يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليف Thermogelling بولي (N-isopropylacrylamide) المركبات كبريتات -graft-الكوندروتن مع الجيني المجهرية الدقيقة لهندسة الأنسجة

11.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53704

⸱

أكتوبر 26, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

في هذه المقالة

ملخص

سقالة هندسة الأنسجة عن طريق الحقن تتكون من بولي (N-isopropylacrylamide) -graft-شوندروتن كبريتات أعد (PNIPAAm-ز-CS) المحتوية المجهرية الدقيقة الجينات. ويتم تحليل قوة لاصقة، وتورم الخصائص وفي توافق مع الحياة المختبر في هذه الدراسة. تقنيات توصيف وضعت هنا قد تكون قابلة للتطبيق لأنظمة thermogelling أخرى.

الملخص

يتم تعريف الحيوية عن طريق الحقن والمواد القابلة للزرع التي يمكن إدخالها في الجسم كسائل وترسيخ في الموقع. هذه المواد توفر مزايا السريرية ليتم زرعها الحد الأدنى جراحية وسهولة تشكيل المواد الصلبة ملء الفضاء في العيوب غير منتظمة الشكل. وقد تم التحقيق على نطاق واسع الحيوية عن طريق الحقن كما السقالات للهندسة الأنسجة. ومع ذلك، من أجل إصلاح بعض المناطق الحاملة في الجسم، مثل القرص الفقرية، السقالات ينبغي أن تمتلك خصائص لاصقة. وهذا التقليل من خطر التفكك أثناء الحركة وضمان اتصال حميم مع الأنسجة المحيطة، وتوفير نقل كاف من القوات. هنا، نحن تصف إعداد وتوصيف سقالة تتألف من حراريا بولي حساسة (N-isopropylacrylamide) كبريتات -graft-الكوندروتن (PNIPAAM-ز-CS) والمجهرية الدقيقة الجينات. كوبوليمر PNIPAAm-ز-CS تشكل حلا لزج في الماء عند RT، إلى التي alginatوالجسيمات العالقة الإلكترونية لتعزيز التصاق. فوق درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST)، حوالي 30 درجة مئوية، والبوليمرات تشكل مادة هلامية الصلبة في جميع أنحاء المجهرية الدقيقة. تكيفنا الإجراءات الحيوية توصيف القياسية لتأخذ في الاعتبار المرحلة الانتقالية عكسها من PNIPAAm-ز-CS. وتشير النتائج إلى أن إدراج جزيئات الجينات / 50 مل أو 75 ملغ إلى 5٪ (ث / ت) الحلول PNIPAAm-ز-CS اربعة اضعاف قوة لاصقة الشد من PNIPAAm-GCS وحده (ف <0.05). إدماج المجهرية الدقيقة الجينات أيضا إلى زيادة كبيرة في القدرة تورم PNIPAAm-ز-CS (ع <0.05)، مما يساعد على الحفاظ على هلام ملء الفضاء داخل عيوب الأنسجة. وأخيرا، نتائج المختبر في علم السموم عدة الفحص، 2،3-bis- (2-ميثوكسي-4-نيترو-5-sulfophenyl) -2H-نتروبلو-5-carboxanilide (XTT) ولايف / فحص قابلية الميت تشير إلى أن لاصق غير قادرة على دعم بقاء وانتشار مغلفة الكلى الجنينية البشرية (كلوة) 293 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية أكثر من 5 أيام.

المقدمة

المواد الحيوية عن طريق الحقن هي تلك التي يمكن أن يتم تسليم مريح في الجسم كسائل وترسيخ في الموقع. وقد طبقت هذه المواد على نطاق واسع في الطب التجديدي، حيث يتم استخدامها لتوصيل الخلايا مغلفة لموقع المتضررين 1-4 ويكون بمثابة المصفوفة خارج الخلية مؤقتة ثلاثية الأبعاد للخلايا 5. بالنسبة للمريض، الحيوية عن طريق الحقن هي مفيدة لأن العمليات الجراحية لزرع هي الحد الأدنى الغازية والصلبة مرحلة يمكن ملء شكل غير منتظم عيوب الأنسجة، مما يلغي الحاجة لزراعة ذي الحجم المخصص.

Injectability لا يمكن أن يتحقق من خلال مجموعة متنوعة من الآليات. عوامل خارجية، مثل درجة الحموضة، وقد تم التحقيق بمثابة نقطة انطلاق لتشكيل المواد الهلامية التي تغلف الخلايا والجزيئات الحيوية النشطة 6-8. ومع ذلك، ودرجة الحموضة قد لا تكون على الزناد الأكثر ملائمة للاستخدام في جميع البيئات الفسيولوجية. ألترنا التقليدي آخرTIVE لتحقيق injectability يستخدم في الموقع البلمرة الكيميائية أو يشابك. وضعت مجموعة نظام الأكسدة القابلة للذوبان في الماء يتكون من فوق كبريتات الأمونيوم وN، N، N '، N' -tetramethylethylenediamine واستخدامها للتفاعل macromers يتكون من غليكول البولي إيثيلين والبولي (البروبيلين) غليكول 9،10. crosslinked زان وآخرون. 11 شبكات الشيتوزان البولي فينيل الكحول عن طريق الحقن المتقدمة مع غلوتارالدهيد. في مثل هذه الأنظمة، يجب النظر في السمية الخلوية من المكونات المتفاعلة، خاصة بالنسبة للتطبيقات التي تنطوي على تغليف الخلايا. أيضا، يمكن أن البلمرة الطاردة للحرارة ينتج درجة حرارة عالية كافية لتقديم تنازلات الأنسجة المحيطة، والتي تم الإبلاغ عن العظام البوليمر يعزز 12،13.

