مقالة منهجية

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

DOI:

10.3791/53743

⸱

مارس 16, 2016

 ,  , 
1Curriculum in Neurobiology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Cell Biology and Physiology, The University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
توضح تقنيات الفحص المجهري الخفيف

إلى جانب المقايسات الكيميائية الحيوية تورط إفراز الخلايا بوساطة SNARE في تفرع المحور العصبي المعتمد على النيترين. يسمح هذا المزيج من التقنيات بتحديد الآليات الجزيئية التي تتحكم في تفرع المحاور العصبي وتغيير شكل الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء التطور العصبي ، تمتد المحاور النامية إلى العديد من الشركاء المشبكيين من خلال تطوير الفروع المحورية. يتم تعزيز التفرع المحوري من خلال إشارات التوجيه خارج الخلية مثل النيترين -1 وينتج عنه زيادات كبيرة في مساحة سطح غشاء البلازما المحورية. من المحتمل أن يتضمن تفرع المحور العصبي المعتمد على Netrin-1 تحكما زمانيا ومكانيا في تمدد غشاء البلازما ، والذي يتم توفير مكوناته من خلال اندماج الحويصلة الخارجية. يسبق أحداث الاندماج هذه تكوين مجمعات SNARE ، التي تشتمل على v-SNARE ، مثل VAMP2 (بروتين الغشاء المرتبط بالحويصلة 2) ، وغشاء البلازما t-SNAREs ، وsyntaxin-1 و SNAP25 (البروتين المرتبط بالمشابك 25). مفصل هنا هو نهج متعدد الجوانب يستخدم لفحص دور إفراز الخلايا بوساطة SNARE في تفرع المحور العصبي. تكمن قوة النهج المشترك في الحصول على البيانات في مجموعة من الدقة المكانية والزمانية ، والتي تمتد من ديناميكيات أحداث اندماج الحويصلة المفردة في الخلايا العصبية الفردية إلى تكوين مجمع SNARE وتفرع المحور العصبي في مجموعات الخلايا العصبية المستنبتة. يستفيد هذا البروتوكول من الأساليب الكيميائية الحيوية المعمول بها لفحص مستويات مجمعات SNARE الداخلية والفحص المجهري لمضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) للخلايا العصبية القشرية التي تعبر عن VAMP2 الموسومة ب GFP الحساس للأس الهيدروجيني (VAMP2-pHlourin) لتحديد التغيرات المعتمدة على النيترين -1 في نشاط الخلايا الخارجية في الخلايا العصبية الفردية. لتوضيح توقيت التفرع المعتمد على النيترين -1 ، يتم استخدام الفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي بفاصل زمني (DIC) للخلايا العصبية المفردة على مدى ساعات. يوضح التألق المناعي للخلايا الثابتة المقترن بالسموم العصبية للبوتولينوم التي تشق آلية SNARE وتمنع إفراز الخلايا أن تفرع المحور العصبي المعتمد على النيترين -1 يتطلب نشاطا خارجيا بوساطة SNARE.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير التقديرات الحديثة إلى أن الدماغ البشري يحتوي على 1011 خلية عصبية مع 1014 اتصالات متشابكة1 ، مما يسلط الضوء على أهمية تفرع المحور العصبي في الجسم الحي. إشارات توجيه المحور العصبي خارج الخلية مثل محاور توجيه النيترين -1 للشركاء المشبكيين المناسبين وتحفيز التفرع المحوري ، وبالتالي زيادة القدرة المشبكية2-5. يتضمن الشجرة المحورية المعتمدة على Netrin-1 توسعا كبيرا لغشاء البلازما6 ، والذي افترضنا أنه يتطلب توصيل مكونات غشاء إضافية عبر اندماج الحويصلة الخارجية المعتمدة على مركب SNARE7.

