$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على موضوعات الحيوانية رعاية المؤسسية الحيوان واللجنة استخدام، أكاديمية سينيكا، تايبيه، تايوان.
1. إعداد الحل التجريبي والمعدات اللازمة لتسجيل صفيف Multielectrode
- إعداد الاصطناعي السائل الشوكي الدماغي (ACSF، 124 مم كلوريد الصوديوم، 4.4 ملي بوكل، 1 ملم ناه 2 ص 3، 2 ملي MgSO 4، 2 مم CaCl 2، 25 مم NaHCO 3، و 10 ملي الجلوكوز، فقاعات مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2).
- استخدام نوعين من تحقيقات الشرق الأوسط وأفريقيا: 6 × 10 MEA مستو و 8 × 8 الشرق الأوسط وأفريقيا. ويشمل التحقيق السابق للمنطقة التي تضم القشرة، المخطط، والمهاد. ويشمل التحقيق الأخير فقط من المنطقة القشرية.
- استخدام مكبر للصوت 60 قناة مع فلتر الفرقة تمرير يقع بين 0.1 هرتز وكيلو هرتز 3 في 1200 التضخيم. الحصول على البيانات بمعدل أخذ العينات 10 كيلو هرتز.
- وضع اثنين من الأسلاك الفضة المطلية أجكل-داخل غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا لDCS. استخدام أجكلأسلاك الفضة المغلفة لإنتاج الحقول الكهربائية التي يتم إنشاؤها من قبل مشجعا معزولة.
- وضع التنغستن القطب (قطر، 127 ميكرون، طول، 7.62 سم، 8 ° AC طرف مدبب، ومقاومة، 5 MΩ) لتحفيز مهادي، ووضع القطب المرجعية في غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا. تقديم تيارات القطب التنغستن باستخدام منشط المعزولة التي يتم التحكم بواسطة مولد نبض.
2. إعداد شريحة الدماغ
- استخدام الذكور C57BL / 6J الفئران، 4-8 أسابيع من العمر. بيت الحيوانات في غرفة مكيفة الهواء (21-23 درجة مئوية، و 50٪ الرطوبة؛ 12 ساعة / 12 ساعة دورة الضوء / الظلام، أضواء على في 08:00) مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
- اتخاذ قسامة 250 مل من ACSF التي أعدت في الخطوة 1.1، ووضعه في كوب يحتوي على الجليد. في نفس الوقت، وتوفير الغاز المستمر الذي يتكون من 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
- العملية الجراحية
- تخدير الحيوان مع 4٪ الأيزوفلورين في كوبمربع لحوالي 3 دقائق. عندما يصل الحيوان عمق الجراحية التخدير (المشار إليها لعدم وجود استجابة لقرصة اصبع القدم)، وضعه على صينية ضحلة مليء الثلج المجروش، وإزالة الرأس باستخدام مقص.
- فضح الجمجمة، وتقليم قبالة العضلات المتبقية. التالي، وذلك باستخدام رينجرز، قشر بعيدا السطح الظهري من الجمجمة من الدماغ. تقليم بعيدا جانبي الجمجمة باستخدام رينجرز. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع حل الإيثانول 75٪.
- باستخدام ملعقة، وقطع بصيلات الشم وصلات عصبية على طول السطح البطني من الدماغ، وإزالة المخ. بعد قطع الرأس، بسرعة نقل الدماغ إلى دورق مملوء ACSF الاوكسيجين الجليد الباردة.
- إعداد الإنسي المهاد (MT) -ACC الدماغ شريحة
ملاحظة: إعداد شرائح التي تحتوي على مسار من طن متري إلى ACC 13. - ومن ناحية قطع كتلة الدماغ مع اثنين من التخفيضات السهمي 2.0 مم الوحشي على خط الوسط في كل الكرة الأرضيةلعرض تشريح تحت القشرية. ثم جعل اثنين من التخفيضات الزاوية. جعل الأول عبر قطع بالتوازي مع الجهاز الألياف مرئية في المخطط.
- جعل الثاني عبر قطع من الاتصال بين المخيخ والقشرة البصرية إلى نقطة الوسط بين الصوار الأمامي والجهاز البصري التي هي بطني وبالتوازي مع المسار thalamocingulate.
