يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو لتقييم EYFP-باركين تجميع كعلامة الخلوية Mitophagy

6.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53657

⸱

مايو 4, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف بالتفصيل نهج الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني لقياس التجنيد الزمني ل EYFP-Parkin أثناء الإزالة الانتقائية للميتوكوندريا التالفة. يمكن استخدام هذه العملية الديناميكية لإزالة الميتوكوندريا التالفة المعتمدة على EYFP-Parkin كمؤشر على الصحة الخلوية في ظل ظروف تجريبية مختلفة.

الملخص

يمكن تعريف الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني < p class = 'jove_content'> على أنه التصوير في الوقت الفعلي للخلايا الحية. تعتمد هذه التقنية على جمع الصور في نقاط زمنية مختلفة. يمكن ضبط الفواصل الزمنية من خلال واجهة كمبيوتر تتحكم في الكاميرا المدمجة بالمجهر. يتطلب هذا النوع من الفحص المجهري القدرة على اكتساب أحداث سريعة جدا والإشارة الناتجة عن البنية الخلوية المرصودة أثناء هذه الأحداث. بعد جمع الصور ، يتم تجميع فيلم للتجربة بأكملها لإظهار ديناميكية الأحداث الجزيئية ذات الأهمية. يحتوي الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني على مجموعة واسعة من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية وهو أداة قوية وفريدة من نوعها لمتابعة ديناميكيات الأحداث الخلوية في الوقت الفعلي. من خلال هذه التقنية ، يمكننا تقييم الأحداث الخلوية مثل الهجرة والانقسام ونقل الإشارة والنمو والموت. علاوة على ذلك ، باستخدام المجسات الجزيئية الفلورية ، يمكننا تمييز جزيئات معينة ، مثل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتينات ومتابعتها من خلال مساراتها ووظائفها الجزيئية. يتميز الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني بمزايا متعددة ، أهمها القدرة على جمع البيانات على مستوى الخلية المفردة ، مما يجعلها تقنية فريدة للتحقيق في مجال بيولوجيا الخلية. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني له قيود يمكن أن تتداخل مع الحصول على صور عالية الجودة. يمكن اختراق الصور بسبب كلا العاملين الخارجيين. تقلبات درجات الحرارة والاهتزازات والرطوبة والعوامل الداخلية ؛ الأس الهيدروجيني ، حركة الخلية. هنا ، نصف بروتوكولا للاكتساب الديناميكي لبروتين معين ، باركين ، مدمج مع البروتين الفلوري الأصفر المحسن (EYFP) من أجل تتبع الإزالة الانتقائية للميتوكوندريا التالفة ، باستخدام نهج الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني.

المقدمة

الالتهام الذاتي الكلي هو عملية داخل الخلايا تتضمن التحلل التقويضي لكل من المكونات الخلوية التالفة والمختلة وظيفيا ، مثل العضيات والبروتينات لغرض إعادة التدوير أو إنتاج الطاقة. لبدء عملية التمثيل الغذائي هذه ، تبتلع الخلية المكونات الخلوية التالفة في بنية غشاء مزدوج ، تعرف باسم البلعمة الذاتية ، والتي تندمج مع الجسيم الليزومي ويتحلل محتواه وإعادة تدويره 1،2. هناك نوعان رئيسيان من الالتهام الذاتي ، غير الانتقائي وانتقائي تحدث عملية الالتهام الذاتي غير الانتقائية عندما تكون الخلية في ظروف الحرمان من المغذيات وتحتاج إلى البحث عن كل من العناصر الغذائية الأساسية والطاقة. ومع ذلك ، يحدث الالتهام الذاتي الانتقائي للتوسط في إزالة كل من العضيات والبروتينات المختلة / التالفة التي يمكن أن تكون سامة. واحدة من أكثر عمليات الالتهام الذاتي الانتقائية التي تمت دراستها هي إزالة الميتوكوندريا ، والتي تسمى mitophagy 1،3-5.