إن التحقيق في دور إفراز الخلايا بوساطة SNARE في تفرع المحور العصبي المعتمد على النيترين -1 معقد بسبب عدة عوامل. أولا ، يزيد عدم تجانس الخلايا العصبية القشرية من حجم العينة المطلوب لتحديد التأثيرات المهمة ، مما يعقد تقنيات الخلية المفردة مثل التصوير. ثانيا ، على الرغم من أن التقنيات الكيميائية الحيوية تسمح بمراقبة التغييرات التي تحدث على مستوى السكان ، إلا أنها تفتقر إلى الدقة الزمنية والمكانية اللازمة لتوطين تمدد غشاء البلازما إلى المحور العصبي في الإطار الزمني لتفرع المحور العصبي. أخيرا ، على الرغم من أن الفروع العصبية تتشكل على مدار ساعات ، إلا أن التغييرات الخلوية التي تساهم في التمدد المحوري قد تبدأ في غضون دقائق وتحدث في حدود الثواني ، وبالتالي توسيع النطاق الزمني للدراسة التجريبية.

نحدد نهجا متعدد التقنيات يعالج هذه المقاييس الزمنية والمكانية المتنوعة لإفراز الخلايا والتفرع العصبي ، وبالتالي يعزز فهمنا للآليات الخلوية الأساسية. يوفر استخدام هذه الأساليب دليلا يدعم دورا مهما لإفراز الخلايا بوساطة SNARE في تفرع المحور العصبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان من أخلاقيات البحث: جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات بالتفصيل هنا ويخضع للقواعد والأنظمة المعمول بها في لجنة قيادة الأمم المتحدة في رعاية الحيوان ومعايير المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام حيوانات المختبر.

1. إعداد وطلاء من فصل العصبونات القشرية

  1. الموت ببطء توقيت الحامل الإناث من CO 2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم. إزالة العقول كلها من جماجم الجنينية يوم 15.5 (E15.5) الفئران وmicrodissect القشور من كل نصف الكرة الغربي. للحصول على إرشادات مفصلة عن تسليخ مجهري من القشرة الماوس الجنينية يرجى الاطلاع Viesselmann آخرون 8.
  2. وضع لا يزيد عن 4 القشور في 1 مل من وسائل الاعلام تشريح في معقم 1.6 مل microtube. إضافة 120 ميكرولتر من 10X التربسين وعكس الأنبوب 3-5 مرات لخلط.
  3. باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا البذور أطباق زراعة الخلايا. ملاحظة: توفر 1 نصف الكرة القشرية approximately ثلاثة ملايين الخلايا.
    1. لمقاومة للSDS كمين فحص الكيمياء الحيوية المعقدة، لوحة ستة ملايين الخلايا في 35 طبق مم والاستفادة من طبقين لكل حالة. ملاحظة: يتم تبسيط هذه باستخدام 6 لوحات جيدا عند مقارنة شروط متعددة.
    2. لفحوصات المتفرعة، تغسل الخلايا العصبية لوحة على حمض النيتريك coverslips دائرية في مناطق ذات كثافة من 250000 خلية لكل 35 مم طبق، لمدينة دبي للإنترنت التصوير من محور عصبي المتفرعة لوحة في مناطق ذات كثافة من 150،000. هذه الكثافة تجنب الاكتظاظ وتبسيط التحليل.
  4. ليعيش المجهر خلية TIRF، و resuspend مليوني الخلايا العصبية في ترنسفكأيشن في nucleofection حل في RT.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من خلية إلى تعليق microtube تحتوي على 10 ميكروغرام من VAMP2-pHlourin التعبير البلازميد وelectroporate مع nucleofector وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة 9.
    2. بعد تعداء إضافة على الفور 500 ميكرولتر من التربسين التبريد وسائل الإعلام، وإزالة تعليق من خلايا كفيت ولوحة في دنSITY من 400000 خلية لكل 35 مم الزجاج المطلي PDL طبق السفلي.
  5. لوحة جميع الخلايا العصبية القشرية في 2 مل من الإعلام الحر في الدم.

2. كمين تشكيل مجمع الفحص

ملاحظة: تم تجهيز المجمعات كمين المقاومة للSDS وتحليلها كما هو موضح في الأصل 10 مع التعديلات المفصلة أدناه. عن الأجسام المضادة بديلة التحقق من صحة لتلك المستخدمة هنا، راجع قسم المواد.