لا يزال تم وضع أنظمة البوليمر عن طريق الحقن الأخرى التي تظهر على التغيير من السائل إلى الحالة الصلبة مع درجة الحرارة كما الزناد. ما يسمى نظم thermogelling، وهذه هي aqueoلنا البوليمر الحلول التي لا تتطلب التحفيز الكيميائي، أحادية، أو crosslinkers لتحقيق في تشكيل الوضع الطبيعي 14. بدلا من ذلك، مرحلة انتقالية وعادة ما تحدث بالقرب درجة الحرارة الفسيولوجية الحث على تشكيل شبكة ثلاثية الأبعاد crosslinked جسديا. Poloxamers مثل Pluronic F127 هي من بين البوليمرات الأكثر دراسة على نطاق واسع لthermogelling تسليم المخدرات 15-17 وخلية التغليف 18،19. ومع ذلك، فمن المقبول تماما أن هذه المواد الهلامية تفتقر إلى الاستقرار في الظروف الفسيولوجية. وقد أظهرت الدراسات زيادة الاستقرار باستخدام موسعات سلسلة 20 أو crosslinkers الكيميائي 21،22. ومع ذلك، فإن استخدام هذه الكواشف قد تحد من إمكانات المواد لتغليف الخلايا.

بولي (N-isopropylacrylamide) هو thermogelling البوليمر الاصطناعية التي حظيت باهتمام كبير في هندسة الأنسجة والمخدرات تسليم 14. المحاليل المائية للبولي (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) تبدي درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST)، وعادة ما تحدث في جميع أنحاء 32-34 درجة مئوية 23،24. تحت LCST والماء يرطب سلاسل PNIPAAm. فوق درجة حرارة التحول، البوليمر يصبح مسعور، مما أدى إلى مرحلة الفصل المثير 25-27 وتشكيل هلام الصلبة دون استخدام أحادية السامة أو crosslinkers. ومع ذلك، homopolymers PNIPAAm يحمل خصائص المرونة الفقيرة وعقد شرب القليل من الماء في درجة حرارة الفسيولوجية بسبب للا مائية 28. في هذا العمل، نختار لدمج سلفات تساهمي في شبكة PNIPAAm، والذي يوفر إمكانية التحلل الأنزيمي 29، والنشاط المضادة للالتهابات 30،31، وزيادة المياه وامتصاص العناصر الغذائية 32. تم إعداد بوليمرات PNIPAAm مع CS في مختبرنا من قبل البلمرة وNIPAAm مونومر بحضور-functionalized ميتاكريليت CS لتشكيل البوليمرات المطعمة (PNIPAAm-ز-CS). بيكause من منخفض الكثافة يشابك من البوليمرات، PNIPAAm-ز-CS يشكل حل لزجة في الماء عند RT وهلام مرونة في درجة حرارة الفسيولوجية بسبب LCST 29. تصبح الحلول البوليمر flowable مرة أخرى على تبريد تحت LCST بسبب انعكاس حالة من التحول.

لقد أثبتنا أن PNIPAAm-ز-CS لديه القدرة لتكون بمثابة سقالة هندسة الأنسجة، بسبب الخواص الميكانيكية التي يمكن أن تكون مصممة، التحلل، وcytocompatibility مع الكلى الجنينية البشرية (كلوة) 293 الخلايا 29. ومع ذلك، في بعض المناطق الحاملة، مثل القرص الفقري، يجب أن يكون السقالات هندسة الأنسجة القدرة على تشكيل واجهة كبيرة مع الأنسجة المحيطة القرص للقضاء على خطر التفكك 33. هذه الواجهة هي ضرورية أيضا لنقل كافية من القوة عبر واجهة بين الزرع والنسيج 33. في عملنا، ونحن قد علقتالمجهرية الدقيقة lginate في المحاليل المائية من PNIPAAm-ز-CS ووجدت أن دبق يموضع في المجهرية الدقيقة، والتي توفر التصاق مع الأنسجة المحيطة 34. في هذه الورقة، ونحن الخطوط العريضة الخطوات لإعداد thermogelling البوليمر لاصقة. تم تكييف التقنيات القياسية لتوصيف المواد الحيوية، التصوير الخلية، والمقايسات للبقاء على أن تأخذ في الاعتبار حساسية درجة حرارة من البوليمر والعودة إلى الوراء لمرحلة انتقالية. البوليمر عن طريق الحقن وصفها في هذه الورقة لديها امكانات واسعة لتسليم المخدرات وهندسة الأنسجة التطبيقات خارج تلك الموضحة في هذه الورقة. وعلاوة على ذلك، فإن أساليب توصيف الموصوفة هنا قد تكون قابلة للتطبيق لأنظمة thermogelling أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. بولي (N-isopropylacrylamide) -g-شوندروتن كبريتات التجميعي

