مقالة منهجية

بدء التمايز في الخلايا متعددة القدرات مخلد أذني السلف

DOI:

10.3791/53692

⸱

يناير 2, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف البروتوكولات الحالية للحفاظ على خلايا السلف الأذني متعدد القدرات (iMOP) الخالدة وتمايز الأذن. يتم تسليط الضوء على ظروف الثقافة والعلامات الجزيئية التي تشير إلى التمايز إلى ظهارة حسية وخلايا عصبية عقدية حلزونية (SGN).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPSC) أو الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) لعلاجات استبدال الخلايا يحمل وعدا كبيرا. العديد من القيود بما في ذلك الغلة المنخفضة والمجموعات غير المتجانسة للخلايا المتمايزة تعيق تقدم العلاجات بالخلايا الجذعية. تم إنشاء خط خلايا سلف الأذن متعدد القدرات (iMOP) الخالد (iMOP) لتسهيل التمايز الفعال لأعداد كبيرة من خلايا الشعر الوظيفية والخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGN) لعلاجات استبدال خلايا الأذن الداخلية. بدءا من الثقافات المنفصلة لخلايا iMOP المفردة ، تم وصف البروتوكولات التي تعزز خروج دورة الخلية والتمايز عن طريق انسحاب عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF). تم تأكيد انخفاض كبير في تكاثر الخلايا بعد انسحاب bFGF باستخدام مقايسة تكاثر خلايا EdU. بالتزامن مع انخفاض الانتشار ، أدى التمايز الناجح إلى التعبير عن العلامات الجزيئية والتغيرات المورفولوجية. تم استخدام التلوين المناعي ل Cdkn1b (p27KIP) و Cdh1 (E-cadherin) في الغلاف الجوي المشتق من iMOP كمؤشر للتمايز إلى ظهارة حسية للأذن الداخلية بينما تم استخدام التلوين المناعي ل Cdkn1b و Tubb3 (الخلايا العصبية β-tubulin) لتحديد الخلايا العصبية المشتقة من iMOP. يوفر استخدام خلايا iMOP أداة مهمة لفهم قرارات مصير الخلية التي يتخذها أسلاف الحس العصبي للأذن الداخلية وسيساعد في تطوير بروتوكولات لتوليد أعداد كبيرة من خلايا الشعر المشتقة من iPSC أو الخلايا الشعرية المشتقة من ESC و SGNs. ستعمل هذه الطرق على تسريع الجهود المبذولة لتوليد خلايا الأذن للعلاجات البديلة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تتوسط أعضاء الأذن الداخلية ، والقوقعة ، والأوتريكول ، والكيس ، وثلاث قنوات نصف دائرية ، القدرة على السمع والتوازن. داخل القوقعة ، تقوم خلايا الشعر بتحويل الأصوات إلى إشارات كهربائية يتم نقلها إلى الخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGN). تطلق SGNs إمكانات عمل لنشر الإشارات العصبية عبر الدائرة السمعية. تساهم الطفرات الجينية والأدوية السامة للأذن والتعرض للأصوات العالية في موت خلايا الشعر و SGN مما يؤدي إلى فقدان السمع1-4. بمجرد فقدانها ، لا يتم استبدال هذه الخلايا. استخدام iPSC و ESC لتوليد خلايا الشعر الناشئة أو SGNs يحمل وعدا كبيرا لعلاجات استبدال خلايا الأذن الداخلية5-8. أظهرت موجة من التقدم أن الخلايا الجذعية متعددة القدرات والأسلاف المشتقة من الأذن الداخلية يمكن أن تتمايز إلى خلايا الشعر و SGNs في مراحل مختلفة من النضج. يمكن استخدام الخلايا الجذعية الجنينية للثدييات (ESC) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) لتوليد خلايا الشعر الوظيفية و SGNs9-11. كما ثبت أن الخلايا الجذعية والخلايا السلفية المشتقة من الأذن الداخلية للثدييات تشكل خلايا شعر وخلايا عصبية بخصائص نظيراتها الخلوية في الجسم الحي 12-16.