  1. تحفيز الخلايا العصبية القشرية E15.5 2 أيام في المختبر (DIV) مع 250 نانوغرام مل netrin-1 أو صورية التحكم / لمدة 1 ساعة قبل تحلل.
  2. قبل تجهيز العينات، الطرد المركزي بارد إلى 4 درجات مئوية، وضبط درجة الحرارة حمام الماء إلى 37 درجة مئوية، وكتلة الحرارة إلى 100 درجة مئوية.
  3. إزالة الأطباق خلية من الحاضنة ومكان على الجليد.
    1. وسائل الإعلام نضح من الخلايا، تحل محل مع ~ 2 مل الجليد الفوسفات الباردة مخزنة المالحة (PBS) بلطف 2 مرات عن 1-2 دقائق لكل يغسل.
    2. لهذا الاختبار، استخدام 2 آبار في كوندition.
    3. نضح في برنامج تلفزيوني من البئر الأول من شرط واستبدالها مع 250 العازلة التجانس ميكرولتر. ترك على الجليد لمدة 5 دقائق، ثم باستخدام رافع الخلية، والتجانس الخلايا على الجليد.
    4. نضح في برنامج تلفزيوني من البئر المقبل للحالة نفسها وإضافة الخليط المتجانس في الآونة الأخيرة إلى البئر. سيؤدي هذا إلى زيادة تركيزات البروتين. أكرر لجميع الظروف.
    5. عند الانتهاء، ماصة يتجانس الخليط حل لتبرد قبل 1.6 مل microtube على الجليد وإضافة 20٪ TritonX-100 من أجل التوصل إلى تركيز النهائي من 1٪ TritonX-100. يسحن خلط 10 مرات مع 1000 ميكرولتر ماصة مع التقليل من الفقاعات.
  4. احتضان أنابيب على الجليد لمدة 2 دقيقة لإذابة البروتينات. بعد الحضانة، الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6010 إطار التعاون الإقليمي في 4 درجات مئوية لتكوير المواد غير بالفاعلات. نقل طاف المحللة في المبرد أنبوب 1.6 مل جديد على الجليد.
  5. لتحليل تركيز البروتين باستخدام برادفورد فحص 11 وتمييع عينات إلى الاتحاد الدولي للسباحةلتر تركيز البروتين من 3-5 ملغ / مل مع العازلة التجانس تستكمل مع 1٪ TritonX-100 وعينة العازلة 5X تستكمل مع B-Mercaptethanol (BME) المتبقية.
  6. تقسيم كل عينة تجريبية بالتساوي في 2 الأنابيب. احتضان عينة واحدة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (المجمعات الفخ)، والآخر في 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (أحادية الفخ). عكس الأنابيب بشكل متقطع للحفاظ على عينات في الحل.
  7. تجميد العينات عند -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لفصل عبر SDS-PAGE. قبل تشغيل عينات عن طريق الكهربائي باستخدام تقنيات القياسية، reboil عينات المغلي سابقا لمدة 5 دقائق في 100 درجة مئوية، ولكن ذوبان الجليد 37 ° C عينات في RT.
  8. التكرارات تشغيل العينات (30 - 40 ميكروغرام من البروتين لكل عينة) على كل من 8٪ ومادة هلامية بنسبة 15٪. توفر 8٪ الفصل المثالي للمجمع، في حين يتم استخدام 15٪ لتحديد أحادية البروتين الفخ (SNAP-25 ~ 25kDa، VAMP2 ~ 18kDa، syntaxin-1 ~ 35kDa). الحفاظ على مصدر الطاقة في 70 V حتى خط صبغ هو من خلال STACالملك جل وزيادة الجهد 90V. تشغيل المواد الهلامية حتى يعمل صبغ خارج.
  9. للحفاظ على أحادية، ونقل البروتينات إلى 0.2 ميكرومتر غشاء النيتروسليلوز على الجليد باستخدام عازلة نقل البارد مع 20٪ ميثانول (MeOH) وأضاف، في 70 V لمدة 45 دقيقة.
  10. غشاء الجافة في طبق مغطى لمدة 2 ساعة إلى O / N في RT (O / N يوفر أفضل النتائج).
  11. كتلة كمين الأغشية المعقدة في 10٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) لمدة 1 ساعة على RT.
  12. إعداد الأجسام المضادة الأولية (الاعتراف مكونات محددة كمين مجمع) في التخفيف من 1: 1000 والتحقيق O / N عند 4 درجات مئوية على شاكر دوارة.
    1. شطف البقع في تريس مخزنة المالحة بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 (TBS-T) 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  13. إعداد حلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في التخفيف من 1: 20،000 في 1٪ BSA في TBS-T والتحقيق لمدة 1 ساعة، وغطت في RT. كرر 2.12.1 الخطوة بعد 1 ساعة.
  14. البقع الصورة على جهاز المسح الفلورسنت مجهزة برمجيات وتحديد كل من شارك البروتين الفخmplex (عصابات مناعيا فوق 40kDa) وشرائح مونومر (عصابات مناعيا في 25 كيلو دالتون، 18 كيلو دالتون، 35 كيلو دالتون لSNAP-25، VAMP2 وsyntaxin-1، على التوالي) باستخدام تعليمات الشركة الصانعة لرسم رويس مستطيلة.