  1. قبل تركيب هيدروجيل bioadhesive، تنقية N-isopropylacrylamide (NIPAAm) مونومر وسلفات ميتاكريليت (CS).
    1. تزن بها لا يقل عن 10 غراما من NIPAAm وحل مونومر في 400 مل من ن الهكسان عند 60 درجة مئوية. إثارة الحاوية بشكل دوري حتى حل كامل. أعد بلورة الحل في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    2. إزالة مونومر تبلورت من الحاويات وفراغ مرشح ن الهكسين باستخدام القمع بوخنر. وضع مونومر في فرن فراغ في RT لمدة 24 ساعة لإزالة أي المتبقية ن الهكسان. تخزين مونومر في الثلاجة -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا (انظر الخطوة 1.2).
    3. تزن بها وتذوب 2.0 غرام من كبريتات شوندروتن في 8.0 مل من الماء منزوع الأيونات. تسخن بلطف الحل إلى 60 درجة مئوية.
    4. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 10 باستخدام ما يقرب من 10-40 ميكرولتر من 50٪ (ث / ث) هيدروكسيد الصوديوم.
    5. إضافة 0.298 مل من الخل ميثاكريليك (MA). الجزر لمدة 24 ساعة، مع التحريك عند 60 درجة مئوية.
    6. صب 400 مل من محلول الاسيتون في وعاء والبرد O / N في الثلاجة -20 درجة مئوية.
    7. بعد 24 ساعة انقضت، صب ببطء الحل بأكمله methacrylated CS (MCS) في 400 مل من الأسيتون البارد، مع التحريك مع شريط مغناطيسي.
    8. إزالة MCS من الأسيتون ووضع راسب في فرن فراغ. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة للحفاظ على دولة سليمة ومتماسكة لMCS. السماح للالأسيتون المتبقية لتتبخر تحت فراغ لا يقل عن 24 ساعة.
  2. شارك في حل 10 غرام من NIPAAm تنقيته و2.209 غرام من MCS في 232 مل من الماء منزوع الأيونات.
  3. تطهير حل الأكسجين باستخدام غاز النيتروجين الخامل. الحفاظ على القوي، ولكن انخفاض معدل تدفق الغاز لمنع الحل من السطح على مدى 15 دقيقة.
  4. تواصل تطهير حل مع غاز النيتروجين وإضافة 0.976 مل من tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. التالي، والشروع في رد فعل البلمرة عن طريق خلط 97.6 ملغ من فوق كبريتات الأمونيوم (APS).
  6. مزيج الحل لحوالي 20 ثانية وبسرعة ختم الحل لمنع أي الهواء من دخول السفينة. السماح للحل لتتبلمر تحت ضوء الفلورسنت لمدة 24 ساعة.
  7. بعد 24 ساعة، وضع وعاء التفاعل إلى 37 درجة مئوية الفرن. السماح للهيدروجيل للانتقال من الحالة السائلة إلى حالة تشبه الهلام. غمر هيدروجيل بلمرة في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ليصبح المجموع 7 أيام للسماح للنشر مونومر غير المتفاعل من هيدروجيل.
  8. باستخدام زوج من مقص، وقطع هيدروجيل إلى عدة قطع صغيرة، لا يزيد عن 5 سم في القطر. لمنع هيدروجيل من الانتقال من حالة تشبه الجل السائل، الزهر البوليمر داخل الحل C PBS 37 درجة. نقل أجزاء إلى 50 مل أنابيب مخروطية.
  9. تحضير عينات للتجفيد التفاف قممالأنابيب مع Kimwipes والأربطة المطاطية. تجميد الأنابيب عند -70 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
  10. وضع أنابيب مخروطية على مجفف تجميد لإزالة جميع المياه من هيدروجيل. قبل التشغيل، يحتاج مجفف تجميد للوصول إلى درجة الحرارة والضغط من حوالي -40 درجة مئوية و 0.04 م بار، على التوالي. مطلوب ما لا يقل عن 7 أيام لتجفيف كامل.
  11. طحن تجميد المجفف البوليمر إلى مسحوق ناعم وتخزينها في 4 درجات مئوية الثلاجة لاستخدامها لاحقا (راجع الخطوة 3.1).

2. الكالسيوم-الجينات Crosslinked Microparticle التجميعي

  1. إعداد 2٪ (ث / ت) حل الجينات عن طريق إذابة 400 ملغ في 20 مل من الماء منزوع الأيونات. الحرارة الحل إلى ما يقرب من 60 درجة مئوية لتسهيل حل.
  2. إعداد 2٪ (ث ت /) محلول كلوريد الكالسيوم بإضافة 400 ملغ إلى 20 مل من الماء منزوع الأيونات.
  3. خلق النفط في خليط المياه من خلال الجمع بين 100 مل من زيت الكانولا، 1.0 مل من توين 20، و 20 ملمن 2٪ (ث / ت) الجينات. استحلب الخليط لمدة 10 دقيقة مع الخالط في 15000 دورة في الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك، مع مزيج من شريط مغناطيسي في 200 دورة في الدقيقة أو 2000 دورة في الدقيقة لخلق المجهرية الدقيقة كبيرة أو صغيرة، على التوالي.
  4. نضح 2٪ (ث / ت) محلول كلوريد الكالسيوم باستخدام حقنة مع 18 G طرف الإبرة. ببطء إضافة كلوريد الكالسيوم قطرة من الحكمة في مستحلب.
  5. مرة واحدة وقد تم استنفاد 20 مل من كلوريد الكالسيوم، والسماح للالمجهرية الدقيقة داخل مستحلب لتشعبي لمدة 10 دقيقة.
  6. بالتساوي توزيع الدفعة المجهرية الدقيقة في توج أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لقوة من 1400 x ج لمدة 2 دقيقة لإزالة الطبقة الأولى من زيت الكانولا.
  7. على التوالي غسل، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي في المجهرية الدقيقة مع الأيزوبروبانول ما مجموعه ثلاث مرات في 1400 ز لمدة 2 دقيقة لإزالة أي زيت الكانولا المتبقية. تجاهل طاف الأيسوبروبانول بعد كل خطوة الطرد المركزي، ويغسل مع الأيزوبروبانول جديدة.
  8. وبمجرد أن منظمة اوكسفام الدوليةتمت إزالة لتر، كرر الإجراء الغسيل ثلاث مرات إضافية مع الماء منزوع الأيونات لإزالة أي الأيسوبروبانول المتبقية. تجاهل طاف منزوع الأيونات الماء بعد كل خطوة الطرد المركزي، ويغسل بالماء منزوع الأيونات الطازجة. إزالة ما يقرب من 100 ملغ من المجهرية الدقيقة الرطب وتخزينها في قارورة. سيتم استخدام المجهرية الدقيقة الرطب لقياس متوسط ​​قطر دفعة بواسطة المجهر الضوئي.
    1. باستخدام المجهر الضوئي، تفريق عينة صغيرة من المجهرية الدقيقة الرطب في الماء منزوع الأيونات على شريحة المجهر. اعتمادا على حجم المجهرية الدقيقة، واستخدام الهدف 10X أو 20X، وضبط الفتحة العددية حتى تتفتت الجزيئات إلى التركيز. تأكد من أن المجهر يتم معايرة للهدف الصحيح وضبط سطوع مصدر الضوء حسب الحاجة. استخدام أداة خط لقياس أطول قطر من 50 المجهرية الدقيقة الجينات عشوائي والحصول على متوسط ​​حجم الدفعة.
  9. إعداد المجهرية الدقيقة لتجفيد بذ التفاف عليها مع Kimwipes وتأمينها مع الأربطة المطاطية. تجميد المجهرية الدقيقة في -70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  10. وضع المجهرية الدقيقة على مجفاد والسماح للعينة لتجف لمدة لا تقل عن 24 ساعة. طحن تجميد المجهرية الدقيقة المجفف إلى مسحوق ناعم باستخدام هاون ومدقة وتخزينها في 4 درجات مئوية الثلاجة لاستخدامها لاحقا (راجع الخطوة 3.3).