- إرفاق كتلة الدماغ على لوحة الزاوي (~ 120 درجة) بمادة لاصقة cyanoacrylate، وجعل قطع فقط فوق نقطة تحول في مسار. تتكشف لوحة، وتمهيدها، والغراء على خشبة المسرح غرفة من vibratome.
- جعل سطي شرائح الدماغ المهاد لجنة التنسيق الإدارية (500 ميكرون سميكة) ثم تزج بهم في الجليد الباردة المؤكسج شرائح aCSF.Transfer إلى غرفة تسجيل، والحفاظ على 32 درجة مئوية تحت نضح مستمر (12 مل / دقيقة) مع الاوكسيجين ACSF ل1 ساعة.
3. إعداد غرفة الإرواء للتسجيل صفيف Multielectrode
- تجهيزغرفة الإرواء
- وضع مسبار الشرق الأوسط وأفريقيا على نظام متعدد القنوات، واستخدام اثنين من أنابيب البولي ايثيلين منفصلة لربط التحقيق لمضخة تحوي. استخدام أنبوب واحد لتوجيه ACSF في غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا وأنبوب آخر لتوجيه ACSF من الغرفة. وأخيرا، يروي باستمرار إعداد مع الدافئة (29-30 درجة مئوية) ACSF الاوكسيجين (8 مل / دقيقة).
- نقل شريحة الدماغ إلى الشرق الأوسط وأفريقيا. اضغط باستمرار على شريحة الدماغ على الشرق الأوسط وأفريقيا باستخدام قطعة من القطن مبللة. بعناية نقل شريحة الدماغ لضمان ACC موجه فوق الأقطاب.
- استخدام مجموعات مرساة شريحة وعقد هبوطا في الضغط على شريحة الدماغ. هذه الخطوة يضمن الربط الكهربائي جيد بين شريحة والأقطاب الكهربائية.
4. الجيل من الحقول الكهربائية التي DCS
ملاحظة: تم يستند تعريف التوجه المجال الكهربائي على اتجاه محور محواري تغصني في لجنة التنسيق الإدارية. كانت توجهات التغصنات وسوما مقصوراتأكد باستخدام جولجي تلطيخ 12.
- وضع القطب أجكل (كما هو موضح الأنود) الأقرب إلى لجنة التنسيق الإدارية، ووضع القطب الآخر (كما هو موضح الكاثود) البعيدة إلى ACC. تسجيل قوة الحقل الذي تم إنشاؤه بواسطة التوجهات المجال اثنين (متوازية ومتعامدة مع الألياف محواري تغصني ACC) من الشرق الأوسط وأفريقيا، وتسليم تيارات الحقول الكهربائية باستخدام مشجعا.
- إصلاح مسافة الأقطاب أجكل (حوالي 1.5-2 سم)، وضبط قوة مشجعا الحالية لجعل DCS بين 0.5 و 2 مللي أمبير.
5. الناجم كهربائيا-الردود القشرية متشابك
ملاحظة: الحث على ردود متشابك في لجنة التنسيق الإدارية عن طريق تحفيز الكهربائي في MT، فيه برمجة مولد التحفيز الكهربائي تنتج نبضات الحالية ثنائية الطور مستطيلة.
- كرر القسم 3 أعلاه.
- وضع التنغستن القطب في MT، وتقديم البقول من التحفيز والتشجيع للثالالمنطقة AMIC من شرائح عبر الأقطاب الكهربائية التنغستن القطبين.
- استخدام مختلف الكثافات الحالية لتحديد العتبة التي يتسبب استجابة ACC. هنا، استخدام كثافة ± 150 أمبير ومدة 200 μsec، الامر الذى أدى إلى استجابة القصوى 80٪ في لجنة التنسيق الإدارية في معظم شرائح.
- نقل التنغستن القطب على طول الطريق thalamocingulate (من طن متري إلى الجسم الثفني) في شريحة MT-ACC للحصول على لمحات استجابة المثلى.
- جعل 10-20 الاحتلالات الردود ACC، واستخدام البرنامج تلقائيا متوسط كل من لجنة التنسيق الإدارية التي حركها التحفيز طن متري. النتيجة محطة الفضاء الدولية الردود متشابك في لجنة التنسيق الإدارية الناجمة من التحفيز طن متري بحلول MT-ACC الطريق.
