Method Article

البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

DOI:

10.3791/53732

⸱

March 3rd, 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نبلغ عن بروتوكولات للكشف عن بروتينات السنترومير الحركية الداخلية والخارجية في الخلايا البشرية وتحديد مستويات البروتين هذه عند السنترومير-الحركية عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي غير المباشر من خلال استخدام التثبيت (تثبيت بارافورمالدهيد أو الأسيتون أو الميثانول).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تشير < p class = 'jove_content'>"Centromeres" و "kinetochores" إلى الموقع الذي ترتبط فيه الكروموسومات بالمغزل أثناء انقسام الخلية. يظل التصور المباشر لبروتينات السنترومير الحركية أثناء دورة الخلية أداة أساسية في التحقيق في آلية (آليات) هذه البروتينات. توفر طرق التصوير المتقدمة في الفحص المجهري الفلوري دقة رائعة لمكونات السنترومير الحركية وتسمح بالملاحظة المباشرة للمكونات الجزيئية المحددة للسنتروميرات والحركية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد طرق تلطيخ الفلورسنت المناعي غير المباشر (IIF) باستخدام أجسام مضادة محددة ضرورية لهذه الملاحظات. ومع ذلك ، على الرغم من التقارير العديدة حول بروتوكولات IIF ، ناقش القليل منها بالتفصيل مشاكل بروتينات السنترومير الحركية المحددة. 1-4 نبلغ هنا عن بروتوكولات محسنة لتلطيخ بروتينات السنترومير الحركية الذاتية في الخلايا البشرية باستخدام تثبيت بارافورمالدهيد وتلوين IIF. علاوة على ذلك ، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكولات للكشف عن بروتينات CENP-A الخارجية الموسومة بالعلم في الخلايا البشرية المعرضة لتثبيت الأسيتون أو الميثانول. هذه الطرق مفيدة في اكتشاف وقياس بروتينات السنترومير الحركية الذاتية وبروتينات CENP-A الموسومة بالعلم ، بما في ذلك تلك الموجودة في الخلايا البشرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحددت "القسيم" الكلاسيكي كما مناطق إعادة التركيب الانتصافي قمعت في مجال علم الوراثة واعترف فيما بعد انقباض الأساسي من الكروموسومات الإنقسامية، والتي تلعب دورا أساسيا في فصل كروموسوم دقيقة أثناء الانقسام. وصفت "Kinetochores" مثل الهياكل متعددة الطبقات التي ترتبط الأنابيب الدقيقة على سطح القسيم، كما يتضح من المجهر الإلكتروني. تم تعريف "kinetochores" فيما بعد باسم معقد جزيء أن يموضع في السنترومير من الكروموسومات الإنقسامية. وعلى الرغم من الاختلاف الكبير في تسلسل الحمض النووي القسيم المركزي بين الفقاريات، هيكل الحيز الحركي والتكوين يتم حفظها للغاية. مطلوب التفاعل الديناميكي بين ميكروتثبول المغزل والحيز الحركي للفصل المؤمنين من الصبغيات أثناء الانقسام، والعيوب في السنترومير-الحيز الحركي وظيفة يؤدي إلى عدم توازن الصبغيات وبالتالي السرطان.

السنترومير في معظم حقيقيات النوىلا يوجد لديه تسلسل الحمض النووي محددة، ولكن يتكون من صفائف كبيرة (0،3-5 ميجا بايت) من الحمض النووي alphoid المتكررة التي تتكون من 171-BP الحمض النووي α قنوات فضائية. إلا في مهدها الخميرة، ويتحقق هوية السنترومير وليس عن طريق تسلسل الحمض النووي ولكن من خلال وجود جسيم نووي الخاصة التي تحتوي على هيستون H3 البديل CenH3 (السنترومير البروتين A [CENP-A] في البشر). 5 CENP-A جسيم نووي توطين ل لوحة الداخلية kinetochores الثدييات 7 و ربط على الحمض النووي α-الأقمار الصناعية 171-BP. تتطلب القسيم النشطة CENP المحتوية على وجسيم نووي لتوجيه توظيف شبكة التأسيسية المرتبطة السنترومير (CCAN) والبروتينات الحيز الحركي، التي تنظم معا المرفق من الكروموسومات إلى المغزل الإنقسامية وتقدم دورة لاحقة عبر حاجز المغزل.

في ضوء الأدلة أعلاه، فقد اقترح CENP-A ليكون علامة جينية من السنترومير 8؛ ومع ذلك، فإن العملية التي يتم تضمينها CENP-A طn لالحمض النووي القسيم المركزي والعوامل المسؤولة عن هذا التأسيس حتى الآن لم يتم توصيفه جيدا. ونطاق استهداف السنترومير قصيرة (CATD) يقيم في هيستون أضعاف منطقة CENP-A، واستبدال المنطقة المقابلة من H3 مع CATD كافية لH3 المباشر إلى السنترومير، واقترحت 9 دراسات عدة أدوار وظيفية لمرحلة ما بعد متعدية تعديل (PTM) من CENP-A 12-16. ومع ذلك، لم يتم بعد إجمال الآليات الجزيئية لهذه PTMs من CENP-A في التوظيف لالقسيم. ذكرنا سابقا أن CUL4A-RBX1-COPS8 E3 النشاط يغاز مطلوب للCENP-A K124 ubiquitylation وتوطين CENP-A إلى القسيم 17

وقد أدى اكتشاف وتوصيف البروتينات الحيز الحركي إلى رؤية جديدة بشأن العزل الصبغي. وقد تم تحديد 18 أكثر من 100 من عناصر الحيز الحركي في خلايا الفقاريات التي كتبها نهج مختلف. 19،20 وكيلمكانة كيفية تجميع kinetochores وظيفة تأتي أيضا من توصيف الوظائف الخلوية من كل شبكة البروتينات الحيز الحركي-السنترومير والبروتين البروتين داخل الخلايا. 19 التصور المباشر والتصوير المتقدمة الأساليب في مضان المجهري توفر قرار ملحوظا من مكونات السنترومير الحيز الحركي وتسمح الملاحظة المباشرة من مكونات جزيئية معينة من القسيم وkinetochores. وبالإضافة إلى ذلك، أساليب مناعي غير مباشر (معهد التمويل الدولي) تلطيخ باستخدام أجسام مضادة محددة ذات أهمية حاسمة لهذه الملاحظات. ومع ذلك، على الرغم من العديد من التقارير حول بروتوكولات معهد التمويل الدولي، وعدد قليل مناقشتها في مشاكل التفاصيل بروتينات معينة، السنترومير الحيز الحركي 1-4 وهكذا، وتطوير وسائل معهد التمويل الدولي تلطيخ وفحص معهد التمويل الدولي الكمي التقارير إلى تحليل تحديدا كل من البروتين السنترومير الحيز الحركي أمر مهم للغاية. في معهد التمويل الدولي تلطيخ، ينبغي للمرء أن المضي قدما في بروتوكول تلطيخ لتجنب فقدان البروتين في المصالح أوبقية الخلية. ومع ذلك، تثبيت يدمر مواقع المستضدات في بعض الأحيان، ومختلف مجموعات الضد مستضد عمل سيئة مع تثبيتي واحد، ولكن بشكل جيد جدا مع آخر، 21 واختيار تثبيتي يعتمد إلى حد كبير على البروتين (ق) من الفائدة. لذلك، وأساليب مختلفة تثبيتي حاسمة في تلطيخ معهد التمويل الدولي من البروتينات السنترومير الحيز الحركي.