< p class = 'jove_content'> استخدام iPSC أو أسلاف الأذن المشتقة من ESC لاستبدال خلايا الشعر المفقودة و SGNs يتطلب تمايزا فعالا. يمكن أن يؤدي التمايز غير الصحيح أو التكاثر المستمر للأسلاف المشتقة من الساق المطعمة في الأذن الداخلية إلى تفاقم وظيفة الأذن الداخلية ويشكل خطرا على حدوث ورم مثل تكوين الأورام المسخية في الأذنالداخلية 17. هناك حاجة واضحة لتطوير ظروف الثقافة وفهم التمايز بين أسلاف الأذن. تتمثل إحدى الاستراتيجيات في تطوير هذه الأساليب في تلخيص قرارات مصير الخلية التي يتخذها أسلاف الحسيات العصبية أثناء نمو الأذن الداخلية. ستساعد البروتوكولات التي تمنع التكاثر وتوجه أسلاف الأذن إلى خلايا الشعر أو SGNs على تحسين سلامة وفعالية العلاجات البديلة.

أثناء التطور ، تبدأ الأذن الداخلية بسماكة الأديم الظاهر السطحي في منطقة مقيدة بين المعين 5 و 6 لتصبح اللوحة الأذنية. عندما تغزو اللويحة الأذنية لتشكيل كوب الأذن ، فإن مجموعة من الخلايا في المنطقة الأمامية من كأس الأذن تؤدي إلى ظهور المجال العصبي الحسي المختص (NSD) ، والذي يحتوي على سلائف خلايا الشعر والخلايا العصبية في الأذنالداخلية 18. تشير دراسات رسم خرائط المصير من الفئران والدجاج وأسماك الزرد التي تطور الأذن الداخلية إلى مجموعات متعددة من الأسلاف الحسية العصبية التي تؤدي إلى ظهور خلايا الشعر الحسية ، والخلايا الداعمة المحيطة والخلايا العصبية الأذنية19-22. عامل النسخ الجماعي عالي الحركة ، Sox2 ، متورط في مواصفات الخلية الحسية واستخدم كعلامة لأسلاف الأذن الداخلية23،24. تؤدي الطفرات غير المتهورة التي تقلل من مستويات تعبير Sox2 في الأذن الداخلية إلى فقدان خلايا الشعر والخلايا الداعمة و SGNs في القوقعة25،26.

لدراسة الخلايا السلفية الأذنية التي تخضع لقرارات مصير الخلية ، تم إنشاء خط خلية سلف الأذن متعدد القدرات (iMOP) المقيد مسبقا من Sox2 الذي يعبر عن أسلاف القوقعة الصناعية. تم اشتقاق خلايا iMOP في الأصل من القوقعة الجنينية E12.5-13.5 والمصابة بفيروس c-Myc القهقري27. يمكن أن تتكاثر خلايا iMOP باستمرار كخلايا مكونة للمستعمرة تعرف باسم الغلاف الأذني ولديها القدرة على التمايز إلى خلايا الشعر والخلايا الداعمة وSGNs 27. يسمح فهم قدرة خلايا iMOP على التمايز إلى سلالات أذن متميزة بتطبيق هذه النتائج لتوليد خلايا الشعر المشتقة من iPSC أو ESC و SGNs بكفاءة. ستفتح بروتوكولات التمايز الفعالة طرقا جديدة لعلاجات استبدال الخلايا لأمراض الأذن الداخلية المتمردة للعلاجات التقليدية. تتمثل إحدى المشكلات الحاسمة في توليد الخلايا الأذنية عن طريق زراعة الخلايا في المختبر في وجود علامات تمايز تساعد في تحديد ما إذا كانت الخلايا تخضع للتمايز. تم استخدام Cdkn1b (p27KIP) على نطاق واسع كعلامة مبكرة للتمايز في تطوير الأذن الداخلية ، ومع ذلك ، لم يتم معالجة التعبير عن Cdkn1b في خلايا iMOP وكيف يرتبط بالتمايز. في هذه الدراسة ، يتم وصف ظروف الثقافة الحالية وكيفية ارتباط تعبير Cdkn1b بالعلامات الأخرى لتمايز iMOP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الحفاظ على التجديد الذاتي في الخلايا IMOP