3. إعداد المواد اللاصقة

  1. باستخدام مسحوق البوليمر تجميد المجفف، إنشاء 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS حل عن طريق إذابة 50 ملغ من مسحوق هيدروجيل في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  2. مزيج الحل باستخدام الدوامة والبرد في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. وبمجرد أن أشكال حل لزجة، إنشاء مركب متجانس بإضافة 25 أو 50 ملغ من تجميد المجفف المجهرية الدقيقة الجينات إلى حل هيدروجيل ودوامة. تخزين المركبة في ثلاجة عند 4 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا (انظر الخطوات 4.3 و 4.8).

4. Bioadhesive الميكانيكيةاختبارات الشد anical

  1. قبل إجراء اختبارات الشد، استخراج الغضروف الركيزة من الأذن الخنزير.
    1. تذويب أذن الخنزير في حارة 0.9٪ (ث / ت) حل كلوريد الصوديوم. هذا سوف يساعد على تخفيف الأنسجة.
    2. باستخدام مشرط، عزل وقسم من منطقة مسطحة، مستطيلة من خلال خفض عموديا على الرغم من أن طبقة البشرة والأنسجة تحت الجلد، والغضاريف. تجنب قطع التلال منحنية الأذن الخنزير.
    3. فصل طبقة البشرة من الجلد من الغضروف عن طريق خفض مواز من خلال الأنسجة تحت الجلد. الغضروف هو والأنسجة الصلبة البيضاء الموجودة تحت الجلد الخنازير.
    4. كشط بعناية الأنسجة تحت الجلد التي يتم تركيبها في الغضروف مع الجانب من مشرط. تجنب قطع في أنسجة الغضروف مع شفرة المشرط.
    5. تأكد من جانب واحد فقط من الغضروف يتعرض وشقة خلال اختبار الشد. إذا لزم الأمر، تتسطح الغضروف بقطع الجلد متفاوتة على الجانب السفلي.
    6. قطع أنسجة الغضروف الى عدة قطع مع أبعاد 1 سم × 1 سم. تخزين الأنسجة الغضروف في أنابيب مخروطية مليئة 0.9٪ (ث / ت) كلوريد الصوديوم الحل في الثلاجة -20 درجة مئوية.
  2. تحضير 2.0 لتر من 0.9٪ (ث / ت) حل كلوريد الصوديوم. قبل تسخين المحلول الملحي إلى 37 درجة مئوية. فإن درجة حرارة هذا الحل يحتاج إلى الحفاظ عليها طوال الاختبار.
  3. تذويب الغضروف المجمدة. تبقي على حد سواء الغضروف الخنازير والعينات هيدروجيل في وعاء الستايروفوم مع كمادات الثلج.
  4. إرفاق قياس قوة ذراع موقف الاختبار. وضع موقد على أعلى من موقف قوة وضبط درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية.
  5. ألصق 1 سم × 1 سم قطعة من الغضروف إلى كتلة الفولاذ المقاوم للصدأ مع الغراء cyanoacrylate وزوج من ملاقط. الغراء قطعة إضافية من الغضروف إلى الأسطوانة Delrin وإرفاق اسطوانة لقياس قوة. من المهم جدا أن كلا من أسطح الغضروف تواجه بعضها البعض والاتصال هيدروجيل.
  6. مكانحمام مائي زجاجي على أعلى لوحة الساخنة وإدراج كتلة الفولاذ المقاوم للصدأ مع الركيزة الغضروف داخل الحمام.
  7. انخفاض ذراع موقف الاختبار ومحاذاة كل من ركائز الغضاريف مع بعضها البعض. رفع الذراع وترك مساحة كافية لتطبيق هيدروجيل.
  8. مع ماصة الإزاحة الإيجابية، الاستغناء عن 200 ميكرولتر من هيدروجيل bioadhesive إلى أسفل قطعة من الغضروف.
  9. انخفاض ذراع موقف قوة في 1 مم / دقيقة حتى الاتصالات هيدروجيل قطعة العلوي من الغضروف ويمارس قوة التحميل المسبق من 0.001 N.
  10. صب 37 ° C حل المالحة في الحمام حتى يصل حجم منسوب المياه المعينة. تحقق درجة حرارة الحل مع الحرارية.
  11. السماح للهيدروجيل لضبط ما مجموعه 5 دقائق. مرة واحدة وقد عززت هلام، ورفع الذراع بسرعة 2 مم / دقيقة. اكتمال الاختبار مرة واحدة يفصل bioadhesive من الركيزة الغضروف أو عندما يحدث انخفاض كبير في القوة،مما يشير إلى الفشل.
  12. جمع البيانات المسجلة ورفع ذراع موقف الاختبار. إزالة الاسطوانة Delrin من قياس قوة. صب محلول ملحي في حاوية السابقة ويسخن إلى 37 درجة مئوية.
  13. حساب الضغوط عن طريق طرح قوة من البوليمر المبذولة من قوة الطفو على "بياض"، المرفق Delrin مع عدم وجود غضروف أو لاصق، والتي أثيرت في نفس المعدل، وقسمة الناتج على منطقة السندات.