وقد تم تطوير أساليب هنا الأمثل للمناعي غير مباشر (معهد التمويل الدولي) تلطيخ ومقايسة لمعالجة توطين البروتينات السنترومير الحيز الحركي الذاتية، بما في ذلك CENP-A والعلم الموسومة الخارجية البروتينات CENP-A، والكميات من هذه البروتينات في الخلايا البشرية. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحليل البروتينات السنترومير الحيز الحركي في الأنواع الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية الثقافة وترنسفكأيشن

  1. وضع غطاء زجاجي (22 ملم × 22 ملم) في لوحة البوليسترين 6 جيدا. معطف اختياريا غطاء زجاجي مع بولي-L-ليسين، 0.1٪ ث / ت، في الماء (انظر قائمة المواد / المعدات) للحفاظ على الخلايا الإنقسامية على الزجاج غطاء باتباع الخطوات التالية:
    ملاحظة: يجب تحديد الظروف المثلى لكل خط الخلية والتطبيق.
    1. جو معقم و مطهر سطح الثقافة معطف مع بولي-L-ليسين، 0.1٪ ث / ت، في الماء (0.4 مل / بئر لوحة 6 جيدا البوليسترين). صخرة بلطف لضمان حتى طلاء السطح الثقافة.
    2. بعد 5 دقائق، وإزالة حل بواسطة طموح ويشطف جيدا السطح مع الأنسجة المعقمة للمياه ثقافة الصف.
    3. الجافة على الأقل 2 ساعة قبل إدخال الخلايا والمتوسطة.
  2. البذور خلايا هيلا هيلا 17 أو تيت أوف خلايا 17،22 على غطاء زجاجي (22 ملم × 22 ملم) وضعها في لوحة البوليسترين 6 جيدا. تأكد من أن كثافة الخلية هي 5.4 × 10 5 لكل بئر. الخلايا ثقافةفي DMEM عالية الجلوكوز مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين ستربتومايسين.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، وتحديد تجريبيا كثافة الخلايا لاستخدامها في البذر.
  3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2 لمدة 18 ساعة.
    ملاحظة: في حالة من خلايا هيلا تيت أوف، نسخ من الجين خارجي نشطا في غياب محفز (أي، التتراسيكلين / الدوكسيسيكلين) لذا الخلايا ثقافة دون التتراسيكلين / الدوكسيسيكلين وtransfect عابر مع ناقلات overexpression pTRM4 (الجدول 2 )، الذي ينظمه المروج TRE النسخ (أنظر أدناه).
  4. ثمانية عشر ساعة بعد خلايا البذر، transfect على النحو التالي:
    1. جعل حل وعن طريق خلط 1.5 ميكرولتر سيرنا بنسبة ضئيلة (20 ميكرومتر الأسهم صلب، الجدول 1) و / أو 2.0 ميكروغرام البلازميد (الجدول 2) في 50 ميكرولتر خفض سيرم (انظر قائمة المواد / المعدات)، واحتضان في RT لمدة 5 دقائق .
      ملاحظة: في هذا التحليل،وكان شارك في transfected لاستخدامها في بروتوكولات 3 و 4 (انظر مناقشة)؛ CA-UTR الرناوات siRNAs (الجدول 1 خليط من 5 'و 3' UTR سيرنا).
    2. جعل حل B عن طريق خلط 0.75 ترنسفكأيشن كاشف ميكرولتر أنا (انظر قائمة المواد / المعدات) في 50 ميكرولتر انخفاض متوسط ​​مصل، واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: خطوة اختيارية هي إضافة 1.0 ميكرولتر ترنسفكأيشن الكاشف الثاني (انظر قائمة المواد / المعدات).
    3. مزيج حلول A و B معا، واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة.
    4. غسل الخلايا المستزرعة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 500 ميكرولتر خفض سيرم إلى كل بئر من لوحة البوليسترين 6 جيدا. يضاف خليط من الحلول A و B (أي RNA و / أو مجمع الحمض النووي الدهون) مباشرة إلى كل من الفرد أيضا.
      ملاحظة: التركيز النهائي هو 3.3 ميكروغرام / مل (البلازميد)؛ 50 نانومتر (سيرنا).
    5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2 ل 4.5 ساعة. تغيير متوسطة إلى عالية الجلوكوز DMEM خفة دمح 10٪ FBS و 1٪ البنسلين ستربتومايسين.
    6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2 ل48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، وفترة حضانة لنمو الخلايا قبل التثبيت يجب أن يتحدد تجريبيا، واستنزاف البروتين و / أو يجب تأكيد التعبير عن طريق تحليل لطخة غربية (انظر بروتوكول 6).
    7. إذا تحليل الخلية الإنقسامية هو من الفائدة، إضافة باكليتاكسيل (10 نانومتر) إلى الخلايا المستزرعة 24 ساعة قبل التثبيت، أو إضافة TN16 (0.5 ميكرومتر) إلى الخلايا المستزرعة 2.5 ساعة قبل التثبيت.

2. خلية التثبيت ومناعي تلطيخ لكشف البروتينات الذاتية السنترومير-الحيز الحركي (امتصاص العرق التثبيت)