  1. إعداد IMOP سائل الإعلام والثقافة: DMEM / F12، 1X B27 تكملة، 25 ميكروغرام / مل carbenecillin و 20 نانوغرام / مل bFGF. جعل 50 مل من IMOP سائل الإعلام والثقافة باستخدام الكواشف معقمة. الاحماء 49 مل من DMEM / F12 في المخروطية 50 مل في 37 ° C حمام الماء.
    1. ذوبان الجليد 50X B27 تكملة وفلتر تعقيم 100 ملغ / مل carbenecillin قسامات لمدة 5 دقائق في حمام مائي 37 ° C. ذوبان الجليد من 100 ميكروغرام / مل bFGF قسامة في RT. إضافة 1 مل 50X B27، 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل bFGF و 12.5 ميكرولتر من 100 ملغ / مل carbenecillin في DMEM / F12.
  2. استخدام 3 مل من وسائل الإعلام في 60 ملم صحن زراعة الأنسجة للخلايا زراعة IMOP. إضافة وسائط جديدة لثقافات كل يوم من خلال مضاعفة حجم وسائل الاعلام. ضمان لا يسهو أن تركيز bFGF أقل من 5 نانوغرام / مل.
    1. خلايا IMOP الثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. خلايا مرور بعد 5-7 أيام في الثقافة كما هو موضح في الخطوات التالية. ثقافة نقل إلى 15مل المخروطية باستخدام ماصة 10 مل.
  3. جعل 1 ملم EDTA في HBSS عن طريق تمييع 0.1 مل من 0.5 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8،0 إلى 50 مل من HBSS. قبل دافئ 1 ملم EDTA المحرز في HBSS في 37 ° C حمام الماء.
  4. حصاد الخلايا عن طريق الترسيب الجاذبية أو الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. في RT. لخطورة الترسيب، ضع مخروطي 15 مل تحتوي على الثقافات في الحاضنة 37 درجة مئوية ل5-10 دقيقة. بعد ذلك الوقت، ومراقبة otospheres جمع في الجزء السفلي من مخروطي 15 مل.
    ملاحظة: قوة الطرد المركزي المفرط يمكن أن يسبب تلف الخلايا.
  5. بعناية قضى نضح وسائل الإعلام باستخدام 2 مل الشفط ماصة دون الإخلال بيليه الخلية. إضافة 0.5 مل من قبل تحسنت حل 1 ملم EDTA HBSS إلى الخلية بيليه. باستخدام ماصة P1000، الماصة بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات. وضع المخروطية في 37 ° C واحتضان ل<5 دقائق لتسهيل التفكك إلى خلايا واحدة.
  6. دوامة بلطف حل الخلية لتحديد ما إذا كان يتم فصل otospheres. إذا لم اوتومجالات الرواسب في قاع مخروطي، وفصل الخلايا. قد تختلف وقت الحضانة.
    ملاحظة: سوف المطول الحضانة مع EDTA يؤدي إلى موت الخلايا المفرط.
  7. إزالة الخلايا من 37 ° C، إضافة 2 مل من وسائل الاعلام لتحييد ويخفف من EDTA. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح من المخفف EDTA باستخدام 2 مل الشفط ماصة وإضافة 5 مل من 1X PBS لغسل الخلايا.
  8. تدور الخلايا في أسفل 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT ونضح من 1X PBS باستخدام 2 مل الشفط ماصة. resuspend الخلايا باستخدام ماصة P1000 في 0.5 مل من IMOP سائل الإعلام والثقافة من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
  9. عد الخلايا باستخدام عداد الجسيمات ميكروفلويديك مع الأشرطة المناسبة 28. وهناك لوحة متكدسة من خلايا IMOP يحتوي ~ 6 X10 6 خلايا. تمييع الخلايا 1: 100 في وسائل الإعلام وإضافة 75 ماي من حل الخلية في شريط كاسيت لفرز الأصوات. لوحة 1 × 10 6 خلايا في طبق 6 سم في IMOP cultuإعادة سائل الإعلام (~ 1: 10 تمييع). iMOPs مرور كل 5-7 أيام.
    ملاحظة: الخلايا التي تشكل otospheres كبيرة أو نعلق على الجزء السفلي من صحن زراعة الأنسجة والتفريق. الخلايا سوف يموت أيضا إذا كان الثقافات قد ولت متموجة.