6. يسببها كهربائيا، مثل الاستيلاء آخر
ملاحظة: تم يسببها مثل الاستيلاء النشاط من تطبيق 4-aminopyridine (4-AP، 250 ميكرون) وbicuculline (5 ميكرومتر). وأظهرت دراسات التحكم في الوقت السابقة التي الردود القصوى ومستقرة ظهرت2-3 ساعة بعد تطبيق الدواء 14.
- كرر القسم 5 أعلاه.
- إضافة المخدرات إلى حل التروية. استخدام 4-AP (250 ميكرون) وbicuculline (5 ميكرومتر). مزج الأدوية بانتظام، ومواصلة نضح لمدة 2-3 ساعة.
- لتسهيل النشاط مثل الاستيلاء، والحفاظ على مضخة نضح بمعدل سريع نسبيا التروية (8 مل / دقيقة)، والتي يمكن أن تساعد أيضا في منع تراكم التدرج درجة الحموضة.
- وضع التنغستن القطب في MT، وتقديم التحفيز الكهربائي (150 أمبير، 200 μsec مدة) للحصول على لمحات استجابة ACC.
- جعل 10-20 الاحتلالات ومتوسط الاستجابات.
- استبدال الحل نضح مع ACSF جديدة لتغسل المخدرات. كرر الخطوة 6.5.
7. اختبار تأثير DCS على الردود القشرية مستدعى
- كرر القسمين 3 و 4. تأكد يتم إنشاؤها أن الحقول الكهربائية الموحدة عن طريق تمرير التيارات بين اثنين موازية أسلاك الفضة المطلية أجكل التي يتم وضعها داخل MEA غرفة. إذا كان هناك أي مشاكل، وDCS يبقى بين 0.5 و 2 مللي أمبير.
- إيقاف DCS، ووضع القطب الكهربائي التنغستن لتحفيز المهاد (± 150 أمبير، 200 μsec المدة). للحصول على ردود متشابك القصوى في لجنة التنسيق الإدارية، وجعل 10-20 الاحتلالات ومتوسط الاستجابات.
- تتحول في وقت واحد على DCS (2 بالسيارات / مم قوة DCS) والتحفيز مهادي (350 أمبير، 200 μsec المدة). تقييم التغيرات في مدى الاستجابة ACC-أثار التحفيز مهادي خلال DCS.
- إيقاف DCS، وإضافة 4-AP (250 ميكرون) وbicuculline (5 ميكرومتر) إلى حل التروية. ثم الانتظار 2-3 ساعة. عندما تؤثر على المخدرات شريحة الدماغ، وشريحة تنتج استجابات الاستيلاء القشرية.
- جعل 10-20 الاحتلالات الردود جنة التنسيق الإدارية، ومن ثم قياس السعة ومدة ردود الاستيلاء القشرية أثار الكهربائية.
- بعد الخطوة 7.5، تتحول في وقت واحد على DCS (2 القوة بالسيارات / مم DCS) والتحفيز مهادي (150 أمبير، 200 duratiعلى μsec). تقييم التغيرات في السعة ومدة ردود الاستيلاء القشرية أثار خلال تطبيق DCS.
- استبدال الحل نضح مع ACSF جديدة لتغسل المخدرات، وكرر الخطوات من 7.2 و 7.3.
- جمع كل من تسجيل البيانات، ومجموعة البيانات في ظروف تجريبية مختلفة. تقييم السعة ومدة ردود الاستيلاء القشرية تحت ظروف تجريبية مختلفة.
تحليل 8. البيانات
- استخدام برنامج (على سبيل المثال، MC البرمجيات الرف) إلى متوسط الردود المسجلة تلقائيا، وتصدير البيانات الخام إلى جدول بيانات. تحليل السعة ومدة البيانات الخام وتوليد الأرقام اللون.
- للكشف عن أحداث الاستيلاء متذبذبة، استخدام البرنامج لقياس قيمة خط الأساس والانحرافات المعيارية (SD). تعيين 3 SD لمستوى الضوضاء كما العتبة. سعة من قمم خلال حدث التذبذب التي تفوق هذا الحد يتم الكشف عن تلقائياأد.
- إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الطالب ر -test.
- قياسات صريحة وتحليل التباين الأحادي النتائج (أنوفا) في النص يعني ± SE، مع ن تشير إلى عدد من شرائح درس 12.