  1. إعداد تثبيتي، ومخازن، والكواشف.
    1. حديثا تجهيز 50 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4.
      1. إضافة 40 مل من 1 × PBS إلى دورق زجاجي على طبق من ضجة في غطاء التهوية. الحرارة في حين stirrinز إلى ما يقرب من 60 درجة مئوية. إضافة 2 غرام من مسحوق امتصاص العرق إلى برنامج تلفزيوني ساخنة.
      2. رفع ببطء درجة الحموضة بإضافة 1 مل من 1 N هيدروكسيد الصوديوم في المجموع، لأن مسحوق لم تنحل فورا.
        ملاحظة: الحل يزيل بعد إضافة هيدروكسيد الصوديوم.
      3. مرة واحدة قد حلت امتصاص العرق، بارد وتصفية الحل.
      4. ضبط درجة الحموضة مع 1 N حمض الهيدروكلوريك إلى 7.4 درجة الحموضة وحجم حل مع 1 × PBS إلى 50 مل.
        ملاحظة: أجزاء مأخوذة من الحل يمكن تجميد أو تخزينها في 2-8 درجة مئوية لمدة طالما 1 أسبوع. وينبغي أن يكون الحل من الجليد البارد أو تخزينها في 4 درجة مئوية حتى يصبح لاستخدامها.
    2. تجهيز 50 مل من KB1 العازلة، والذي يتألف من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5. 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. 0.5٪ BSA. و 0.5٪ تريتون X-100.
      ملاحظة: BSA ينبغي أن تضاف حديثا.
      ملاحظة: المخزن المؤقت KB سلسلة تستند KB عازلة وصفها في التقارير السابقة 1،2،4.
    3. تجهيز 50 مل من KB2 العازلة، والذي يتألف من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك،7.5 درجة الحموضة. 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. و 0.5٪ BSA.
      ملاحظة: BSA ينبغي أن تضاف حديثا.
    4. إعداد 1 مل من KB3 العازلة التي تحتوي على دابي (50 نانوغرام / مل).
    5. إعداد 100 مل من تصاعد المتوسط، والذي يتكون من 1 ملغ / مل ف phenylenediamine. 10٪ في برنامج تلفزيوني، و 90٪ الجلسرين.
      1. ضبط درجة الحموضة من 1 × برنامج تلفزيوني إلى 9.8 مع 1 N هيدروكسيد الصوديوم، حل ف phenylenediamine في الحل، ثم قم بإضافة الجلسرين.
      2. مخزن 1 مل aliquots في -80 درجة مئوية. يحفظ بعيدا عن الضوء.
  2. إزالة مستنبت بواسطة الطموح في 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (انظر البروتوكول 1) لتثبيت الخلية. خلايا شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. تطبيق برنامج تلفزيوني إلى جانب الآبار ثقافة لتجنب إزعاج سطح الخلايا.
    ملاحظة: يجب تحديد نقطة زمنية المثلى لتثبيت الخلية تجريبيا.
  3. إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. شطف الخلايا مرتين مع KB2 عازلة لإزالة بما فيه الكفاية المتبقية 4٪ لامتصاص العرق.
  4. Permeabiليز العينات في KB1 عازلة لمدة 30 دقيقة في RT. شطف خلايا مرة واحدة مع KB2 العازلة، وإضافة KB2 عازلة لمدة 5 دقائق على RT لمواقع كتلة إضافية من ملزمة انوعي.
    ملاحظة: المخزن المؤقت KB1 أيضا يساهم بشكل كبير في عرقلة.
  5. إزالة الغطاء الزجاجي (22 ملم × 22 ملم) من لوحة البوليسترين 6-جيدا باستخدام ملقط. بمانع القلم مسعور (انظر قائمة المواد / المعدات)، رسم مربع أخضر شاحب أو دائرة لتشكيل حاجز مسعور حول كل عينة غطاء زجاجي. لا تلمس أو الاقتراب جدا من الخلايا التي تحتوي على قلم حاجز مسعور. وضع غطاء زجاجي في 6 جيدا جديدة لوحة البوليسترين.
  6. تمييع الأجسام المضادة الأولية لالسنترومير أو البروتين الحيز الحركي (نسبة التخفيف من 1: 100 إلى 1: 200؛ وانظر أيضا قائمة من المواد / المعدات) وإما الأجسام المضادة لمكافحة CENP-B (نسبة التخفيف من 1: 400) أو المضادة السنترومير الأجسام المضادة (ACA) (نسبة التخفيف من 1: 2000) كعلامة السنترومير موقع في KB2 العازلة.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، وconcentra النهائييجب تحديد نشوئها من الأجسام المضادة الأولية في هذا الحل تجريبيا.
  7. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الأولية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 3 مرات مع KB2 العازلة.
  8. باستخدام KB2 عازلة، تمييع الضد الثانوي fluorophore مترافق (نسبة التخفيف من 1: 100-1: 200) موجهة ضد كل الأجسام المضادة الأولية.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد تركيز النهائي من الأجسام المضادة الثانوية في هذا الحل تجريبيا.
  9. تطبيق حجم كاف (قطرة من كاليفورنيا 30 ميكرولتر على غطاء زجاجي) من الأجسام المضادة الثانوية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 5 مرات مع KB2 العازلة خلال فترة 30 دقيقة (خمسة 6 يغسل دقيقة).
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج (أي لفقدان الحد الأدنى من الخلايا)، وحالة غسل الأمثل يجب أن يتحدد empiricaLLY.
  10. تطبيق حجم كاف من KB3 العازلة التي تحتوي على دابي (50 نانوغرام / مل) أن تزج عينة الخلية. احتضان عينة خلية لمدة 5 دقائق على RT. شطف خلايا 1-2 مرات مع KB2 العازلة.
  11. تركيب الغطاء الزجاجي الذي يحتوي على عينة الخلايا على الشريحة الصغيرة.
    1. ضع قطرة من تصاعد المتوسطة في وسط الشريحة الصغيرة.
    2. إزالة السائل من عينة الخلية، وباستخدام اليدين أو ملقط، ضع العينة في وسط الشريحة الصغيرة. تجنب فقاعات الهواء.
    3. إزالة المتوسطة المتزايدة الزائدة مع منشفة ورقية.

3. خلية التثبيت ومناعي تلون C-محطة الموسومة العلم CENP-A البروتينات (الأسيتون التثبيت)