5. تورم دراسة PNIPAAm-ز-CS مع الجيني المجهرية الدقيقة

  1. إعداد قارورة زجاجية نظيفة والتسمية عليها بشكل مناسب مع نقطة زمنية، نوع العينة، وعدد العينة. يمكن أيضا إنشاء مواد لاصقة، كما هو موضح سابقا. إعداد ما مجموعه خمس عينات (ن = 5) لكل نوع العينة في نقطة زمنية.
  2. قبل تزن كل قارورة من الزجاج وتسجيل كتلتها الأولية في RT.
  3. باستخدام حقنة، الاستغناء عن حوالي 0.4 مل من عينة لاصقة مستعدة في كل من قارورة خمسة.كرر هذه الخطوة لكل نوع العينة في جميع النقاط الزمنية التي تم اختبارها.
  4. وزن وتسجيل كتلة كل قارورة مع لاصقة نوع العينة في RT.
  5. قبل تدفئة حاضنة المدارية و1 لتر من محلول برنامج تلفزيوني 1X إلى 37 درجة مئوية.
  6. تنظيم كل من القوارير على رف وإدراج رف في الحاضنة. السماح للمواد لاصقة للانتقال من الحالة السائلة إلى مادة هلامية ما يقرب من 5 إلى 10 دقيقة.
  7. إضافة 5.0 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل قارورة. تأكد من إضافة بعناية الحل برنامج تلفزيوني على طول الجانب من القارورة لمنع القرص هيدروجيل من التفكك.
  8. تتويج كل قارورة لمنع التبخر من الحل في برنامج تلفزيوني والحفاظ على درجة الحرارة الداخلية للحاضنة عند 37 درجة مئوية. وسيكون لكل مجموعة من أقراص هيدروجيل تحتاج أن تظل غارقة في برنامج تلفزيوني لفترة معينة من الزمن.
  9. مرة واحدة وقد تم التوصل إلى نقطة زمنية 7 أيام، إرفع قبعة مجموعة من قارورة وإزالة الحل برنامج تلفزيوني من كل قارورة. تزن كل قارورة مع عينة من المواد اللاصقة مرة أخرى في RT.
<ص الطبقة = "jove_title"> 6. النوعية بقاء الخلية باستخدام لايف / الفحص الميت