2. التجميد والذوبان خلايا IMOP

  1. إعداد الاصطناعية المتوسطة تجميد كتبها الذوبان وتوازنه الحل إلى 4 درجات مئوية قبل خلايا التجميد.
  2. جمع الخلايا من سم طبق متموجة 6 خلايا IMOP. استخدام ماصة 10 مل ونقل الخلايا (~ 6-8 × 10 6 خلايا) في مخروطي 15 مل.
  3. حصاد الخلايا عن طريق الترسيب الجاذبية أو الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إذا كان otospheres صغيرة، والخلايا لا تسوية عن طريق الجاذبية الترسيب. اختياري: عد الخلايا باستخدام الخطوة 1.9 لتحديد إجمالي أعداد الخلايا.
  4. قضى نضح وسائل الإعلام باستخدام 2ML الشفط ماصة مع ترك الخلية بيليه فضفاضة وراء.
  5. إضافة 0.25 مل من وسائل الإعلام تجميد الاصطناعية ل resuspend مLLS في كثافة ~ 5 × 5-3 أكتوبر × 10 6 خلية / مل. ماصة بلطف الخلايا مع ماصة P1000. نقل تعليق الخلية إلى قارورة المبردة باستخدام ماصة P1000 مع 1 مل تصفيتها طرف.
  6. ضع قارورة في وعاء تجميد خالية من الكحول ووضع الحاوية تجميد في -80 ° C إلى خفض درجة حرارة 1 ° C في الدقيقة الواحدة حتى تصل درجة الحرارة -80 ° C.
  7. للتخزين على المدى الطويل من الخلايا، ونقل قنينات إلى مرحلة البخار من السائل خزان النيتروجين. لذوبان الجليد من الخلايا للثقافة وتتوازن قارورة المبردة التي تحتوي على الخلايا المجمدة في -80 ° C.
  8. قبل دافئ وسائل الإعلام ثقافة IMOP في 37 ° C حمام الماء.
  9. ذوبان الجليد القارورة المجمدة بسرعة يحوم أسفل القارورة في 37 ° C حمام الماء. إضافة 1 مل من IMOP قبل تحسنت وسائل الإعلام ثقافة إلى الخلايا إذابة مرة واحدة يختفي الكريستال الجليدي الأخير. نقل الخلايا إلى 15 مل المخروطية وإضافة 4 مل إضافية من IMOP سائل الإعلام والثقافة
  10. تدور 15 مل المشتركnical لمدة 5 دقائق. في 200 x ج ونضح وسائل الإعلام المستهلك. resuspend الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة IMOP وخلايا لوحة في طبق 6 سم. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 للتوسع.