  1. تجهيز
    1. إعداد المثلج 75٪ الأسيتون.
    2. حديثا تجهيز 50 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على الحليب الخالي من الدسم 0.5٪ و 0.5٪ BSA.
    3. حديثا تجهيز 50 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على الحليب الخالي من الدسم 0.1٪ و 0.1٪ BSA.
    4. إعداد 1 مل من برنامج تلفزيوني (ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على دابي (50-100 نانوغرام / مل).
    5. إعداد 100 مل من تصاعد المتوسط ​​كما هو موضح في 2.1.5.
  2. إزالة مستنبت بواسطة الطموح في 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (انظر البروتوكول 1) لتثبيت الخلية. خلايا شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. تطبيق برنامج تلفزيوني إلى جانب البئر ثقافة لتجنب إزعاج سطح الخلايا.
    ملاحظة: يجب تحديد نقطة زمنية المثلى لتثبيت الخلية تجريبيا.
  3. إصلاح الخلايا في الجليد الباردة 75٪ الأسيتون، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية. الخلايا الجافة على الغطاء الزجاجي في غطاء الدخان لمدة 30-60 دقيقة في RT.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد المدة الزمنية اللازمة لتثبيت وخلية تجفيف تجريبيا.
  4. باستخدام حاجز القلم مسعور (انظر قائمة المواد / المعدات)، رسم مربع أخضر شاحب أو دائرة لتشكيل حاجز مسعور حول كل عينة غطاء زجاجي. لا تلمس أو الاقتراب جدا من الخلايا التي تحتوي على قلم حاجز مسعور.
  5. كتلة nonspecIFIC مواقع على الخلايا ملزمة بإضافة برنامج تلفزيوني يحتوي الحليب الخالي من الدسم 0.5٪ و 0.5٪ BSA لمدة 5 دقائق على RT.
  6. باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي الحليب الخالي من الدسم 0.1٪ و 0.1٪ BSA، وتمييع الأجسام المضادة ضد العلم (1: 1000 نسبة التخفيف) وإما الأجسام المضادة لمكافحة CENP-B (نسبة التخفيف من 1: 200) أو هيئة مكافحة الفساد (نسبة 1: 2000 تخفيف ) كعلامة السنترومير الموقع.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد تركيز النهائي من الأجسام المضادة الأولية في هذا الحل تجريبيا.
  7. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الأولية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 5 مرات مع عازلة تمنع خلال فترة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن تشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني. لأفضل النتائج (أي، لتجنب فقدان الخلايا)، يجب أن تحدد الشروط غسل الأمثل تجريبيا.
  8. تمييع الضد الثانوي fluorophore مترافق (نسبة التخفيف من 1: 100-1: 200) موجهة ضدعلى كل الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني يحتوي الحليب الخالي من الدسم 0.1٪ و 0.1٪ BSA.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد تركيز النهائي من الأجسام المضادة الثانوية في هذا الحل تجريبيا.
  9. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الثانوية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني يحتوي الحليب الخالي من الدسم 0.1٪ و 0.1٪ BSA.
    ملاحظة: برنامج تلفزيوني وحدها يمكن أن تستخدم أيضا لغسل الخلايا.
  10. تطبيق حجم كاف من برنامج تلفزيوني تحتوي على دابي (50-100 نانوغرام / مل) أن تزج عينة الخلية. احتضان عينة خلية لمدة 5 دقائق على RT. شطف خلايا 1-2 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  11. تركيب الغطاء الزجاجي الذي يحتوي على عينة الخلايا على الشريحة الصغيرة كما هو موضح في 2.11.

4. خلية التثبيت ومناعي تلطيخ من N-محطة الموسومة العلم CENP-A البروتينات (الميثانول التثبيت)

  1. تجهيز
    1. تحضير الميثانول الجليد الباردة.
    2. إعداد TBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على 4٪ مصل الماعز.
    3. إعداد 1 مل من TBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على دابي (50-100 نانوغرام / مل).
    4. إعداد 100 مل من تصاعد المتوسط ​​كما هو موضح في 2.1.5.
  2. إزالة مستنبت بواسطة الطموح في 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (انظر البروتوكول 1) لتثبيت الخلية. خلايا شطف مرة واحدة مع TBS. تطبيق TBS إلى جانب الآبار ثقافة لتجنب إزعاج سطح الخلايا.
    ملاحظة: يجب تحديد نقطة زمنية المثلى لتثبيت الخلية تجريبيا.
  3. إصلاح الخلايا في الميثانول الجليد الباردة، واحتضان الخلايا لمدة 6 دقائق عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. شطف الخلايا مرتين مع TBS لإزالة بما فيه الكفاية الميثانول المتبقية.
  4. بمانع القلم مسعور (انظر قائمة المواد / المعدات)، رسم مربع أخضر شاحب أو دائرة لخلق حاجز مسعور حول كل عينة غطاء زجاجي. لا تلمس أو الاقتراب جدا من الخلايا التي تحتوي على قلم حاجز مسعور.
  5. حجب المواقع ملزمة غير محددة على سلليرة سورية وذلك بإضافة TBS تحتوي على 4٪ مصل الماعز. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  6. تمييع الأجسام المضادة ضد العلم (1: 1000 تمييع) وإما الأجسام المضادة لمكافحة CENP-B (نسبة التخفيف من 1: 200) أو هيئة مكافحة الفساد (1: 2000 نسبة تمييع) باعتباره السنترومير موقع علامة في TBS تحتوي على 4٪ مصل الماعز .
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد تركيز النهائي من الأجسام المضادة الأولية في هذا الحل تجريبيا.
  7. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الأولية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 5 مرات مع عازلة تمنع خلال فترة 30 دقيقة. لأفضل النتائج (أي فقدان الحد الأدنى من الخلايا)، لا بد من تحديد حالة غسل الأمثل تجريبيا.
  8. تمييع الضد الثانوي fluorophore مترافق (نسبة التخفيف من 1: 100-1: 200) موجهة ضد كل الأجسام المضادة الأولية في TBS تحتوي على 4٪ مصل الماعز.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، والاتحاد الدولي للسباحةيجب تحديد تركيز لتر من الأجسام المضادة الثانوية في هذا الحل تجريبيا.
  9. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الثانوية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 3 مرات مع العازلة الحجب.
  10. تطبيق حجم كاف من TBS تحتوي على دابي (50-100 نانوغرام / مل) أن تزج عينة الخلية. احتضان عينة خلية لمدة 5 دقائق على RT. شطف خلايا 1-2 مرات مع TBS.
  11. تركيب الغطاء الزجاجي الذي يحتوي على عينة الخلايا على الشريحة الصغيرة كما هو موضح في 2.11.

