يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عالية الإنتاجية الفحص لفحص تفضيلات بيضة زرع الفردي

7.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53716

⸱

مارس 24, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Pharmacology, Duke University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول مقايسة إنتاجية عالية لاختبار تفضيلات وضع البيض ذبابة الفاكهة السوداء بدقة واحد. يوفر هذا الاختبار نظاما أساسيا بسيطا وفعالا وقابلا للتطوير لتحديد الجينات ومكونات الدوائر التي تتحكم في عملية صنع القرار البسيطة.

الملخص

في الآونة الأخيرة، ظهرت أفضلية وضع البيض ذبابة الفاكهة نموذجا لين العريكة وراثيا لدراسة الأساس العصبي للعمليات صنع القرار بسيطة. عند اختيار مواقع لإيداع بيضها، الذباب الإناث قادرة على المرتبة الجاذبية النسبية للخيارات واختيار "أكبر من سلعتين." ومع ذلك، فإن معظم فحوصات تفضيل وضع البيض ليست عملية إذا كان أحد يريد أن يأخذ نهجا الفحص الجيني المنهجي للبحث عن أساس الدوائر الكامنة وراء هذه العملية صنع القرار بسيطة، كما هي وشاقة لانشاء القائمة على السكان. لزيادة الإنتاجية دراسة الأفضليات وضع البيض من الإناث واحدة، وضعنا غرف مخصصة كل علبة تفضيلات وضع البيض الفحص في وقت واحد لمدة تصل إلى ثلاثين فرد الذباب وكذلك البروتوكول الذي يضمن لكل امرأة لديها نسبة وضع البيض عالية (بحيث تفضيلها هو ملحوظ بسهولة وأكثر إقناعا). نهجنا هو بسيط لتنفيذوتعطي نتائج متسقة للغاية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تجهيز هذه الغرف مع المرفقات مختلفة للسماح تسجيل فيديو للحيوانات وضع البيض ولتسليم ضوء دراسات علم البصريات الوراثي. وتنص هذه المادة على مخططات لافتعال هذه الدوائر وإجراءات إعداد الذباب إلى أن يعاير في هذه الدوائر.

المقدمة

ذبابة الفاكهة السوداء هو كائن حي نموذجي جيني قوي لدراسة الأساس العصبي للسلوكيات. أدت التطورات السريعة للأدوات الجينية لمعالجة الخلايا العصبية بطريقة مستهدفة وظهور أدوات التحليل السلوكي المتطورة إلى تحسين قدرتنا بشكل كبير على تشريح آليات الدوائر التي تكمن وراء عمليات التحول الحسي الحركي للعديد من السلوكيات الفطرية والمكتسبة1-3.

ذبابة الفاكهة وضع البيض هو نموذج مناسب لدراسة الأساس العصبي لعمليات صنع القرار البسيطة. على وجه الخصوص ، ثبت أن إناث ذبابة الفاكهة تمتلك القدرة على مقارنة خياراتها وترتيبها قبل "الالتزام" بإيداع بيضة في خيارمعين 4-8. على سبيل المثال ، عند إعطاؤها ركيزة عادية (خالية من السكروز) فقط أو ركيزة تحتوي على السكروز فقط ، تقبل الإناث بسهولة أيا من الخيارين لوضع البيض. ومع ذلك ، عند تقديم كلا الخيارين ، ترفض الإناث القوية ركيزة السكروز في بعض السياقات7،9،10. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل نسبيا عن الآليات العصبية التي تسمح للإناث "باختيار أكبر سلعتين". كانت العقبة الرئيسية هي عدم وجود طريقة فعالة لفحص تفضيلات وضع البيض بحيث يمكن للمرء استخدام نهج الفحص الجيني المنهجي لدراسة هذه المشكلة.