3. تمييز الخلايا الحسية IMOP في الظهارة

  1. إعداد 50 مل من IMOP وسائل الإعلام ظهائر الحسية التمايز: DMEM / F12، 1X B27 تكملة، 25 ميكروغرام / مل carbenecillin. جعل 50 مل من IMOP الحسي وسائل الإعلام ظهائر التمايز. الاحماء 49 مل من DMEM / F12 في المخروطية 50 مل في 37 ° C حمام الماء. ذوبان الجليد 50X B27 تكملة و 100 ملغ / مل carbenecillin قسامات لمدة 5 دقائق. في 37 ° C حمام الماء. إضافة 1 مل 50X B27 و 12.5 ميكرولتر من 100 ملغ / مل carbenecillin في DMEM / F12.
  2. حصاد، فصل، و resuspend وعدد الخلايا كرر الخطوات من 1،4-1،9
  3. لوحة 1 × 10 6 خلايا في طبق 6 سم في يوم -3 باستخدام IMOP سائل الإعلام والثقافة. في يوم 0 والثقافات نقل باستخدام ماصة 10 مل إلى 15 مل المخروطية. جمع اوتوالمجالات عن طريق الجاذبية الترسيب كما ذكر في الخطوة 1.6. نضح من قضى وسائل الإعلام باستخدام 2 مل الشفط ماصة وترك otospheres على الجزء السفلي من المخروطية.
  4. إضافة بلطف في 2 مل من وسائل الإعلام الحسي ظهائر التمايز. نقل otospheres إلى طبق 6 سم باستخدام كبيرة تحمل 10 مل ماصة.
    ملاحظة: القص الميكانيكية من pipetting لالقاسي يمكن أن تنأى الخلايا من otospheres.
  5. إضافة 2 مل من الحسي جديدة وسائل الاعلام الظهارية التمايز إلى ثقافات كل يوم. إذا لزم الأمر، والخلايا التي يمكن جمعها بواسطة الترسيب الجاذبية وسائل الإعلام استبدالها.
  6. جمع otospheres في يوم 10 عن طريق نقل إلى 15 مل المخروطية والسماح للotospheres على الرسوبيات كما جاء في خطوة 1.6.Aspirate وسائل الإعلام قضى باستخدام 2 مل الشفط ماصة وترك otospheres دون عائق.
  7. إصلاح otospheres التي يحتضنها في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة في RT. إزالة الحل الفورمالديهايد، وغسل otospheres مع غسل العازلة (1X PBS تحتوي على 0.1٪ TritonX 100) قبل تفرخ في عرقلة العازلة (1X PBS تحتوي على 10٪ مصل الماعز العادي و 0.1٪ تريتون X-100) لمدة 1 ساعة.
    1. استبدال العازلة واحتضان عينات في عرقلة العازلة مع الأجسام المضادة المخفف. احتضان عند 4 درجات مئوية. عينات غسل مع 1X PBS تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 موضوع وotosphere إلى 27 المناعية. otospheres نقل إلى 1X PBS وotospheres المكان إلى تصاعد وسائل الإعلام على شريحة زجاجية باستخدام ماصة P1000. وضع ساترة على عينة والسماح لوسائل الإعلام متزايدة لتجف في 4 درجات مئوية.
  8. الحصول على صور epifluorescence باستخدام الإعداد مجهر مقلوب مزودة بكاميرا CCD 16 بت وإما 20X 0.75 الهواء أو NA الهدف الغمر النفط 40X 1.3. جمع مضان من قنوات مختلفة الألوان باستخدام المدرجة (الإثارة والانبعاث) الأطوال الموجية: الأزرق (377 ± 25 نانومتر / 447 ± 30 نانومتر) والأخضر (475 ± 25 نانومتر / 540 ± 25 نانومتر) والأحمر (562 ± 20NM / و 625 20NM ±) والأشعة تحت الحمراء (628 ± 20NM / و 692 ± 20نانومتر).

4. يعاير ايدو التأسيس

  1. في يوم -3، لوحة 1 × 10 6 خلايا IMOP في طبق 6 سم. بعد ثلاثة أيام على يوم 0، الحصاد، فصل، و resuspend وعدد الخلايا بتكرار الخطوات 1،4-1،9.
  2. لوحة 2.5 × 10 5 خلايا في وسائل الإعلام ثقافة IMOP و5 X10 5 الخلايا الحسية في وسائل الإعلام ظهائر التمايز في آبار مختلفة من صحن 6 جيدا.
  3. تحديد النسبة المئوية للخلايا في المرحلة S من قبل ايدو التأسيس في يوم 3 باستخدام التأسيس فحص EDU
    1. إضافة الأسهم ايدو مباشرة على ثقافات IMOP للحصول على تركيز النهائي من 1 ميكرومتر ايدو في وسائل الإعلام الثقافة.
    2. احتضان ايدو في الثقافات IMOP لمدة 2 ساعة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. الحصاد، وفصل وجمع الخلايا كرر الخطوات من 1،4-1،9. أضيف في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة. في RT لإصلاح الخلايا. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة الحل الفورمالديهايد وبصورة ملائمةذ التصرف.
    3. نوى تسمية الخلايا مع هويشت وأدرجت ايدو مع الأخضر مضان صبغ أزيد وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
      ملاحظة: تتم جميع يغسل مع 1X PBS، 3٪ BSA و 0.1٪ خلايا توين 20. غسل مع 1X PBS مرتين.
    4. خلايا جبل على شريحة باستخدام antifade كاشف وتضع كوب 1.5 غطاء على عينة. الحصول على صور الفلورسنت من الخلايا المسمى باستخدام المجهر epifluorescence.