3. التصوير Exocytic الأحداث عبر TIRF المجهري

ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب معدات المجهر المتخصصة بما في ذلك غرفة البيئية للحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون 2، مجهر TIRF المقلوب مجهزة الإضاءة epifluorescent، وارتفاع التكبير / ارتفاع الفتحة العددية (NA) هدف TIRF، مرحلة XYZ الآلي، و حساس تهمة جانب جهاز (CCD) كاشف. يستخدم هذا البروتوكول المجهر المقلوب مؤتمتة بالكامل مجهزة 100X 1.49NA TIRF الموضوعي الحالة الصلبة 491 نانومتر ليزر والكترون ضرب اتفاقية مكافحة التصحر (EM-CCD). ويسيطر على كل المعدات من قبل التصوير والمراقبة ليزر البرمجيات. قبل بداية قوة بروتوكول التصوير على عضو هيئة الجائزة مديرonmental غرفة، المرحلة، مصباح، والكمبيوتر، وكاميرا.

  1. حدد الهدف في برامج التصوير. وبمجرد أن الهدف من ذلك هو في مكان، وربط سخان موضوعية حول العنق.
  2. تأكيد يخفض هذا الهدف تماما قبل تأمين حاضنة مرحلة في فتحة المرحلة. صب الماء المقطر في مداخل مرحلة حاضنة بالتساوي لمنع التسرب.
  3. تشغيل نظام الحضانة. فتح صمام خزان CO 2 والتأكد من الضغط المناسب لنظام فقا لتعليمات الشركة الصانعة. السماح للغرفة بعض الوقت ليصل إلى 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. قبل إضافة الطبق التصوير، ووضع صحن فارغ في الحاضنة لتجنب تكثيف الماء على الهدف.
  4. الطاقة على مصدر الليزر.
  5. فتح حاضنة المرحلة، وإضافة زيت الغمر للعدسة. وضع العينة في الحاضنة واستقرار مع الأسلحة الاستقرار أو وزن الطبق. رفع الهدف حتى يجعل النفط اتصال مع الجزء السفلي من العينة. Switcساعة إلى الإضاءة الخفيفة التي تنتقل عن طريق والعثور على طائرة الوصل العصبية من خلال oculars.
  6. بدء برنامج الليزر والاتصال إلى برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر. تعيين الإضاءة إلى widefield وتحديد الهدف تستخدم (ينصح 100X 1.49 NA TIRF). تعيين معامل الانكسار من العينة (خلايا ~ 1.38). ضبط كثافة الليزر عن طريق إلغاء "TTL" ليزر 491 نانومتر. ضبط شريط التمرير إلى 100 ثم جعله يتراجع إلى قيمة تتراوح بين 20 - 40٪. إعادة فحص "TTL".
  7. التركيز على عينة مرة أخرى في الإضاءة الخفيفة التي تنتقل عن طريق. الذهاب إلى برامج التصوير واختيار إضاءة ليزر 491 نانومتر، ومصراع مفتوحة. غرامة ضبط بؤرة ليزر على السقف ومركز نقطة إلى مركز الحجاب الحاجز الحقل مغلقة مع المكثف إزالتها. وضع مكثف رأسا على عقب على مقاعد البدلاء البصرية، حتى لا عدسة الصفر.
  8. استبدال المكثف والذهاب إلى البرنامج TIRF وتحديد عمق الاختراق (PD) إلى 110 نانومتر. التحول من الإضاءة widefield إلى ILLUM TIRFوضع ination للتصوير.