  1. قبل تنفيذ ايف / فحص الميت مع PNIPAAm-ز-CS، وتنمو في الكلى الجنينية البشرية 293 الخلايا (كلوة-293) إلى 80٪ التقاء.
    1. سريعة الذوبان المجمدة كلوة-293 تعليق الخلية عن طريق وضع cryovial في 37 ° C حمام الماء، ثم الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
    2. لجعل متوسط ​​نمو الخلايا اول ممر، والجمع في ارتفاع نسبة الجلوكوز (4.5 جم / لتر) Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) إلى تركيز النهائي من 20٪ والحل البنسلين الستربتوميسين 100X ( القلم بكتيريا) إلى تركيز النهائي من 100 وحدة دولية / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل. لجميع المقاطع الأخرى، والتحول إلى DMEM مع 10٪ FBS و1X القلم بكتيريا.
    3. resuspend الكرية خلية في 10 مل من وسط النمو ونقل تعليق في واحدة 100 ملم طبق بتري قطر. د بالتساويistribute الخلايا عن طريق إمالة بلطف الجبهة طبق لدعم واليسار إلى اليمين عدة مرات كل اتجاه.
    4. ثقافة الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. إذا لزم الأمر، تغيير المتوسطة كل يومين.
    5. عندما تصل خلايا 80٪ confluency، تكرار الثقافة في أطباق متعددة. إزالة المتوسطة من لوحة.
    6. إضافة 1 مل من 0.5٪ التربسين إلى اللوحة. السماح لوحات لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحقق لمعرفة ما إذا كان فصل الخلايا من السطح يحوم بلطف لوحة.
    7. لتقسيم الثقافة 01:10، إضافة 9 مل من المتوسط ​​النمو المنتظم (DMEM مع 10٪ FBS) إلى الخلايا trypsinized وبلطف مزيج من قبل إمالة الطبق.
    8. الاستغناء 1 مل من تعليق خلية المخفف إلى كل طبق جديد وإضافة 9 مل من متوسط ​​النمو. المزيج بلطف عن طريق إمالة الطبق.
    9. ثقافة الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. إذا لزم الأمر، تغيير المتوسطة من أي وقت مضىذ يومين حتى خلايا تصل إلى 80٪ التقاء.
  2. إزالة وسائل الإعلام من أطباق ثقافة اثنين نمت إلى 80٪ التقاء.
  3. إضافة 1 مل من 0.5٪ التربسين إلى كل لوحة. السماح لوحات لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحقق لمعرفة ما إذا كان فصل الخلايا من السطح يحوم بلطف لوحة.
  4. غسل الخلايا كلوة-293 على لوحة مع 3 مل من متوسط ​​النمو مرتين وإضافة كل تعليق لنفس أنبوب مخروطي 15 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 15 مل لمدة 10 دقيقة في 400 x ج في 4 درجات مئوية.
  6. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 3 مل من المتوسط ​​من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  7. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية في عدادة الكريات وإجراء تعداد خلايا لتحديد كثافة الخلية. زيادة حجم تعليق متوسطة إذا كان تركيز الخلية الأولي مرتفع جدا، وعلى العكس من خفض مستوى الصوت إذا كان تركيز منخفض جدا، من أجل الحفاظ على تناسق الهدفالتموينية من 1 × 10 6 خلية / مل. الطرد المركزي الخلايا كلوة-293 في 400 x ج و resuspend بيليه خلية في حجم تصحيح من وسائل الاعلام وفقا لذلك.
  8. دوامة بلطف تعليق الخلية وتوزيعها بالتساوي على مزيج الخلية إلى أربعة أنابيب منفصلة 15 مل المخروطية لظروف الاختبار التالي: أحادي الطبقة مراقبة إيجابية، ومراقبة سلبية قتلوا في PNIPAAm-ز-CS باستخدام 70٪ (ت / ت) والميثانول، وكلوة-293 خلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS، وكلوة-293 الخلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات.
  9. إنشاء الطبقات الوحيدة مراقبة إيجابية من قبل pipetting متعددة من 300 مجلدا ميكرولتر من مزيج الخلية إلى 24 لوحة جيدا لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  10. إزالة وسائل الإعلام من الأنابيب المخروطية المتعلقة السيطرة قتل، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات.
    1. أنابيب الطرد المركزي المخروطية لمدة 5 دقائق في 400 x ج وإزالة طاف.
    2. الحفاظ على تركيز خلية نفسه عن طريق إعادة التعليق على جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في نفس الحجم من PNIPAAm-ز-CS كما وسائل الإعلام إزالتها. ماصة مزيج خلية البوليمر صعودا وهبوطا باستخدام ماصة المصلية حتى متجانسة.
      1. إذا البذر مع المجهرية الدقيقة الجينات، نقل تعليق PNIPAAm-ز-CS-الخلية (التي تم الحصول عليها كما هو موضح ل6.10.2) في طبق ثقافة 35 ملم وأعرض الجسيمات في هذا المزيج. ماصة مزيج خلية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة المصلية حتى متجانسة.
    3. باستخدام ماصة المصلية، الاستغناء متعددة 300 ميكرولتر من مزيج خلية البوليمر في كل من الآبار من أجل السيطرة قتل، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  11. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة، والسماح للPNIPAAm-ز-CS الانتقال من الحالة السائلة إلى مادة هلامية (البوليمر يشكل قرص معتم والأبيض).
  12. ضع شريحة دفئا في غطاء محرك السيارة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. استخدام الشريحة الأكثر دفئا للحفاظ على لوحة جيدادرجة الحرارة وماصة 600 ميكرولتر من وسائل الاعلام قبل تحسنت في كل بئر. لمزيد من منع الانتقال من البوليمر إلى الحالة السائلة، ضع مصباح مع لمبة الفلورسنت فوق طبق في عملية الاحماء في الهواء فوقه.
  13. احتضان الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  14. بعد انقضاء خمسة أيام، وإعداد مزيج صبغ لايف / الميت باستخدام homodimer إيثيديوم (EthD-1) وcalcein AM. كلا مواد خفيفة حساسة وأعد في يوم من الاستخدام.
    1. تذويب AM calcein وEthD-1 من عدة في RT.
    2. إضافة 5 مل من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X إلى أنبوب مخروطي الشكل والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم.
    3. إضافة 6.67 ميكرولتر من 2 ملي EthD-1 إلى أنبوب مخروطي الشكل. دوامة الخليط حل شامل.
    4. المقبل، إضافة 2.5 ميكرولتر من 4 مم calcein صباحا إلى أنبوب مخروطي الشكل. دوامة الخليط جيدا.
  15. إزالة وسائل الإعلام من آبار أحادي الطبقة (مراقبة إيجابية)، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS خفة دمالمجهرية الدقيقة ح الجينات. يغسل كل من الآبار بدقة، ولكن بلطف، مع برنامج تلفزيوني وإزالة برنامج تلفزيوني.
  16. السماح للأقراص هيدروجيل تحتوي على المجهرية الدقيقة الجينات لتسيل على RT وإضافة 2 مل من 50 ملي سيترات الصوديوم إلى كل من الآبار.
  17. إزالة وسائل الإعلام من الآبار خلية قتل (المراقبة السلبية). السماح للأقراص هيدروجيل لتسيل على RT وإضافة 300 ميكرولتر من 70٪ (V / V) الميثانول إلى كل بئر.
  18. احتضان لوحة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  19. إزالة سترات الصوديوم والحلول الميثانول من الآبار وماصة كل من الايقاف هيدروجيل إلى أنابيب microcentrifuge الفردية. أنابيب الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة لفصل الخلايا من تعليق هيدروجيل.
  20. إزالة بعناية تعليق من قبل pipetting الحل من أنبوب مخروطي الشكل، وترك وراء بيليه الخلية. Resuspend وبيليه في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقل إلى لوحة جيدا الأصلية.
  21. إضافة 300 ميكرولتر من رانه لايف / مزيج صبغ الميت إلى كل من الآبار. التفاف لوحة جيدا في رقائق الألومنيوم واحتضان لمدة 45 دقيقة على الروك في RT.
  22. صورة كل من العينات تحت المجهر مضان مقلوب مع هدف 10X. والخلايا الحية والخلايا مقتل عرض مضان الأخضر والأحمر على التوالي.