في هذا التقرير ، نصف البروتوكول الذي طورناه والذي يسمح بفحص تفضيلات وضع البيض للإناث بدقة واحد وبإنتاجية متسنة بشكل كبير واتساق مقارنة بالطرق السابقة. على وجه التحديد ، نقدم المخططات لبناء الغرف التي صممناها ، وبروتوكول تحضير الإناث بحيث تكون كل منها مهيأة لوضع العديد من البيض ، وبروتوكول استخدام الغرف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الذباب إلى أن يعاير

  1. ثقافة الذباب على العسل الأسود القياسية / وسائل الإعلام دقيق الذرة في مجموعة حاضنة عند 25 درجة مئوية والرطوبة 65٪. الحرص على عدم ازدحام قارورة. على سبيل المثال، وضعت 8 إناث و 6 ذكور في قارورة الغذاء الضيقة.
    ملاحظة: "قارورة الغذاء الضيقة" المستخدمة هنا ديها قطرها الداخلي 2.3 سم. ونحن عادة الاستغناء عن 10 مل من المواد الغذائية يطير في كل قارورة. ووصف وصفة الطعام ذبابة كنا هنا: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html.
  2. 2 - بعد 3 أيام من الإناث eclosion، وإعداد قارورة مع عجينة الخميرة الطازجة كما هو مبين في الشكل 1E. جعل الطازجة عجينة الخميرة عن طريق خلط 6 غرام من الخميرة النشطة مع 10 مل من حمض proprionic 0.5٪. استخدام ملعقة لتطبيق عجينة الخميرة على جدار من قارورة الغذاء. جمع 30-35 الإناث eclosed جنبا إلى جنب مع 20 - 25 من الذكور في قارورة.
    1. بشكل عام، وجمع الذكور من نفس قارورة حيث يتم جمع الإناث(وذلك لتوفير الوقت والجهد). ومع ذلك، إذا كان هناك قلق حول خصوبة الذكور، استخدام الذكور WT بدلا من ذلك. أيضا، الخميرة لصق مهم لتحفيز إنتاج البيض ومن ثم إعدادها طازجة يوميا.
  3. الحفاظ على جمع الإناث / الذكور عند 25 درجة مئوية، الرطوبة 65٪، إلا الذباب هي درجة الحرارة حساسة.
  4. بعد ~ 4-5 أيام، والتحقق من قوارير لمعرفة ما اذا الإناث جاهزة للتجارب وضع البيض. انهم مستعدون عند سطح المتوسطة الغذاء الرطب من اليرقات تختبئ بنشاط في الغذاء (انظر الشكل 1E - F).
    ملاحظة: الإناث عادة الامتناع عن وضع البيض مرة واحدة يصبح سطح الغذاء الرطب والزحف مع اليرقات. تضمن هذه الخطوة أن الإناث ستكون جاهزة لوضع الكثير من البيض عندما كانت تواجه ركائز مع الملمس المطلوب (على سبيل المثال، ~ 1 الاغاروز٪).