  9. البحث VAMP2-phluorin معربا عن الخلايا خلال oculars باستخدام epifluorescence widefield مع مصدر الضوء epifluorescent.
    1. ضبط المعلمات التصوير (زمن التعرض، وزيادة وقوة الليزر) لتعظيم إشارة إلى نسبة الضوضاء والنطاق الديناميكي باستخدام وقت التعرض الحد الأدنى من وحدة ليزر للحد من photobleaching من والضيائية (على سبيل المثال: التعرض بين 50-100 ميللي ثانية، مع 15-30 الحصول على 30٪ أقصى قوة الليزر).
    2. تعيين أوتوفوكس المستمر لكل خلية. الحصول على صورة لقطات متتابعة مع مجموعة اكتساب يحدث كل 0.5 ثانية لمدة 5 دقائق. للشرط netrin-1 حفز، إضافة 500 نانوغرام netrin-1 / مل على طبق من الخلايا في غطاء تدفق الصفحي وإعادة الإناء إلى الحاضنة لمدة 1 ساعة قبل التصوير.
  10. لتحديد وتيرة الأحداث exocytic تطبيع في مجال الخلايا والوقت، وفتح مداخن صورة في ImageJ عن طريق سحب الملف إلى نافذة أو الذهاب إلى ملف> فتح> اسم الملف (الشكل0؛ 2A أقحم 1).
    1. لإزالة إشارات فلوري المستقرة التي لا تمثل الأحداث حويصلة الانصهار، إنشاء متوسط ​​ض الإسقاط من كومة بأكمله باستخدام صورة> المكدس> Z-مشروع> نوع الإسقاط: متوسط ​​الكثافة. طرح هذا يعني صورة من كل صورة في لقطات متتابعة باستخدام عملية> صورة حاسبة> Image1 و: عملية الكدسة: طرح Image2 تم إنشاؤها حديثا متوسط ​​ض الإسقاط. وهذا يؤكد الأحداث exocytic (الشكل 2A أقحم 2-3).
    2. عدد الأحداث الانصهار exocytic بالعين. يتم تعريف الأحداث Exocytic مثل ظهور إشارة مضان محدودة الحيود، الذي ينشر بسرعة كما ينشر VAMP2-phluorin داخل غشاء البلازما (الشكل 2A أقحم 6).
    3. استخدام الأمر عتبة لتسليط الضوء على الصورة الأولى باستخدام صورة> ضبط> العتبة> ضبط المنزلق حتى الخلية كلها أبرزت عتبة (الشكل 2A أقحم 7-8).
    4. تحت آناينحل، اختر SetMeasurements وتحقق من المنطقة والتسمية العرض. حدد منطقة الخلوية thresholded باستخدام أداة العصا تتبع واضغط على "م" لقياس (الشكل 2A أقحم 7-8).
    5. نقل كل من أحداث الانصهار exocytic الفرز، القياسات مساحة الخلية، ووقت التصوير المنقضي إلى جدول بيانات لحساب عدد من exocytic الأحداث / مم 2 / الساعة (الشكل 2A أقحم 9).

4. التفاضلية التدخل التباين (DIC) لقطات متتابعة المجهر من أكسون التشعب

ملاحظة: بروتوكول كامل ومظاهرة للنهج عام لتصوير مدينة دبي للإنترنت متاح 12. في حين أن هذا البروتوكول يستخدم مدينة دبي للإنترنت، ويمكن استخدام أساليب المجهر الخفيفة التي تنتقل عن طريق أخرى لنفس الأغراض (على سبيل المثال: النقيض من المرحلة).