7. الكمية بقاء الخلية باستخدام الفحص XTT

  1. تنمو كلوة-293 الخلايا إلى 80٪ التقاء. إزالة وسائط النمو من أطباق ثقافة اثنين.
  2. إضافة 1 مل من 0.5٪ التربسين إلى كل لوحة. السماح لوحات لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحقق لمعرفة ما إذا كان فصل الخلايا من السطح يحوم بلطف لوحة.
  3. غسل الخلايا كلوة-293 على لوحة مع 3 مل من وسائل الاعلام مرتين وإضافة كل تعليق لنفس أنبوب مخروطي 15 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 15 مل لمدة 10 دقيقة في 400 x ج في 4 درجات مئوية.
  5. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 3 مل من وسائل الاعلامpipetting صعودا وهبوطا.
  6. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية في عدادة الكريات وإجراء تعداد خلايا لتحديد كثافة الخلية. كما هو موضح سابقا، والحفاظ على تركيز الهدف من 1 × 10 6 خلية / مل. الطرد المركزي الخلايا كلوة-293 في 400 x ج و resuspend بيليه خلية في حجم تصحيح من وسائل الاعلام وفقا لذلك.
  7. دوامة بلطف تعليق الخلية وتوزيعها بالتساوي على مزيج الخلية إلى أربعة أنابيب منفصلة 15 مل المخروطية لظروف الاختبار التالي: أحادي الطبقة مراقبة إيجابية، ومراقبة سلبية قتلوا في PNIPAAm-ز-CS باستخدام 70٪ (ت / ت) والميثانول، وكلوة-293 خلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS، وكلوة-293 الخلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات.
  8. إنشاء الطبقات الوحيدة مراقبة إيجابية من قبل pipetting 300 ميكرولتر من مزيج الخلية إلى 24 لوحة جيدا لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  9. إزالة وسائل الإعلام من الأنابيب المخروطية المتعلقة السيطرة قتل، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات.
    1. أنابيب الطرد المركزي المخروطية لمدة 5 دقائق في 400 x ج وإزالة طاف.
    2. الحفاظ على تركيز خلية نفسه عن طريق إعادة التعليق الخلايا في نفس الحجم من PNIPAAm-ز-CS كما وسائل الإعلام إزالتها. ماصة مزيج خلية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة المصلية حتى متجانسة.
      1. إذا البذر مع المجهرية الدقيقة الجينات، نقل تعليق PNIPAAm-ز-CS-خلية في صحن الثقافة 35 مم وإدخال الجزيئات في هذا المزيج. ماصة مزيج خلية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة المصلية حتى متجانسة.
    3. باستخدام ماصة المصلية، الاستغناء عن 300 ميكرولتر من مزيج خلية البوليمر في كل من الآبار من أجل السيطرة قتل، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  10. مرة واحدة فقط من العينات التي تحتوي على الخلايا التي تمت إضافتها إلى لوحة 24-جيدا، الاستغناء متعددة من 300 مجلدا ميكرولتر من PNIPAAm-ز-CS وPNIPAصباحا-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات دون الخلايا في الآبار المجاورة لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  11. احتضان لوحة 24-جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة، والسماح للPNIPAAm-ز-CS الانتقال من الحالة السائلة إلى مادة هلامية (البوليمر يشكل قرص معتم والأبيض).
  12. ضع شريحة دفئا في غطاء محرك السيارة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. استخدام الشريحة الأكثر دفئا للحفاظ على درجة حرارة جيدا لوحة وماصة 600 ميكرولتر من DMEM واضحا قبل تحسنت في كل بئر. لمزيد من منع الانتقال من البوليمر إلى الحالة السائلة، ضع مصباح مع لمبة الفلورسنت فوق طبق في عملية الاحماء في الهواء فوقه.
  13. احتضان الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
  14. بعد انقضاء خمسة أيام، وإعداد 2،3 bis- (2-ميثوكسي-4-نيترو-5-sulfophenyl) -2H-نتروبلو-5-carboxanilide (XTT) كاشف من الشركة المصنعة. كاشف XTT هو ضوء حساسية واستعداد في يوم من الاستخدام.
    1. إزالة زجاجة العنبر تحتوي علىجي مسحوق XTT من الثلاجة. باستخدام محقنة معقمة وإبرة، حقن 5 مل من DMEM واضح (لا أحمر الفينول) من خلال الحاجز المطاطي في زجاجة العنبر.
    2. حرارة الكاشف إلى 56 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقيقة أو حتى يذوب.
    3. وعلاوة على ذلك تمييع كاشف XTT إلى 20٪ (ت / ت) في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل ملفوفة في رقائق الألومنيوم. قسامة كاشف XTT الزائد في أنابيب microcentrifuge ووضعها في الثلاجة -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  15. إزالة وسائل الإعلام من الآبار خلية قتل (المراقبة السلبية) وإضافة 300 ميكرولتر من 70٪ (V / V) الميثانول إلى كل بئر. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وإزالة الميثانول من الآبار.
  16. إزالة وسائل الإعلام من الآبار المتبقية من أحادي الطبقة (مراقبة إيجابية)، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات. يغسل كل من الآبار بدقة، ولكن بلطف، مع برنامج تلفزيوني ثم قم بإزالة برنامج تلفزيوني.
  17. إضافة 300 ميكرولتر من 20٪ XTT كاشف لكل من الآبار. التفاف 24 لوحة جيدا في رقائق الألومنيوم واحتضان لمدة 24 ساعة على الكرسي الهزاز في RT.
  18. بعد 24 ساعة، إضافة 200 ميكرولتر من 50 ملي سيترات الصوديوم إلى كل من الآبار واحتضان على الروك لساعة إضافية واحدة.
  19. نقل كل من الايقاف البوليمر لأنابيب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
  20. نقل 200 ميكرولتر من طاف من كل أنبوب microcentrifuge لوحة 96-جيدا. باستخدام لوحة القارئ عيار مكروي، الحصول على قراءات الامتصاصية محددة في 450 قراءات الامتصاصية نانومتر وغير محددة في 690 نانومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم توليفها واستجابة حراريا المطعمة البوليمر المشترك بنجاح وتميز لقوتها bioadhesive، وتورم الخصائص، وفي cytocompatibility المختبر. اخترنا للتحقيق في الجينات نظرا لخصائص mucoadhesive راسخة لها. والمخلوطة المجهرية الدقيقة الجينات، مع متوسط ​​قطرها 59.7 ± 14.9 ميكرون، مع 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS بتركيزات 25، 50، و 75 ملغ / مل. واستندت هذه التركيزات على نصف واحد، أي ما يعادل، وضعف ما يعادل الوزن الجاف للPNIPAAm-ز-CS في محلول مائي. تركيز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هناك العديد من الخطوات الهامة في توليف مركب هيدروجيل-microparticle وتقييم قوتها لاصقة، وتورم القدرة، وتوافق مع الحياة الخلوية. بلمرة الجذور الحرة من PNIPAAm-ز-CS تتطلب methacrylation ناجحة من سلفات، والحل الكامل للمكونات مونومر، وظروف التفاعل خالية من الأكسجين. وقد تم اختيار نسبة NIPAAm مونومر لسلفات methacrylated في خليط التفاعل لأنه تم التدليل عليه، في عملنا السابق، لتوليد بوليمرات ذات خصائص ميكانيكية مشابهة لفقرات الأم القرص الأنسجة 29. وزيادة كمية سلفات في هيدروجيل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أن نعترف بامتنان المساعدة من الدكتورة جنيفر Kadlowec في تطوير لاصقة الشد اختبار البروتوكول.