5. تمييز الخلايا العصبية المستمدة IMOP

  1. جعل 50 مل من وسائل الإعلام تمايز الخلايا العصبية: Neurobasal وسائل الإعلام، 1X B27 تكملة، 2 مم L-الجلوتامين. زجاجة ذوبان الجليد من 50X B27 و 200 ملي L-الجلوتامين في 37 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق. إضافة 1ML 50X B27 و 0.5 مل 200 ملي L-الجلوتامين إلى 48.5 مل من وسائل الإعلام Neurobasal.
  2. معطف ساترة عن طريق وضع 12 ملم 1.5 coverslips الزجاج في العقيمة 10 سم لوحة وإضافة 70٪ ETOH لوحة لتعقيم وتنظيف لل coverslips.
  3. تستنهض الهمم بلطف كوفrslips لضمان يتم تغطيتها في الإيثانول. ترك لوحة لمدة 10 دقيقة في RT. شطف لل coverslips 3 مرات مع العقيمة 1X PBS لتغسل الإيثانول المتبقية. شطف ساترة مرة واحدة مع H العقيمة 2 0 لتغسل ما تبقى 1X PBS.
  4. نضح H 2 0 باستخدام 2 مل الشفط ماصة والسماح لل coverslips الجافة. كشف لل coverslips للأشعة فوق البنفسجية في غطاء الثقافة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. متجر coverslips في بيئة معقمة إذا لم يتم استخدامها فورا.
  5. وضع ساترة واحد 12 ملم في كل بئر من صحن 24 أيضا. يهز لوحة بلطف لضمان لل coverslips شقة تقع في الجزء السفلي من البئر.
  6. ذوبان الجليد 2 ملغ / مل بولي-D-يسين حل السهم عند RT وتمييع إلى 10 ميكروغرام / مل تركيز بولي-D-يسين في برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 0.25 مل من 10 ميكروغرام / مل بولي-D-ليسين إلى الآبار. ترك لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  7. غسل الآبار 3 مرات مع العقيمة 1X PBS. ذوبان الجليد 10 ملغ / مل حل الأسهم laminin في RT وتمييع إلى 10 ميكروغرام / ملتر في 1X PBS. إضافة 0.25 مل من 10 ميكروغرام / مل laminin حل العمل في بئر واحدة من طبق 24 متعددة جيدا. احتضان لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية. نضح من الحل laminin باستخدام 2 مل الشفط ماصة.
  8. غسل ساترة 3 مرات مع 1X PBS عن طريق إضافة في 1 مل من 1X PBS مع ماصة P1000 وإزالة PBS 1X بواسطة الشفط مع 2 مل الشفط ماصة. ترك 1X PBS من غسل الماضي في البئر حتى الخلايا على استعداد لتكون مطلية. الشروع في تمايز الخلايا العصبية من قبل الحصاد، وعدم الربط عد الخلايا في الخطوات 1.4-1.9.Plate 1 × 10 6 خلايا في طبق 6 سم في يوم -3.
  9. في يوم 0، الحصاد، وفصل عدد الخلايا عن طريق تكرار 1،4-1،9. البذور 1 × 10 5-1،5 × 10 5 خلايا IMOP إلى 0.5 مل قبل تحسنت وسائل الإعلام تمايز الخلايا العصبية لكل بئر في 24 طبق متعددة جيدا. نضح وإضافة قبل تحسنت وسائل الإعلام تمايز الخلايا العصبية للثقافات كل يوم.
  10. إصلاح الخلايا العصبية IMOP المشتقة في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة. اتي RT يوم 7. إزالة الحل الفورمالديهايد، وغسل الخلايا العصبية IMOP المشتقة مع غسل العازلة (1X PBS تحتوي على 0.1٪ TritonX-100) قبل تفرخ في عرقلة العازلة (1X PBS تحتوي على 10٪ مصل الماعز العادي و 0.1٪ تريتون X-100) لمدة 1 ساعة.
    1. استبدال العازلة واحتضان عينات في عرقلة العازلة مع الأجسام المضادة المخفف. احتضان عند 4 درجات مئوية. عينات غسل مع 1X PBS تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 الخلايا المناعية تخضع ل27. غسل ساترة مع 1X PBS قبل وضع على وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. السماح لوسائل الإعلام متزايدة لتجف في 4 درجات مئوية قبل الحصول على الصور epifluorescence كما هو موضح في الخطوة 3.8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bFGF سحب النقصان انتشار في خلايا IMOP

للتقليل من قدرة التكاثري من الخلايا IMOP والشروع في تمايز الخلايا IMOP، تم سحب bFGF من الثقافات. للتأكد من أن عامل النمو انسحاب يقلل الانتشار، كان يعمل ايدو التأسيس كشرط فحص الانتشار. وتمت مقارنة نسبة الخلايا التي أدرجت ايدو من otospheres مثقف مع وسائل الإعلام ثقافة IMOP (التي تحتوي على bFGF) و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رصد الثقافات IMOP