  1. في 2 DIV، مكان الزجاج طبق التصوير السفلي تحتوي على الخلايا العصبية untransfected في غرفة البيئية قبل تحسنت للحفاظ على الحياة الفطرية الرطبةironment مع 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. استخدام المجهر مجهزة 60X خطة-امزيغ، 1.4 NA مدينة دبي للإنترنت عدسة موضوعية وارتفاع المكثف NA حصول على أفضل جودة الصورة والقرار.
  2. ضبط البؤري للعثور على الخلايا العصبية من خلال oculars باستخدام تنتقل الإضاءة الخفيفة.
  3. باستخدام وظيفة اكتساب منطقة متعددة في برامج التصوير، والعثور على وحفظ المواقع XYZ لا يقل عن 6 خلايا. ضع مرحلة بحيث الخلايا العصبية من صالح المصالح داخل مجال الرؤية حصول على أفضل النتائج.
    1. حفز مع 250 نانوغرام / مل netrin-1 ثم اضغط على "بدء اكتساب منطقة متعددة. بالتتابع الحصول على صور في كل موقف كل 20 ثانية لمدة 24 ساعة، والتوقف الاستحواذ وإعادة تركيز عند الضرورة.
  4. استعراض الصور في برامج التصوير باستخدام تطبيقات> مراجعة متعدد الأبعاد البيانات> اسم الملف المفتوح. تحديد فروع محور عصبي مستقرة (20 ميكرون طويل) هذا الشكل خلال الدورة التصوير. استخدام أداة التعادل خط لقياس الفروع الخارجية stableaxonح من القاعدة في محور عصبي إلى طرف لضمان أن يتحقق طول تأهيل 20 ميكرون.
    1. في جدول بيانات، تسجيل رقم الإطار بعد التحفيز netrin عند الشروع نتوءات غشاء في المناطق التي تشكل فروع في وقت لاحق وكذلك رقم الإطار بعد التحفيز netrin عندما تصل فروع الوليدة 20 ميكرون في الطول.
    2. ضرب عدد من الإطارات بين بروز وتشكيل فرع بنسبة 20 ثانية لحساب الوقت تشكيل لكل فرع.

5. التلاعب السمية والثابتة Immunofluoresence خلية

  1. في 2 DIV، علاج الخلايا العصبية في ظروف تجريبية مع 250 نانوغرام / مل netrin-1 و / أو 10 نانومتر البوتولينوم توكسين (BONTA)، الذي يشق على SNAP25 البروتين الفخ ويمنع بشكل فعال كمين بوساطة إيماس 13، بالإضافة إلى 250 نانوغرام / مل netrin- 1. ترك مجموعة واحدة من الخلايا العصبية غير المعالجة كشرط السيطرة.
    تنبيه: BONTA يتطلب استخدام العين وحماية الجهاز التنفسي عند إعداد واستخدامالحلول. الحفاظ على جميع المواد الملوثة والمواد biohazardous والأوتوكلاف في أقرب وقت ممكن.
  2. في 3 DIV (24 ساعة بعد العلاج) وسائل الاعلام نضح، واستبدال مباشرة مع 1 مل على الأقل من الإصلاح PHEM (انظر الجدول 1 للاطلاع على التفاصيل) تحسنت إلى 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في RT.
  3. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني (لختم استخدامها في المستقبل مع بارافيلم وتخزينها في 4 درجة مئوية).
  4. مكان coverslips في الظلام، غرفة تلطيخ مرطب وpermeabilize أغشية الخلايا لمدة 10 دقيقة في المخفف الطازج بنسبة 0.2٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني (مصنوعة من 10٪ الأسهم TritonX-100).
  5. إزالة حل permeabilization وشطف مع 50 ميكرولتر من 1X مع برنامج تلفزيوني. كتلة لمدة 30 دقيقة في ~ 50 ميكرولتر من 10٪ الأبقار مصل الزلال في برنامج تلفزيوني (BSA-PBS) أو 10٪ المغلي حمار المصل في برنامج تلفزيوني في RT.
  6. شطف مع برنامج تلفزيوني 1X مرة أخرى. احتضان coverslips في 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (1: 1000 βIII تويولين، لتأكيد هوية الخلايا العصبية) في 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT، في الظلام.
  7. أداء 3X 5 يغسل دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان coverslips في 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية طيفيا-مميز للتويولين (1: 400)، وphalloidin فلوري (يختلف حسب الإثارة: 488 phalloidin في 1: 400، 647 phalloidin في 1: 100) في 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة .
  8. غسل 3X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X وجبل coverslips على الشرائح في وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
  9. فراغ زيادة وسائل الإعلام متزايدة من حواف ساترة وختم مع طلاء الأظافر واضحة.
  10. جمع الصور epifluorescence widefield على مجهر مقلوب مع هدف 40X 1.4NA، وقدرات epifluorescent وEM-CCD.
    1. تحليل يدويا المتفرعة باستخدام يماغيج. مداخن صورة مفتوحة في ImageJ عن طريق سحب الملف إلى نافذة أو الذهاب إلى ملف> فتح> اسم الملف (الشكل 4A أقحم 1).
    2. باستخدام خط> خط مجزأة، وتتبع محور عصبي، الذي يعرف بأنه أطول محوار تمتد من سوما (الشكل 4A أقحم 2-3).
    3. عن طريق تحليل> أدوات> مدير العائد على الاستثمار، وتوفير محور عصبي تتبع كمنطقة ذات الاهتمام. تعقب وحفظ كل فرع محور عصبي، الذي يعرف بأنه محوار ≥20 ميكرون في الطول. تشمل فروع فقط الابتدائية (الامتداد تنتشر مباشرة من محور عصبي) في التحليل (الشكل 4A أقحم 3-4).
    4. اضغط على "م" لقياس المناطق المحفوظة في المصالح، ونقل أطوال بالبكسل إلى جدول بيانات لحساب طول في ميكرون.
    5. تقسيم عدد من فروع محور عصبي ≥20 ميكرون في الطول، بسبب طول محور عصبي في ميكرون مقسوما على 100 للحصول على عدد من فروع محور عصبي في 100 طول ميكرون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام في المختبر التقنيات الحيوية لفحص كمية من المجمعات كمين المقاومة للSDS في عدد السكان من الخلايا العصبية. ويبين الشكل (1) ومما أدى لطخة غربية في أعقاب الانتهاء من الفخ فحص معقد مقاومة للSDS بحثها عن SNAP-25، syntaxin1A وVAMP2.