وأيد البحث عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية والمعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية من المعاهد الوطنية للصحة تحت بجائزة عدد 1R15 AR 063920-01. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
N-isopropylacrylamide ، 99٪ ، نقي ، مستقرAcros Organics2210-25-5قم بتبريد وإزالة المثبت باستخدام الهكسان
كبريتات شوندروتن ملح الصوديوم (من القصبة الهوائية البقرية)Sigma-Aldrich39455-18-0قم بتبريد
الهكسانفيشر ScientificH302-4يحفظ في خزانة قابلة للاشتعال
50٪ (وزن / وزن) هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificSS254-1كاوية بطبيعتها
أنهيدريد ميثاكريليكسيجما ألدريتش276685أبخرة قوية ؛ استخدم في غطاء الدخان
AcetoneFisher ScientificA18-4Chill في الثلاجة قبل الاستخدام
غاز النيتروجينPraxair7727-37-9رقم القطعة: NI 4.8 ، نمط الأسطوانة T ، 99.998٪ نيتروجين نقي (يمكن استخدام الأرجون كغاز خامل بديل)
رباعي ميثيل إيثيلين ديامين ، 99٪ نقاءAcros Organics110-18-9
بيرسولفات الأمونيومسيجما ألدريتشA3678استرطابي ويتحلل في وجود الماء
أقراص ملحية مخزنة بالفوسفاتفيشر ScientificBP2944حافظ على
حمض الألجنيك الجاف وملح الصوديومAcros Organics177775000استخدم الحرارة للمساعدة في الذوبان
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيومفيشر ScientificC79
زيت الكانولامتجراحصل عليه من متجر محلي
Tween 20Sigma-Aldrich93773
70٪ (v / v) IsopropoanolFisher ScientificA416-4
آذان الخنازيرلحم الخنزيرعليه من جزار محلي
كلوريد الصوديومفيشر ساينتفيكS271-3
الكلى الجنينية البشرية 293 خليةATCCATCC CRL-1573تخزينها في النيتروجين السائل للاستخدام طويل الأمد
DMEM: 1x ، نسبة عالية من الجلوكوز ، بدون بيروفاتتقنيات الحياة11965126تبريد
مصل الأبقار الجنينيLife Technologies10082-147تبريد
Penn Strep: 10,000 U / mlLife Technologies15140-122تبريد
التربسين-EDTA: 0.5٪ ، 10xLife Technologies15400-054تبريد
الميثانولVWRAAA44571-K7
مجموعة قابلية للخلايا الحية / الميتةLife TechnologiesL3224حساسة للضوء ، حافظ على
مجموعة جدوى خلية XTTSigma AldrichTOX2-1KTحساسة للضوء ، حافظ على مجمدة
Clear DMEM: 1x ، نسبة عالية من الجلوكوز ، بدون فينولLife Technologies21063-029قم بتبريد
برنامج تلفزيون Dulbecco: 1xLife Technologies14190136تبريد
سترات الصوديومEMDSX0445-1
ماصة الإزاحة الإيجابيةBrandTech Scientific ، INC2702904توزع 100 - 500 & micro ؛ ل ويأتي مع نصائح قابلة للإرفاق
رقم 3. مقبض مشرط من الفولاذ المقاوم للصدأSigma AldrichS2896
شفرات جراحية معقمة Miltexفيشر ساينتفيك12-460-440مقاس 10
خالط الأحجار الكريمةPower Fisher Scientific08-451-660نموذج # 125
ملاط ومدقة من البورسلينSigma AldrichZ247464يحمل 50 مل
FreeZone 1 L نظام تجميد تجميدLabconco7740020تجميد العينات قبل الاستخدام
مضخة ريشة دوارة محكمة الغلقإدواردزA65301906موديل # RV5
احتضان شاكر مداريVWR12620-946نموذج # 980153
طرد مركزي مبرد على الطاولةفورما علمي ، INCموديل # 5682
أفران ساخنةVWRموديل # 1235PC
2 N مقياس القوةشيمبوFGV-0.5XYنموذج # FGV-0.5XY
حامل اختبار القوة الإلكترونيةشيمبوFGS-200PVنموذج # FGS-200PV
ثقافة الأنسجة يتأرجح دلو الطرد المركزيبيكمان كولتر366830نموذج #6S-6KR
الطرد المركزي الدقيق لثقافة الأنسجةمجموعة مقياس الدم إيبندورفموديل #5415C
Hausser Scientific3720يتطلب استبدال زجاج الغطاء زلات
منزلق مدفأةLab ScientificXH-2022موديل # XH-2002
مصباح تسخين محمولمختبراتيساعد في الحفاظ على درجة حرارة البوليمر عند 37 درجة ؛ C
مجهر الفلورسنت المقلوبZeissنموذج Axiovert 25 CFL
حمام مائي ساخنVWRنموذج # 1235PC
منصة هزازVWRSeries 100
Multiskan FC قارئ لوحة microtiterThermo ScientificType 357
حاضنة ثقافة الخليةVWRنموذج # 2350T
تنقية خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانيةLabconcoDelta Series
إضافي محلي متجر Haine's احصل المجمدة جهاز جهاز Underwriters جهاز

المراجع

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

هيدروجيل متجلط حرارياًPNIPAAm-g-CSمقاومة الشدالحيوية الخلويةمادة حيوية قابلة للحقنالنواة اللبيةمقايسة الخلايا الحية والميتةقدرة التورم
توليف Thermogelling بولي (N-isopropylacrylamide) المركبات كبريتات -graft-الكوندروتن مع الجيني المجهرية الدقيقة لهندسة الأنسجة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.