5. المناعي صورة للمراقبة، شراء، الكميات، وتحليل

  1. مراقبة عينة الخلية من خلال المجهر مضان الآلية مجهزة عدسة 63X 100X والغمر النفط، مصدر خارجي ضوء المدمجة، وكاميرا CCD الرقمية.
  2. أداء الحصول على الصور ومعالجتها، بما في ذلك deconvolution، باستخدام البرمجياتA، أو برامج B1 و B2 (انظر قائمة المواد / المعدات). يرجى الاطلاع التكميلي Files الرمز (5.2.1) لجميع الأوامر المستخدمة في البرامج A. لجميع الأوامر المستخدمة في برامج B1 و B2، يرجى الاطلاع على (5.2.2) في ملفات التعليمات البرمجية التكميلي.
  3. استخدام الأسلوب هو موضح سابقا 23-25 ​​لتحديد إشارات من البروتينات السنترومير الحيز الحركي (على سبيل المثال، وتبقى إشارات CENP-A في السنترومير) مع تعديلات طفيفة التالية:
    1. حدد منطقة البروتينات السنترومير الحيز الحركي والخلفية على النحو التالي:
      1. الخلية الإنقسامية: (منطقة السنترومير الحيز الحركي) حدد منطقة متداخلة مع الكروموسومات ملطخة دابي. (المنطقة الخلفية) ومنطقة خارج الكروموسومات ولكن داخل خلية واحدة متطابقة (المنطقة أي عصاري خلوي).
      2. الخلية الطور البيني: (منطقة السنترومير الحيز الحركي) حدد منطقة متداخلة مع لونين ملطخة دابي. (المنطقة الخلفية) ومنطقة خارج لونين ولكن داخل خلية واحدة مماثلة (<م> أي منطقة عصاري خلوي).
        ملاحظة: انظر القانون أيضا التكميلي الملفات (5.2.1.4.3) أو (5.2.2.6.4) لاختيار المنطقة مع البرامج أو البرامج B2، على التوالي.
    2. تحديد النسبة المئوية للإشارات المتبقية في القسيم باستخدام البرامج أو B. لهذه المهمة، استخدم الصيغة التالية:
      تبقى إشارات من البروتين السنترومير-الحيز الحركي في السنترومير-الحيز الحركي
      figure-protocol-1
      حيث الصورة هو سطوع إشارة من المنطقة المحددة، وهو ما يؤكده ACA أو CENP-B تلطيخ، ب هي سطوع إشارة الخلفية؛ عينة ص هي ACA إشارة أو CENP-B إشارات لسيرنا (ق) الخلايا المعالجة بالإثير. وص السيطرة هو ACA إشارة أو إشارات CENP-B للخلايا transfected سيرنا لوك.
      ملاحظة: في هذا التحليل، تم استخدام إشارات CENP-B كإشارات مرجعية لCUL4A وRBX1 كما هو موضح في التقارير السابقة.
    3. استخدام ملف Excel لهذا الحساب بعد نسخ ولصق البيانات الخام من البرنامج إشارة الكميات المذكورة أعلاه. انظر أيضا ملفات التعليمات البرمجية الإضافية: (5.2.1.4) و (5.2.2.6) لمزيد من التفاصيل. ويظهر أحد الأمثلة على حساب في الجدول 3.
  4. تحليل لا يقل عن 20 خلايا للقضاء على التفاوت في تلطيخ والحصول على الصور لكل مستوى القياس. اختياريا استخدام "قيمة المتوسط" ما تبقى من إشارات السنترومير الحيز الحركي لكل تحليل الخلية لمقارنة هذه القيم بين البروتينات السنترومير الحيز الحركي المختلفة.