الميتوكوندريا هي العضيات المركزية لعملية التمثيل الغذائي للخلايا والمصدر الأساسي للأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة المؤكسدة من خلال سلسلة نقل الإلكترون وأكسدة الأحماض الدهنية وحمض ثلاثي الكربوكسيل (TCA). علاوة على ذلك ، تنظم الميتوكوندريا إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وتطلق البروتينات التي تشارك في مسارات موت الخلايا 6-8.

كيناز المفترض الناجم عن PTEN 1 (PINK1) و Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) هما البروتينات الرئيسية المتورطة في عملية الانقسام. يمكن أن يحمي باركين من موت الخلايا عن طريق الحفاظ على صحة الخلية من خلال مراقبة جودة الميتوكوندريا9. عند فقدان إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، يتم تجنيد باركين العصاري الخلوي في الميتوكوندريا بواسطة PINK1. يؤدي هذا التجنيد إلى أحداث متسلسلة من mitophagy 10. هناك مجموعة واسعة من الأدلة على أن الانقسام هو عملية أساسية لمراقبة جودة الميتوكوندريا والتشوهات في هذه العملية تؤدي إلى الإصابة بالمرض 7. على سبيل المثال ، ارتبط مرض باركنسون الوراثي المتنحي بطفرات في الجينات التي تشفر باركين و PINK1 (PARK2 و PINK1 ، على التوالي) 11. تعد مراقبة جودة صحة الميتوكوندريا ضرورية لإزالة الميتوكوندريا التي تساهم في تراكم ROS12. يمكن أن يؤدي الوجود المفرط ل ROS داخل الخلايا إلى تلف كل من الحمض النووي والميتوكوندريا (الحمض النووي والحمض النووي MT ، على التوالي).

هنا ، نعرض نهج الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني لمتابعة تراكم باركين بعد تحريض الانقسام الانقسام بوساطة باركين في الخلايا الليفية الجنينية الخلدة للفأر عن طريق الإعطاء في المختبر للكربونيل سيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) -فينيل هيدرازون (FCCP) ، عامل فك الاقتران. يعطل FCCP تخليق ATP عن طريق قصر البروتونات عبر غشاء الميتوكوندريا الخارجي وبالتالي فصل الفسفرة المؤكسدة عن سلسلة نقل الإلكترون 13. يؤدي التسبب في إزالة استقطاب غشاء الميتوكوندريا إلى تعطيل الميتوكوندريا وإزالة الانتقائية المعتمدة على باركين. لذلك ، يمكن استخدام نقل الخلايا ذات الأهمية باستخدام ناقل تعبير يشفر باركين مدمج مع علامة فلورية (بروتين الفلورسنت الأصفر المحسن ، EYFP) كعلامة فلورية لمتابعة تجنيد باركين أثناء عملية الانقسام. من أجل تصور الميتوكوندريا ، شاركنا في نقل pDsRed2-Mito ، الذي يشفر بروتين الفلورسنت الأحمر (DsRed2) الذي يحتوي على تسلسل استهداف الميتوكوندريا للوحدة الفرعية للسيتوكروم ج أوكسيديز VIII (Mito). تم تصميم pDsRed2-Mito لوضع العلامات الفلورية على الميتوكوندريا14. يمكن قياس الوقت اللازم لنقل باركين إلى غشاء الميتوكوندريا ويعطي مقياسا غير مباشر للصحة الخلوية. على سبيل المثال ، يمكننا القول أنه إذا أظهر خط خلوي تم إقصاؤه لجين معين ذي أهمية إما تجنيد أسرع أو أبطأ لباركين بعد تحريض الانقسام بواسطة FCCP ، فإن هذا المنتج الجيني سيكون لاعبا رئيسيا من أجل الحفاظ على معدلات الأيض للخلية في الحالة الفسيولوجية ومنع تطور الأمراض. لذلك ، يوفر الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني أداة قوية للغاية لكل من تطبيقات البحث الأساسية والسريرية في متابعة ديناميكية البروتينات المصنفة أثناء عملياتها الجزيئية وفهم كيفية تأثر هذه العمليات أثناء الحالة المرضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. Electroporation للمن الخلايا الليفية مع كلا التعبير ناقلات EYFP-باركين وpDsRed2-ميتو

