوقالرقمية: 450
جهاز طرد مركزيEppendorfالموديل: 5810R
حمام مائيفيشر Scientific Isotempالموديل: 2322
NanoDrop 1000 مقياس الطيفThermoScientificنموذج: 1000
جهاز لطخة فتحة   ؛Schleicher and Schuell Minifold II44-27570
حاضنة زراعة الأنسجةالسلسلة العلمية الحراريةII 3110 حاضنات
ديكون الصوتية الضوئي CO2 مغلفة بالماء

المراجع

  1. Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
  2. Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
  3. Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
  4. Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
  5. Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
  6. Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).
  7. Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
  8. Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
  9. Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
  10. Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. Duplication and maintenance of heterochromatin domains. J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).
  11. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).
  12. Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
  13. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحليل الحمض النووي الناشئالترسيب المناعي للكروماتينتقنية لطخة الشقتحليل لطخة ويسترنعلامات أستلة الهيستونمعدل الكروماتينتضاعف الحمض النوويالارتباط بين البروتين والحمض النووي
فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.