يوصف بروتوكول للحفاظ على تجديد الذات وتعزيز تمايز خط خلية IMOP الرواية ويتم تضمين صيغ تصفيح إضافية (الجدول 1). وأشار العديد من الخطوات الهامة التي تساعد على توسيع الروتيني وتمايز الخلايا IMOP. على غرار المحفزة مزارع الخلايا الجذعية، الخلايا IMOP لها نظريا لأجل غير مسمى تمتد الحياة. للتأكد من أن خطوط الخلايا يتم الاحتفاظ بشكل صحيح، ويتم رصد الثقافات IMOP بشكل روت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل جزئيا من قبل صندوق الوقف لكرسي تطوير أعضاء هيئة التدريس Duncan و Nancy MacMillan (K.Y.K.) ، ومنحة Busch للأبحاث الطبية الحيوية (KYK) ومنحة تطوير أعضاء هيئة التدريس في روتجرز (KK).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حاويات تجميد الخلايا الخالية من الكحول من CoolCell LX قواريرBioCisionBCS-405
(2 مل)  كورنينج430654
غطاء زجاجي 1.5 سماكة (دائري 12 مم)علوم المجهر الإلكتروني72230-01
DMEM / F12Life Technologies11320-082
تقنيات العمرالمتوسط العصبيالقاعدي 21103
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) درجة الحموضة 7.4تقنيات الحياة10010-023
هانك محلول الملح المتوازن (HBSS)Life Technologies14025-092
B27 Supplement (50X) مصلFree Life Technologies17504-044مخزنة على شكل 1 مل من
L-Glutamine (200 mM)  Life Technologies25030-081مخزنة على شكل 5 مل من
Mouse LamininLife Technologies23017-015مخزنة على شكل 1 مجم / مل
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze Cryoconservation MediaLife TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade MountantLife Technologies47743-736مخزنة على شكل 10 مجم / مل 100 وميكرو ؛ ل aliquots
Moxi Z Mini Automated Cell CounterOrflo   ؛MXZ001
Moxi Z كاسيت Type SOrflo MXC002
نمو الخلايا الليفية المؤتلفة للفئران ، أساسي (bFGF)Peprotech450-33معلق في 0.1٪ BSA في H20 وتخزينه على شكل 20 مجم / مل
Poly-D-LysineSigmaP7886معلق في 1X PBS وتخزينه على شكل 10 مجم / مل 100 & ميكرو ؛ ل aliquots
Carbenicillin ، ملح ثنائي الصوديومThermo Fisher ScientificBP2648-1معلق في 10 ملي مولار Hepes درجة الحموضة 7.4 وتخزينها على شكل 100 مجم / مل ماصة
ملفوفة بشكل فردي غلاف ورقي (200 / علبة)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 مل ماصة ملفوفة بشكل فردي غلاف ورقي (200 / علبة)ثيرمو فيشر Scientific1367811E
ثقافة الأنسجة المعالجة Biolite 24 بئر لوحةThermo Fisher Scientific130188
زراعة الأنسجة المعالجة Biolite 6-Well PlateThermo Fisher Scientific130184 
زراعة الأنسجة المعالجة 6 سم طبقThermo Fisher Scientific130181 
EMD Millipore Millex حقنة معقمة PVDF مرشح حجم المسام: 0.22 & مThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne نصائح ماصة مرشح 0.1 - 10 & ل طرف مرشح ممدودالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1120-3810
TipOne نصائح ماصة مرشح 1 - 20 & ل طرف مرشحالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1120-1810
TipOne نصائح ماصة مرشح 1 - 200 مو ؛ l  تلميح المرشحالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1120-8810
TipOne نصائح ماصة مرشح 101 - 1000 مو ؛ ل طرف مرشحالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1126-7810
15 مل أنابيب مخروطية معقمة 20 كيس من 25 أنبوب (500 أنبوب) الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1475-0511
50 مل أنابيب مخروطية معقمة 20 كيسا من 25 أنبوبا (500 أنبوب) الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1500-1211
التبريد Natural عامل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314(2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289(2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33(2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

iMOP bFGF EdU Cdkn1b Cdh1 Cdkn1b Tubb3

مقالات ذات صلة