  1. تنمو الماوس خلدت الخلايا الليفية الجنينية في 10 سنتيمتر لوحة الأنسجة الثقافة باستخدام DMEM (Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر) متوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مليمول / لتر L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.
    1. في 80٪ confluency الخلية، تجاهل المتوسطة DMEM كاملة عن طريق الشفط معقمة وإضافة 10 مل من 1X العقيمة حل العازلة الفوسفات (PBS) (80 غرام من كلوريد الصوديوم، 2.0 غرام من بوكل، 14.4 غراما من نا 2 هبو 4، 2.4 غرام من KH 2 ص 4 و 1 لتر المقطر H 2 O، PH: 7.4).
    2. تجاهل برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط المعقم وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA 0.25٪. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (2-3 دقيقة). إضافة 4 مل من المتوسط ​​DMEM كاملة، resuspend الخلايا وإخراج 10 _6؛ لتر من تعليق خلية لمدة العد عدادة الكريات.
      ملاحظة: تم تصميم عدادة الكريات حتى أن عدد الخلايا في مجموعة واحدة من 16 الساحات الزاوية يساوي عدد الخلايا × 10 4 / مل.
  2. البذور 1 × 10 6 الخلايا على 10 سم أطباق زراعة الأنسجة 24 ساعة السابقة لعملية Electroporation لل.
  3. تجاهل المتوسطة DMEM كاملة عن طريق الشفط معقمة وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تجاهل برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط المعقم وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA 0.25٪. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (2-3 دقيقة). إضافة 4 مل من المتوسط ​​DMEM كاملة وresuspend الخلايا في أنبوب 15 مل.
  4. تدور الخلايا في أسفل 250 x ج لمدة 5 دقائق باستخدام الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية). تجاهل طاف بواسطة الشفط المعقم و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تدور الخلايا في أسفل 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. تجاهل طاف بواسطة الشفط العقيمة، وإضافة 100 ميكرولتر سو مزيج حل ل electroporation (82 ميكرولتر من Electroporation للحلول V + 18 ميكرولتر من حل التكميلي 1) إلى الخلية بيليه و resuspend بلطف بيليه بواسطة pipetting (لمزيد من التفاصيل يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم). إضافة 2 ميكروغرام من EYFP-باركين (الإثارة / الانبعاثات 514/527) و 1 ميكروغرام pDsRed2-ميتو (الإثارة / الانبعاثات 565/620) في تعليق خلية.
  6. نقل الحل لكفيت معقمة باستخدام باستور المتاح (ترد على حد سواء الأدوات مع عدة) وelectroporate باستخدام برنامج محدد سلفا المعاهد الوطنية للصحة / 3T3 U-030 (نبض واحد، والجهد 200 V، سعة 960 μF، الساعة نبض 20 ميلي ثانية ، عدد النبض: 1).
  7. مباشرة بعد Electroporation لل، إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط ​​قبل تحسنت الطازجة DMEM كاملة والبذور الخلية على 6 سم لوحة نسيج الثقافة الحية التصوير الصف واحتضان لهم في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