المجهر TIRF في غشاء الخلية القاعدية يوفر صور عالية الدقة من الأحداث الانصهار exocytic الفرد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرع المحاور هو عملية أساسية في النمو العصبي ويدعم الترابط العصبي الواسع للجهاز العصبي للثدييات. يعد فهم الآليات التي ينطوي عليها توسع غشاء البلازما الموضعي جزءا لا يتجزأ من فهمنا لكل من النمو العصبي الطبيعي والمرضي. إن استخدام نهج متعدد الجوانب يتضمن منهجيات مستوى السكان ومستوى الخلية المفردة يعزز قابلية التكاثر ويزيد من الدقة المكانية والزمانية دون المساس بتحليل مستوى السكان. على مستوى الخلية المفردة ، يوفر استخدام كل من أساليب الخلايا الثابتة والحية لفحص تفرع المحاور المعتمد على النيترين فائدة ثلاثية الأضعاف: القدرة ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة: ​​RO1-GM108970 (SLG) وF31-NS087837 (CW).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6-آبار زراعة الأنسجة المعالجة الألواحأوليمبوس بلاستيك25-105
أغطية زجاجيةفيشر العلمية12-545-8112CIR-1.5 ؛ يجب معالجتها بحمض النيتريك لمدة 24 ساعة ، وشطفها بماء DI 2x ، وتجفيفها قبل الاستخدام. يجب أن تكون مغلفة ب 1 مجم / مل بولي دي ليسين وشطفها قبل خلايا الطلاء.
محلول نواة AmaxaLonzaVPG-1001100 مل / تعداء
Amaxa Nucleofector / electroporatorبرنامج Lonzaبرنامج O-005
35 مم أطباق تصوير الخلايا الحية ذات القاع الزجاجيMatekCorporation p356-1.5-14-Cب 1 مجم / مل Poly-d-lysine وشطفها قبل خلايا الطلاء
Olympus IX81-ZDC2 المجهر المقلوبأوليمبوس
لامدا LS مصباح زينونSutter Instruments
شركة المرحلة البيئية أعلى حاضنةTokai Hit
100x 1.49 NA TIRF الهدفأوليمبوس
أندور iXon EM-CCDAndor
Odyssey Licor نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراءLI-COROdyssey CL-Xتستخدم لمسح البقع
استوديو الصور مجموعة البرامجLI-CORتستخدم للمسح الضوئي على نظام Odyssey Infrared ؛ يستخدم استوديو الصور الخفيف لتحليل البقع في وضع عدم الاتصال
التحول لأجهزة أوليمبوسالجزيئية ، LLCالإصدار 7.7.6.0البرنامج المستخدم لجميع عمليات التصوير وتحليل برنامج التحكم بفاصل زمني
DIC CELL TIRFبرنامج أوليمبوسالمستخدم للتحكم في الليزر لتصوير TIRF
فيجي (الصورة J)NIHImageJ الإصدار 1.49t
60x خطة Apochromat 1.4 NA الهدفأوليمبوس
40x 1.4 NA Plan Apochromat الموضوعيأوليمبوس
وسائط نيوروبازالجيبكو21103-049محلول أساسي لكل من وسائط التبريد الخالية من المصل والتربسين
مكمل B27جيبكو17504-044500 مل / 50 مل وسائط خالية من المصل ووسائط تبريد التربسين
L-Glutamine35050-061مل / 50 مل وسائط خالية من السيروم
ألبومين مصل الأبقارBio Basic Incorporated9048-46-8محلول 10٪ في 1x PBS لمنع الأغطية ؛ محلول 5٪ في TBS-T لمنع أغشية النيتروسليلوز.
10x  تريبسينسيجما59427C
HEPESCELLGRO25-060-Cl