6. الغربية تحليل وصمة عار من البروتين الكلي

  1. resuspend الخلايا في تغيير طبيعة العازلة ألف (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 و 50 ملي كلوريد الصوديوم، 0.5٪ Nonidet P-40؛ 0.5٪ deoxycholate؛ 0.5٪ SDS، 1 ملم EDTA، والكامل خالية من EDTA مثبط البروتياز كوكتيل)، 26 موضوع التعليق لصوتنة وتجميد عملية ذوبان الجليد، وقياستركيزات البروتين على النحو التالي:
    1. وفيما يتعلق بعملية صوتنة، إضافة 50 ميكرولتر من العازلة ألف من الخلايا التي تم جمعها من بئرين لوحة البوليسترين 6 جيدا في 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (انظر البروتوكول 1). تشغيل sonicator مجهزة القرن اختلال وmicrotip (انظر قائمة المواد / المعدات) لمجموع 15 ثانية مدة متقطعة النبض (دورة عمل 50٪) في عينة واحدة.
    2. لتجميد عملية ذوبان الجليد، وتجميد الخلايا مع النيتروجين السائل وذوبان الجليد الخلايا في RT.
    3. قياس تركيز البروتين باستخدام التجارية البروتين الفحص الكاشف الأول أو الثاني (انظر قائمة المواد / المعدات).
      والمخفف لست] مع نسبة 01:10 في قياس تركيزات البروتين مع أي كاشف الأول أو الثاني: مذكرة. وفي هذا التخفيف والحاضر SDS في المخزن ويظهر التدخل ضئيلة أو معدومة في هذا القياس.
  2. خلط المحللة التي تحتوي على 20-30 ميكروغرام من البروتين الكلي مع العازلة تحميل 2 × أو 4 × SDS-PAGE 27 تغلي العينات ل5 دقائق ثم تحميلها على 12.0٪ -15.0٪ تغيير طبيعة هلام SDS-بولي أكريلاميد لالكهربائي.
  3. نقل البروتينات مفصولة SDS-PAGE على غشاء PVDF باستخدام طريقة النشاف الغربية التي سبق وصفها. 17،24،27-31
    1. منع مواقع الربط غير محددة على الغشاء مع 5٪ الحليب الخالي من الدسم في 1 × PBS، ثم احتضان الغشاء مع حلول الأجسام المضادة الأولية مخففة لمدة 1 ساعة على RT. انظر قائمة المواد / المعدات للحصول على معلومات مفصلة (على سبيل المثال، نسبة التخفيف) من كل الأجسام المضادة الأولية.
    2. بعد غسل مرات غشاء 3-4 (كل حضانة 3- إلى 5 دقيقة مع اهتزاز) مع برنامج تلفزيوني-T عازلة (1 × برنامج تلفزيوني و 0.1٪ توين-20)، احتضان الغشاء في خليط من الأشعة تحت الحمراء القريبة (الأشعة تحت الحمراء) الأجسام المضادة الثانوية صبغ مترافق فلوري (نسبة التخفيف من 1: 20،000)، والأجسام المضادة الثانوية DyLight مترافق (نسبة التخفيف من 1: 20،000)، و / أو الفجل البيروكسيديز (HRP) -conjugated الأجسام المضادة الثانوية (المخفف في برنامج تلفزيوني-T، dilutiعلى نسبة 1: 10،000) لمدة 1 ساعة على RT. انظر قائمة المواد / المعدات للحصول على معلومات مفصلة (على سبيل المثال، نسبة التخفيف) من كل الأجسام المضادة الثانوية.
  4. غسل غشاء 3 مرات، ثم مسح غشاء لتحليل البروتينات مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء و / أو تصوير التوهج للكشف عن طخة مناعية (انظر قائمة المواد / المعدات).
    1. لاستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء، انظر (6.4.1) في ملفات التعليمات البرمجية التكميلي.
    2. لاستخدام تصوير التوهج، انظر (6.4.2) في ملفات التعليمات البرمجية التكميلي. استخدام فائقة الحساسية تعزيز chemiluminescent (ECL) الركيزة (انظر قائمة المواد / المعدات) لهذا النظام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحليل المناعي من الذاتية CENP-A تدعم الفرضية القائلة بأن هناك حاجة CUL4A-E3 يغاز لتوطين CENP-A إلى القسيم
وأظهرت لنا الدراسات الحديثة أن CUL4A-RBX1-COPS8 E3 النشاط يغاز مطلوب للubiquitylation من ليسين 124 (K124) على CENP-A وتوطين CENP-A إلى القسيم. 17 في البداية، تم عزل مجمع البيني-السنترومير (ICEN) من خلال مكافحة CENP-A: أصلي لونين مناعي، 32-34، وقد افترض أن بعض البروتينات ICEN قد تلعب دورا في توطين CE...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة قد وضعت العديد من الدراسات المختلفة المقايسات المجهر الكمي للخلايا ثابتة. 42 التقدم في علم الأحياء السنترومير-الحيز الحركي وغالبا ما يتطلب فهم وظيفة السنترومير محددة أو الحيز الحركي محددة من البروتينات التي التحت خلوية تنظيم المكانية والزمانية ويعكس الوظائف المتغيرة لل هذه البروتينات خلال دورة الخلية. لذلك، هنا وضعنا طرق معهد التمويل الدولي تلطيخ وفحص معهد التمويل الدولي الكمي لتحليل تحديدا المستويات النسبية للالداخلية والخارجية البروتينات CENP-A، وال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM68418.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamin 2000Life Technologies / Invitrogen11668كاشف التعداء I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies / كاشف التعداء Invitrogen13778II
Opti-MEM ILife Technologies / Invitrogen31985وسائط مصل مخفضة ، دافئة في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
DMEM عالي الجلوكوز (Dulbecco' s النسر المعدل s متوسط)Life Technologies / BioWhittaker12-604DMEM عالي الجلوكوز ، دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
مصل الأبقار الجنيني ، معتمد ، معطل بالحرارة ، من أصل أمريكيLife Technologies / Gibco10082FBS (مصل الأبقار الجنينية)
Poly-L-Lysine SOLUTIONSIGMA-SLDRICHP 8920Poly-L-Lysine ، 0.1٪ وزن / حجم ، في الماء
UltraPure DistilledWater Life Technologies / Invitrogen / Gibco10977ماء معقم لزراعة الأنسجة   ؛
زجاج الغطاء الصغير (22 مم × 22 مم)  Surgipath105غطاء زجاجي (22 مم × 22 مم)  
6 مجموعة ثقافة خلايا الآبارفيشر / كورنينج إنكوربوريتد07-200-836 آبار لوحة البوليسترين   ؛
البنسلين ، الستربتومايسين. سائلفيشر / جيبكو15-140البنسلين ستربتومايسين
PAP PEN   ؛موقع الربطAD100.1قلم حاجز كاره للماء (لحاجز طارد للماء في تلطيخ الفلورسنت المناعي)
باكليتاكسيل (تاكسول)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol لتحليل الخلايا الانقسامية
TN-16 ، مثبط الأنابيب الدقيقة (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 لتحليل الخلايا الانقسامية
BSA (ألبومين مصل الأبقار)كاشف حجب SIGMA-SLDRICHA7906
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787منظف للنفاذية
بارافورمالديهايدSIGMA-SLDRICHP6148تثبيت ريagant
DAPISIGMA-SLDRICHD9542للتلوين النووي
P-phenylenediamineSIGMA-SLDRICHP6001لتركيب شرائح
VWR الصغيرة المتوسطة ، بلوريVWR International48312-013الشرائح الصغيرة 
الأجسام المضادة المضادة CENP-AStressgen / Enzo Life SciencesKAM-CC006الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ؛ نسبة التخفيف 1: 100 (IIF) ، 1: 5000 (WB)
الأجسام المضادة المضادة ل CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01Pالفأر المضاد أحادي النسيلة ؛ نسبة التخفيف 1: 200 (IIF ، تثبيت الميثانول / الأسيتون) -1: 400 (IIF ، تثبيت بارافورمالدهايد) الأجسام
المضادة المضادة ل CENP-B   ؛abcamab25734أجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانب ؛ نسبة تخفيف 1: 200 (IIF ، تثبيت الميثانول / الأسيتون) -1: 400 (IIF ، تثبيت بارافورمالدهايد)
الأجسام المضادة للسنترومير (ACA)Fitzgerald Industries International، Inc.90C-CS1058مضاد سنترومير بشري ؛ نسبة التخفيف 1: 2000 (IIF)
مختبرات البيثيلالمضادة للأجسام المضادة CENP-HBL1112 (A400-007A)أجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانب ؛ نسبة التخفيف 1: 200 (IIF)
الجسم المضاد المضاد ل CENP-HBD612142الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ؛ نسبة التخفيف 1: 200 (IIF)
الأجسام المضادة المضادة ل CENP-IN / A ، د. كاتوسمي كيتاغاواN / A ، د. كاتوسمي كيتاغاواأجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانب. نسبة التخفيف 1: 1000 (IIF) ؛ Niikura et al. ، Oncogene ، 4133-4146 (2006)
الأجسام المضادة المضادة ل KNL1Novus BiologicalsNBP1-89223الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب ؛ نسبة التخفيف 1: 100 (IIF)
الأجسام المضادة المضادة ل Hec1Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ؛ نسبة التخفيف 1: 100 (IIF)
الأجسام المضادة المضادة ل Hec1GeneTexGTX110735الأرانب المضادة متعددة النسيلة ؛ نسبة التخفيف من 1: 100 (IIF)