2. غرفة البناء، الجمعية، إعداد الفحص

  1. لدينا متجر آلة بناء غرف وضع البيض الاكريليك (فايجوري 1A - D). وظهر الرسم الهندسي من قطع مختلفة في الشكل التكميلي 1 - 3 يمكن العثور عليها أيضا صور عالية الدقة هنا (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber٪20design.pdf).
  2. إدراج الأغطية البلاستيكية إلى تحميل (أعلى) قطعة من الغرفة كما هو مبين في الشكل 1C. وهذا بمثابة السطح السفلي بينما الذباب تحميل في الساحات وضع البيض على حدة.
  3. تخدير الإناث على وسادة CO 2 وتحميلها بشكل فردي في كل الساحة وضع البيض. سماح ~ 30 دقيقة للذباب للتعافي من CO 2 وتصبح تأقلم مع البيئة الجديدة.
  4. تحضير ركائز الاغاروز.
    1. للراحة، والحفاظ على زجاجة ولم يضف من ذاب 1٪ الاغاروز في 55 ° C حمام الماء.
    2. إضافة المبلغ المطلوب من محلول المخزون السكروز (2 م) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وخلطها مع كمية مناسبة من الاغاروز. على سبيل المثال، لإعداد 150 ملي السكروز الركيزة، جيش التحرير الشعبى الصينىم 750 ميكرولتر من 2 M حل السكروز في أنبوب ثم ملء الأنبوب مع الاغاروز إلى علامة 10 مل.
    3. إعداد الركيزة سهل بنفس الطريقة ولكن مع إضافة الماء المقطر بدلا من محلول السكروز.
      ملاحظة: تركيز النهائي من الاغاروز في هذا البروتوكول هو قليلا أقل من 1٪. في تجربتنا، والتركيز الدقيق الاغاروز لا يهم طالما تسيطر عليه أن يكون في حدود ~ 0،9-1،1٪ وأن ركائز هما من تركيز الاغاروز نفسه.
  5. خذ قطعة الركيزة (القاع) من الغرفة وماصة 1000 ميكرولتر من الركيزة الأغاروس في كل الحوض كما رأينا في الشكل 1D.
  6. السماح للالاغاروز لترسيخ ب ~ 30 دقيقة.
  7. مرة واحدة ركائز الاغاروز والذباب جاهزة، تجميع كل الأجزاء الثلاثة من الغرفة وضع البيض ثم تأخذ بها الأغطية البلاستيكية.
  8. ضع الدوائر في حاضنات الطاير.
    ملاحظة: طول التجارب وضع البيض يمكن أن تختلف تبعا بةاحتياجات rimental. ونحن عادة تشغيل التجربة O / N (14-16 ساعة). أيضا، لم يلاحظ أي تأثير كبير على توقيت الساعة البيولوجية على تفضيلات وضع البيض.
  9. تخدير عن طريق حقن الإناث CO 2 في الغرفة. تفكيك الغرفة، تجاهل الذباب تخدير في مشرحة ذبابة (أي، يمكن للقهوة فارغة مليئة بعض زيت الذرة). التقاط صور من نتائج السجلات (انظر الشكل 2).
  10. حساب عدد البيض يدويا وحساب مؤشرات تفضيل للتحليل. حساب مؤشر التفضيل (N A - N ب) / (N + N لب) حيث ن أ و ن ب يمثلون عدد من البيض في الموقع موقع مقابل ب، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتتكون غرف وضع البيض من عدة قطع: ركيزة (القاع) قطعة، قطعة المفرق (وسط)، وتحميل (أعلى) قطعة، و 2 أبواب منزلقة (الشكل 1A - D). وتستخدم هذه القطع بشكل مستقل الذباب الإعداد وركائز قبل التجارب وضع البيض. ويبين الشكل 1F كيف قارورة ينبغي أن ننظر عند الذباب الإناث على استعداد لوضع البيض. عندما تعطى الذباب الاختيار بين ركيزة واضحة والركيزة التي تحتوي على السكروز، الإناث تفضل بقوة الركيزة سهل لوضع البيض كما هو موضح في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الدوائر والبروتوكولات المذكورة هنا لديهم العديد من التحسينات على المقايسات وضع البيض السابقة. أولا، أنها تزيد من الإنتاجية من يعاير تفضيلات من الحيوانات وحيدة بشكل ملحوظ. كل غرفة يمكن فحص 30 من الإناث واحدة ويستغرق أقل من ساعة لاقامة. ثانيا، أنها تزيد من الاتساق في تفضيلات وضع البيض على الطرق السابقة. توحيد أبعاد الساحة، وحجم ركائز وضع البيض، والمسافة بين ركائز يجعل من الاسهل لمقارنة النتائج بين أيام التجريبية المختلفة ومن المجموعات البحثية المختلفة. ثالثا، غرف يمكن تركيبها مع الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر متجر Duke Physics ، وخاصة Phil Lewis ، لمساعدتنا في بناء الجهاز السلوكي والمرفقات وإنشاء الرسم. يتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01GM100027.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
UltraPure Agarose Invitrogen16500-500
السكروزسيجماS0389
حمام مائي  فيشر15-462-6Q
LifeCam سينما كاميرا ويبمايكروسوفتH5D-00013
مصابيح LED حمراءCreeC503B-RAN-CA0B0AA1
غرف وضع البيض حاملاتالمصممة
حاملي
خصيصا
قوارير ذبابة مصممة خصيصا (ضيقة)جينيسي32-116 قبل الميلاد
الكاميرا خصيصاLED المصممة

المراجع

  1. Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
  2. Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  3. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
  4. Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
  5. Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436(2011).
  6. Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910(2012).
  7. Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
  8. Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
  9. Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335(2015).
  10. Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
  11. Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
  12. Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432(2015).
  13. Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
  14. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
  15. Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عالية الإنتاجية الفحص لفحص تفضيلات بيضة زرع الفردي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.