محلول ملحي ذو فوسفات دولبيكو (DPBS) + Ca + MgCorning21-030 سم
مصل الجنين البقريCorning / CELLGRO35-010-CV
الملح المتوازن من هانك (HBSS)Corning / CELLGRO20-021-CV
كلوريد الصوديومفيشر العلميBP358-10
EGTAفيشر العلميCAS67-42-5
MgCl2< / sub> فيشرالعلميBP214-500
TRIS HClSigmaT5941-500
قاعدةTRIS فيشر العلميةBP152-5
N-Propyl GallateMP Biomedicals102747
الجلسرين الصف الضوئيAcros Organics18469-5000
الجلسرين (درجة غير البصريات) فيشرالعلميCAS56-81-5
B-mercaptoethonalFisher العلميBP176-100
SDSفيشر العلميBP166-500
الماء المقطر  GIBCO152340-147
Poly-D-LysineSigmap-7886مذاب في ماء معقم بمعدل 1 مجم / مل
توكسين BoNTAقائمة المختبرات البيولوجية128-A
أرنب متعدد النسيلة مضاد للإنسان VAMP2خلية إشارات11829
فأر أحادي النسيلة مضاد للفئران Syntaxin1Aسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-12736
الماعز متعدد النسيلة المضادة للإنسان SNAP-25سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-7538
الماوس أحادي النسيلة المضاد للإنسان وبيتا ؛ III-tubulin CovanceMMS-435P
Alexa Fluor 568 و Alexa Fluor 488 phalloidin ، أو Alexa Fluor 647Invitrogen
LI-COR IR-صبغ الأجسام المضادة الثانويةLI-CORP / N 925-32212 ، P / N 925-68023 ، P / N 926-68022800 حمار مضاد للفأر ، 680 حمار مضاد للأرانب ، 680 حمار مضاد للماعز
0.2 & 956 ؛ م حجم المسام غشاء النيتروسليلوزBiorad9004-70-0
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
الميثانولفيشر العلميS25426A
برومفينول الأزرقسيجماB5525-5G
السكروزفيشر العلميS6-212
بارافورمالدهايدفيشر العلميO-4042-500
Triton-X100فيشر العلميBP151-500
TEMEDفيشر العلميBP150-20
40٪ Bis-AcrylimideFisher العلميBP1408-1
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوية>الأجسام المضادة البديلة التي تم التحقق من صحتها< / قوي>
فأر أحادي النسيلة المضاد لتركيب HPC-1 استنساخSigma AldrichS0664
  الماوس أحادي النسيلة Synaptobrevin 2 (VAMP2)أنظمة متشابكة104-211
أنظمة متشابكة أحادية النسيلة SNAP25الماوس 111-011
يجب طلاء شركة شركة 1 محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
  2. Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  3. Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
  4. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  5. Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
  6. Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
  7. Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
  8. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Axon BranchingNeuronal MorphogenesisSNARE Mediated ExocytosisTIRF MicroscopyVAMP2 pHlourinDIC ImagingWestern BlotBotulinum ToxinNetrin 1 StimulationCortical Neurons

مقالات ذات صلة