2. الوقت الفاصل بين الفيديو المجهر

    تعيين درجة حرارة الغرفة المجهر عند 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
  1. في هذه المرحلة، وإعداد وسيلة محددة التصوير الحي للمضي قدما في البروتوكول التجريبي. إعداد المتوسطة التصوير الحي على النحو التالي؛ مزيج DMEM خالية من الفينول تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مليمول / لتر L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين. قبل تدفئة المتوسطة التصوير الحي عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. تجاهل المتوسطة من الخلايا electroporated عن طريق الشفط المعقم وإضافة 1 مل من قبل حرارة متوسطة التصوير الحي، وذلك باستخدام الماصة P1000 واحتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. خلال الفترة وحة الحضانة، وتدفق 5٪ CO 2 في غرفة المجهر بالفعل عند درجة حرارة ثابتة من 37 درجة مئوية.
  4. وضع لوحة مع الخلايا electroporated إلى غرفة المجهر تجنب الحركات الكبرى أو اهتزازات.
  5. باستخدام واجهة البرنامج، تعيين المجهر من أجل كشف كل fluoreإشارات مسرح الحادث من البروتينات الانصهار المشفرة بواسطة ناقلات-transfected المشترك، EYFP-باركين (المدى الإثارة 495-510 نانومتر، ومجموعة الانبعاثات 520-550 نانومتر والأخضر) وpDsRed2-ميتو (الإثارة القصوى 558 نانومتر، والانبعاثات الحد الأقصى 583 نانومتر، أحمر).
    1. فتح الوقت الفاصل بين برامج الفيديو المجهر. في القائمة العلوية تحديد FITC لEYFP-باركين والرودامين لpDsRed2-ميتو. في القائمة العلوية اختر التكبير (20X).
  6. باستخدام واجهة البرنامج، والبحث عن خلية واحدة التعبير عن كل ناقلات-transfected المشترك وتسجيل موقف. كرر هذه الخطوة حتى يتم جمع ما لا يقل عن 10 خلايا لكل حالة تجريبية (المجموعة التجريبية).
    1. اختر من القائمة "تطبيقات" وانقر على موضوع اكتساب الأبعاد. في موضوع النوافذ اكتساب الأبعاد تحديد المعايير اللازمة، مثل عدد من عمليات الاستحواذ، لفترة من الزمن بين كل الاقتناء وموضع الخلية المسجلة. انقر على "اكتساب"لبدء عملية الاستحواذ.
  7. بدء اكتساب القاعدية كل من EYFP-باركين وDsRed2-ميتو إشارة الفلورسنت جمع الصور في كل 5 دقائق لفترة الإجمالي لمدة 15 دقيقة.
  8. إعداد قبل تحسنت المتوسطة التصوير الحي مع تركيز FCCP أعلى مرتين من تركيز العمل النهائية (0،1 حتي 10 ميكرومتر، نوع التي تعتمد على خلية).
  9. مقاطعة عملية اكتساب وإضافة بلطف 1 مل من قبل تحسنت المتوسطة التصوير الحي مع FCCP في لوحة داخل غرفة المجهر باستخدام الماصة P1000.
  10. استئناف عملية الاستحواذ كما هو موضح سابقا، لمدة إجمالية قدرها 3 ساعات، وذلك باستخدام موقف المسجلة. حفظ جميع الصور المكتسبة من أجل تحليلها وإنشاء شريط فيديو لعملية mitophagic عند شراء أكثر من.