الجسم المضاد المضاد ل Ska1abcamab46826الأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة ؛ نسبة التخفيف 1: 100 (IIF)
الجسم المضاد المضادللعلم SIGMA-ALDRICHF3165المضاد أحادي النسيلة للفأر ؛ نسبة التخفيف 1: 1000 (IIF) ، 1: 5000 (WB)
الجسم المضاد المضاد للعلمSIGMA-ALDRICHF7425الأرانب المضاد متعدد النسيلة ؛ نسبة التخفيف 1: 1000 (IIF) ، 1: 5000 (WB)
Anti-CUL4A الجسم المضادN / A ، الدكتور براديب رايتشودوريN / A ، الدكتور براديب رايتشودوريالأرنب الأجسام المضادة متعددة النسيلة ؛ نسبة التخفيف 1: 3000 (WB) ؛ شيانوف وآخرون ، مجلة الكيمياء البيولوجية ، 35309-35312 (1999)
الخلية المضادة للأجسام المضادة RBX14397الأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة ؛ نسبة التخفيف 1: 2000 (WB)
الأجسام المضادة المضادة ل GAPDHChemiconMAB374الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ؛ نسبة التخفيف 1: 5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies / InvitrogenA11001الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب) Alexa
Fluor 594 Goat المضاد للفأر IgGLife Technologies / InvitrogenA11005المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب) Alexa
Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies / InvitrogenA11008الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies / InvitrogenA11012الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب)
الحليب المجفف الخالي من الدسم (البديل المعتمد للحليب المجفف بالقرنفل)فيشر العلمي(إعادة الطلب رقم 190915 ؛ Lot # 90629)الحليب الخالي من الدسم
Leica DM IRE2 مجهر مضان بمحركات   ;مجهر لايكا الآلي المضان  
HCX PL APO 63x عدسة غمر الزيتلايكاLEICA HCX PL APO NA 1.40 زيت PH 3 CS63X عدسة غمر الزيت
HCX PL APO 100x عدسة غمر الزيتLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X عدسة غمر الزيت
Leica EL6000 مصدر الضوء المضغوطلايكاضوء خارجي مضغوط لإثارة الفلورسنت
كاميرا CCD الرقمية ORCA-R2  كاميرا CCD الرقمية HamamatsuC10600-10B 
Openlab الإصدار 5.5.2 برنامج التصوير العلمي Perkin Elmer / Improvisionلمراقبة الصور والاستحواذ عليها والقياس الكمي والتحليل
Velocity الإصدار 6.1.1 برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد   ؛Perkin Elmer / Improvisionلمراقبة الصور والاستحواذ عليها والقياس الكمي والتحليل
كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTAأقراص كوكتيل Roche11873580001 / 11836170001Protease PlusOne
2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56كاشف مقايسة البروتين التجاري الأول لقياس تركيز البروتين (متوافق مع 2٪ SDS)
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006كاشف فحص البروتين التجاري II لقياس تركيز البروتين (متوافق مع 0.1٪ SDS)
Immobilon-FLEMD MilliporeIPFL00010غشاء PVDF لنقل
IRDye 800CW الماعز المضاد للفأر IgGLI-COR Biosciences926-32210الأشعة تحت الحمراء الجسم المضاد الثانوي المترافق بالصبغة الفلورية (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب) ؛ نسبة التخفيف 1: 20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgGLI-COR Biosciences926-32221IR الجسم المضاد الثانوي المترافق بالصبغة الفلورية (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب) ؛ نسبة التخفيف 1: 20000 (IIF)
الماعز المضاد للفأر IgG DyLight 549فيشر ScientificPI35507الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع DyLight الأشعة تحت الحمراء المضادة الثانوية المترافقة بالصبغة الفلورية (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب) ؛ نسبة التخفيف 1: 20000 (IIF)
الماعز المضاد للأرانب DyLight 649فيشر ScientificPI35565الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع DyLightالجسم المضاد الثانوي المترافق بالصبغة الفلورية IR (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب) ؛ نسبة التخفيف 1: 20000 (IIF)
الماعز المضاد للفأر IgG-HRPسانتا كروزSC-2005الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP الجسم المضاد الثانوي المترافق مع DyLight الجسم المضاد الثانوي المترافق بالصبغة الفلورية IR (ثانوي منقى التقارب الجسم المضاد) ؛ نسبة التخفيف 1: 10000 (IIF)
الماعز المضاد للأرانب IgG-HRPسانتا كروزSC-2004الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP الجسم المضاد الثانوي المترافق مع DyLight الجسم المضاد الثانوي المترافق بالصبغة الفلورية IR (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب) ؛ نسبة التخفيف 1: 10000 (IIF)
Openlab الإصدار 5.5.2. برامج التصوير العلمي Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity الإصدار 6.3 برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد (اكتساب Volocity)برنامج PerkinElmerB1
Volocity الإصدار 6.3 برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد (القياس الكمي للحجم)برنامج PerkinElmerB2
برانسون سونيفاير 450Sonicator
برانسون بالموجات فوق الصوتية خطوة Microtip ، صلب ، الخيوط 9.5 ممVWR Scientific Products Inc.  33995-325بوق الاضطراب للصوتنة
برانسون الموجات فوق الصوتية سونيكتور Microtip مدبب 6.5 ممVWR المنتجات العلمية Inc.  33996-185Microtip لنظام
التصوير بالأشعة تحت الحمراء Odyssey CLx  الحمراء LI-COR Biosciencesللكشف عن اللطخة المناعية
تحليل استوديو الصور الإصدار 4.0  LI-COR BiosciencesSoftware C
Molecular Imager Versadoc MP4000 System جهاز تصوير التلألؤ الكيميائي Bio-Rad للكشف عن اللطخة المناعية
Bio-RadSoftware D
SuperSignal West Femto الركيزة القصوى للحساسيةThermo34095ركيزة التلميء الكيميائي المعزز فائقة الحساسية (ECL)
الجسم إشارات الجسم NC9255871 مصدر نظام التصوير بالأشعة تحت برنامج الكمية برنامج تحليل واحد 1-D 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold. J Cell Biol. 98, 352-357 (1984).
  3. Hoffman, D. B., Pearson, C. G., Yen, T. J., Howell, B. J., Salmon, E. D. Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins at PtK1 kinetochores. Molecular biology of the cell. 12, 1995-2009 (2001).
  4. Regnier, V., et al. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubR1. Mol Cell Biol. 25, 3967-3981 (2005).
  5. Bernad, R., Sanchez, P., Losada, A. Epigenetic specification of centromeres by CENP-A. Exp Cell Res. 315, 3233-3241 (2009).
  6. Black, B. E., Cleveland, D. W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes. Cell. 144, 471-479 (2011).
  7. Warburton, P. E., et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 7, 901-904 (1997).
  8. Karpen, G. H., Allshire, R. C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function. Trends Genet. 13, 489-496 (1997).
  9. Black, B. E., et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature. 430, 578-582 (2004).
  10. Black, B. E., et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-A targeting domain. Mol Cell. 25, 309-322 (2007).
  11. Fachinetti, D., et al. A two-step mechanism for epigenetic specification of centromere identity and function. Nat Cell Biol. 15, 1056-1066 (2013).
  12. Zeitlin, S. G., Shelby, R. D., Sullivan, K. F. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. The Journal of cell biology. 155, 1147-1157 (2001).
  13. Zhang, X., Li, X., Marshall, J. B., Zhong, C. X., Dawe, R. K. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. The Plant cell. 17, 572-583 (2005).
  14. Goutte-Gattat, D., et al. Phosphorylation of the CENP-A amino-terminus in mitotic centromeric chromatin is required for kinetochore function. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8579-8584 (2013).
  15. Bailey, A. O., et al. Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation of centromeric chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 11827-11832 (2013).
  16. Samel, A., Cuomo, A., Bonaldi, T., Ehrenhofer-Murray, A. E. Methylation of CenH3 arginine 37 regulates kinetochore integrity and chromosome segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9029-9034 (2012).
  17. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Dev Cell. , (2015).
  18. Chan, G. K., Liu, S. T., Yen, T. J. Kinetochore structure and function. Trends in cell biology. 15, 589-598 (2005).
  19. Hori, T., Okada, M., Maenaka, K., Fukagawa, T. CENP-O class proteins form a stable complex and are required for proper kinetochore function. Molecular biology of the cell. 19, 843-854 (2008).
  20. Fukagawa, T., Earnshaw, W. C. The centromere: chromatin foundation for the kinetochore machinery. Developmental cell. 30, 496-508 (2014).
  21. Kedersha, N. The Proteintech Blog.Proteintech. Grainger, D. , Proteintech Group. (2012).
  22. Clontech Laboratories, Inc. HeLa Tet-Off Advanced Cell Line. , Available from: http://www.clontech.com/CR/Products/Inducible_Systems/Tetracycline-Inducible_Expression/ibcGetAttachment.jsp?cItemId=26908&fileId=6712191&sitex=10020:22372:US (2012).
  23. Meraldi, P., Sorger, P. K. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. EMBO J. 24, 1621-1633 (2005).
  24. Niikura, Y., et al. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, causes kinetochore defects: a novel mechanism by which 17-AAG inhibits cell proliferation. Oncogene. 25, 4133-4146 (2006).
  25. Yang, Z., et al. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, 4062-4074 (2005).
  26. Wang, H., et al. Histone H3 and H4 ubiquitylation by the CUL4-DDB-ROC1 ubiquitin ligase facilitates cellular response to DNA damage. Mol Cell. 22, 383-394 (2006).
  27. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR? Trends Biochem Sci. 20, 257-259 (1995).
  28. Kitagawa, K., Skowyra, D., Elledge, S. J., Harper, J. W., Hieter, P. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex. Mol Cell. 4, 21-33 (1999).
  29. Niikura, Y., Dixit, A., Scott, R., Perkins, G., Kitagawa, K. BUB1 mediation of caspase-independent mitotic death determines cell fate. J Cell Biol. 178, 283-296 (2007).
  30. Niikura, Y., Kitagawa, K. Identification of a novel splice variant: human SGT1B (SUGT1B). DNA Seq. 14, 436-441 (2003).
  31. Niikura, Y., Ogi, H., Kikuchi, K., Kitagawa, K. BUB3 that dissociates from BUB1 activates caspase-independent mitotic death (CIMD). Cell Death Differ. 17, 1011-1024 (2010).
  32. Ando, S., Yang, H., Nozaki, N., Okazaki, T., Yoda, K. CENP-A, -B, and -C chromatin complex that contains the I-type alpha-satellite array constitutes the prekinetochore in HeLa cells. Mol Cell Biol. 22, 2229-2241 (2002).
  33. Izuta, H., et al. Comprehensive analysis of the ICEN (Interphase Centromere Complex) components enriched in the CENP-A chromatin of human cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 11, 673-684 (2006).
  34. Obuse, C., et al. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes Cells. 9, 105-120 (2004).
  35. Merlet, J., Burger, J., Gomes, J. E., Pintard, L. Regulation of cullin-RING E3 ubiquitin-ligases by neddylation and dimerization. Cell Mol Life Sci. 66, 1924-1938 (2009).
  36. Bennett, E. J., Rush, J., Gygi, S. P., Harper, J. W. Dynamics of cullin-RING ubiquitin ligase network revealed by systematic quantitative proteomics. Cell. 143, 951-965 (2010).
  37. Antonelli, A., et al. Efficient inhibition of macrophage TNF-alpha production upon targeted delivery of K48R ubiquitin. Br J Haematol. 104, 475-481 (1999).
  38. Codomo, C. A., Furuyama, T., Henikoff, S. CENP-A octamers do not confer a reduction in nucleosome height by AFM. Nat Struct Mol Biol. 21, 4-5 (2014).
  39. Thrower, J. S., Hoffman, L., Rechsteiner, M., Pickart, C. M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. The EMBO journal. 19, 94-102 (2000).
  40. Yoda, K., et al. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 7266-7271 (2000).
  41. Shelby, R. D., Vafa, O., Sullivan, K. F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires a cooperative array of nucleosomal DNA contact sites. J Cell Biol. 136, 501-513 (1997).
  42. Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes. J Vis Exp. , (2014).
  43. Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N., Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109, 1963-1973 (1989).
  44. Yoda, K., Kitagawa, K., Masumoto, H., Muro, Y., Okazaki, T. A human centromere protein, CENP-B, has a DNA binding domain containing four potential alpha helices at the NH2 terminus, which is separable from dimerizing activity. J Cell Biol. 119, 1413-1427 (1992).
  45. Sugata, N., et al. Human CENP-H multimers colocalize with CENP-A and CENP-C at active centromere--kinetochore complexes. Hum Mol Genet. 9, 2919-2926 (2000).
  46. Earnshaw, W. C., Ratrie, H. 3rd, Stetten, G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98, 1-12 (1989).
  47. Goshima, G., Kiyomitsu, T., Yoda, K., Yanagida, M. Human centromere chromatin protein hMis12, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J Cell Biol. 160, 25-39 (2003).
  48. Liu, S. T., Rattner, J. B., Jablonski, S. A., Yen, T. J. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol. 175, 41-53 (2006).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. T time for point centromeres. Nat Cell Biol. 14, 559-561 (2012).
  50. Gascoigne, K. E., et al. Induced ectopic kinetochore assembly bypasses the requirement for CENP-A nucleosomes. Cell. 145, 410-422 (2011).
  51. Nishino, T., et al. CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly. EMBO J. 32, 424-436 (2013).
  52. Malvezzi, F., et al. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J. 32, 409-423 (2013).
  53. Schleiffer, A., et al. CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex. Nat Cell Biol. 14, 604-613 (2012).
  54. Rago, F., Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Distinct organization and regulation of the outer kinetochore KMN network downstream of CENP-C and CENP-T. Curr Biol. 25, 671-677 (2015).
  55. Nishino, T., et al. CENP-T-W-S-X forms a unique centromeric chromatin structure with a histone-like fold. Cell. 148, 487-501 (2012).
  56. Bodor, D. L., et al. The quantitative architecture of centromeric chromatin. Elife. 3, e02137(2014).
  57. Oliver, C. Ch 58. Molecular Biomethods Handbook. Rapely, R., Walker, J. M. , Humana Press. 1063-1079 (2008).
  58. Terasima, T., Tolmach, L. J. Changes in x-ray sensitivity of HeLa cells during the division cycle. Nature. 190, 1210-1211 (1961).
  59. Levenson, G. B. R. Ch 8. Biomedical Photonics Handbook. Vo-Dinh, T. uan , CRC Press LLC. 8-19 (2003).
  60. Sanderson, J. Fluorescence bleed-though. , Available from: http://www.gum2012.fionastoreydesign.co.uk/Downloads/Bleed through text.pdf (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immunofluorescence AnalysisCentromere Kinetochore ProteinsEndogenous Exogenous ProteinsParaformaldehyde FixationFlag tagged CENP AHuman Cell CultureIndirect Immunofluorescence StainingFluorescence MicroscopyProtein Localization QuantificationCell Fixation Protocol

Related Articles