3. تحليل

  1. جمع كل الصور تم الحصول عليها في شكل "و tiff" على جهاز كمبيوتر شخصي
  2. فتح الصور مع لينة الرسموير وتحديد الفترة الزمنية وقعت من الميتوكوندريا التي يسببها الاستقطاب مع FCCP إلى الصورة الأولى تظهر تجنيد باركين في غشاء الميتوكوندريا (يتم الحصول على الصور كل 5 دقائق). كرر هذا التحليل لكل خلية في المجموعة التجريبية.
  3. تسمية الخلية الأولى من العمود على جدول مع اسم المجموعة التجريبية. لكل المجموعة التجريبية، وقياس فترات الزمنية لتجنيد باركين ما لا يقل عن 10 الخلايا. جعل متوسط ​​فترات الزمنية المحسوبة لتجنيد باركين وتحديد الانحراف المعياري لكل مجموعة تجريبية (متوسط ​​± SD، ن = 10).
    1. تنظيم في أعمدة فترات زمنية محسوبة واحدة. يحتوي كل عمود ن = 10 قياسات صالح المجموعة التجريبية.
    2. حدد وظيفة "المتوسط" من القائمة بناء الصيغة. حدد البيانات في العمود. حدد وظيفة "الانحراف المعياري" من القائمة بناء الصيغة. سيليط البيانات في العمود.
  4. باستخدام المنهج الإحصائي، مقارنة المجموعات التجريبية تطبيق الإحصائية المناسبة من أجل تحديد فرق كبير في ديناميكية mitophagy بين المجموعات التجريبية. (على سبيل المثال، مجموعتين = الطالب اختبار t أو ثلاثة أو أكثر من مجموعات = أنوفا بالإضافة إلى اختبار ما بعد خاص)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا، وتبين لنا كم من الوقت الفاصل بين الفيديو المجهري هو أسلوب القوية التي يمكن استخدامها لمتابعة الأحداث الجزيئية من البروتينات fluorescently الموسومة في خلية واحدة. تظهر نتائج ممثلة أيضا كيف تسمح هذه التقنية لاقتناء صور ذات جودة عالية. عندما يتم الحصول على الصور من عملية الجزيئية، لدينا الفرصة لتحليلها بطرق مختلفة. هنا، نحن نحلل الفترة الزمنية بين بدء عملية mitophagy التي يسببها، والتي هي عملية الجزيئية الحيوية التي تحافظ على التوازن الخلوي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويمكن تعريف الوقت الفاصل بين المجهري كتقنية الذي يمتد التصوير الخلية الحية من ملاحظة واحدة في الوقت المناسب لمراقبة ديناميات الخلوية على مدى فترات طويلة من الزمن. وهذه المنهجية المتميزة من متحد البؤر بسيط أو المجهر الخلايا الحية لأنه يسمح للمراقب لتحديد في الوقت الحقيقي بروتين فلوري الموسومة احد ومتابعة ديناميكية في داخل الخلية الحية واحدة. في الواقع، لا يمكن للمتحد البؤر المجهري تحدد بسهولة البروتينات المسمى المناعية باستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت، لكنه لا يسمح مراقبة الخلية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (1R01CA137494 ، R01CA132115 ، R01CA086072 إلى RGP) ، ومنحة مركز كيميل للسرطان مركز المعاهد الوطنية للصحة للسرطان P30CA056036 (R.G.P.) ، منحة من مؤسسة أبحاث سرطان الثدي ، ومنح سخية من صندوق الأبحاث الطبية للدكتور رالف وماريان سي فالك (R.G.P.) ومنحة من وزارة الصحة في بنسلفانيا (R.G.P.). تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه لمؤسسة السرطان الأمريكية الإيطالية (G.D.) والموارد المشتركة للتصوير الحيوي لمركز سيدني كيميل للسرطان (NCI 5 P30 CA-56036). وتخلي الإدارة مسؤوليتها على وجه التحديد عن التحليل أو التفسيرات أو الاستنتاجات. لا يوجد تضارب في المصالح مرتبط بهذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMCorning Life Science10-013-CVPre-warm at 37 &# 176; C قبل الاستخدام
Corning Life Scienceالخالي من الفينول17-205-CVقبل التسخين في 37 &# 176 ؛ C قبل الاستخدام
مصل الأبقار الجنينيSigma-AldrichF2442قبل التسخين عند 37 &# 176 ؛ C قبل الاستخدام
L-GlutamineGibco25030Pre-warm at 37 &# 176 ؛ C قبل استخدام
البنسلين / الستربتومايسينCorning Life Science30-002-CIقبل التسخين عند 37 &# 176 ؛ C قبل الاستخدام
EYFP-PARKIN ناقلات التعبيرAddgene23955
pDsRed2-Mito ناقلات التعبيرClontech632421
Nucleofector 2B جهازLONZAAAD-1001S
Nucleofector للمجموعة R NIH / 3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M مجهر مقلوبكارل زايس
الكربونيل السيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) - فينيل هيدرازون (FCCP)سيجما ألدريتشC2920
الجزيئيةالمتحولةالمنشئ
ImageJالمعهد الوطني للصحةمنشئ تجريبي
DMEM الأجهزة التجريبي

المراجع

  1. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
  2. Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
  3. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
  4. Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
  5. Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
  6. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
  7. Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
  8. Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
  9. Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
  10. Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002(2012).
  11. Trinh, J., Farrer, M. Advances in the genetics of Parkinson disease. Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).
  12. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  13. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
  14. Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
  15. Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
  16. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
  17. Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
  18. Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
  19. Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
  20. Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
  21. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
  22. Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
  23. Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
  24. Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
  25. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  26. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
  27. Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
  28. Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
  29. Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
  30. Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
  31. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FCCP
الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو لتقييم EYFP-باركين تجميع كعلامة الخلوية Mitophagy
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.