يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل الخط-1 Retrotransposition في واحدة نواة مستوى

8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53753

⸱

أبريل 23, 2016

 , 
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care and Sleep Medicine, University of Arizona College of Medicine, 2Center for Applied Genetics and Genomic Medicine, University of Arizona College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

نحن هنا توظيف منهجية FISH لتتبع الخط 1 retrotransposition على مستوى نواة واحدة في هوامش كروموسوم من خطوط الخلايا HepG2 التعبير عن ثابت خط 1 الاصطناعية.

الملخص

يمثل العنصر النووي

العنصر النووي المتناثر الطويل -1 (السطر 1 أو L1) ما يقرب من 17٪ من الحمض النووي الموجود في الجينوم البشري. في حين أن غالبية L1s غير نشطة بسبب اقتطاعات 5 بوصات ، فإن ~ 80-100 من هذه العناصر تظل مختصة بالتحويل الرجعي وتنتشر إلى مواقع مختلفة في جميع أنحاء الجينوم عبر وسيطات الحمض النووي الريبي. بينما يعتقد أن L1s الأقدم تستهدف المناطق الغنية ب AT من الجينوم ، فإن أهداف الكروموسومات ل L1s الأحدث والأكثر نشاطا لا تزال غير محددة بشكل جيد. نصف هنا منهجية التهجين الموضعي (FISH) التي يمكن استخدامها لتتبع أنماط إدخال L1 ومعدلات دمج L1 خارج الرحم على مستوى النواة الواحدة. في هذه التجارب ، تم استخدام مجسات الفلوريسين إيزوثيوسيانات / السيانين -3 (FITC / CY3) المسماة بالنيومايسين لتتبع التحول الرجعي L1 في المختبر في خلايا HepG2 التي تعبر بثبات عن L1 خارج الرحم. تمنع هذه المنهجية الأخطاء في تقدير معدلات التبديل الرجعي الناجمة عن السمية وتأخذ في الحسبان حدوث عمليات إدخال متعددة في نواة واحدة.

المقدمة

الإنسان طويل تتخللها النووية العنصر 1 (الخط 1 أو L1) هو عنصر المنتقلة والمستقلة التي تنتشر داخل الجينوم من خلال "نسخ ولصق" آلية retrotransposition. وL1 الإنسان النموذجي هو ~ 6 كيلو بايت طويلة ويتكون من 5'UTR (منطقة غير مترجمة) التي هي بمثابة المروج، إطارين القراءة المفتوحة (ORFS): L1 -ORF1 وL1 -ORF2، و3'UTR مع بوليا . ذيل L1 البروتين -ORF1 ثلاثة مجالات مختلفة هي: مجال لفائف لفائف، RNA الاعتراف الحافز ونطاق C-محطة، بينما بروتين L1 -ORF2 ديه نوكلياز داخلية، عكس الناسخ والسيستين المجالات الغنية 1،2،3،4،5. L1 -ORF1 يسلك أنشطة حمض كوصي النووية، في حين يوفر L1 -ORF2 الأنشطة الإنزيمية، مع كل من البروتينات اللازمة لretrotransposition 1،2،6.

دورة من L1 retrotransposition يبدأ النسخ من 5'UTR من L1 مرنا bicistronic التي كتبها RNA البلمرة الثاني، النبات إلى السيتوبلازم، والترجمة. في السيتوبلازم، L1 -ORF1 المعارض إما -binding رابطة الدول المستقلة حيث حزم RNA الخاص بها أو -binding العابرة حيث حزم الرنا الأخرى (أي، جيب / SVAS / الكاذبة) لتشكيل الجسيمات بروتين نووي ريبوزي (RNP) مع L1 -ORF2p 7، 8. RNPs نقل من داخل النواة حيث النشاط نوكلياز داخلية من النكات L1 -ORF2p الحمض النووي الجيني (gDNA) للكشف على OH - مجموعة 9، التي هي بدورها تستخدم من قبل الناسخ العكسي لرئيس الوزراء وعكس توليف الحمض النووي الريبي على الحمض النووي من نهاية 3 '. خلال التوليف العكسي، ورصدت في الشق الثاني من الحمض النووي 7-20 سنة مضت من موقع نيك الأصلي لإنشاء فواصل متداخلة التي تمتلئ لتشكيل توقيع تسلسل L1 الإدراج (على سبيل المثال، TTTTAA) دعا الازدواجية الموقع المستهدف (TSD) 9،10. وتعرف هذه العملية باسم هدفا رئيسيا عكس النسخ (TPRT) ويؤدي إلى insertiعلى النسخ الكاملة أو اقتطاع من L1 / السلطات الوطنية المعينة الأخرى مع TSDs على طرفي تسلسل المدرجة. كما ثبت L1 retrotransposition أن تتم من خلال TPRT مثل غير المتجانسة نهاية الانضمام في بعض الخلايا أنواع 11.

متجه L1 retrotransposition العاملين في دراستنا هو غير episomal ويتكون من الموسومة L1 -ORF1 و2P يقودها المروجين-CMV L1-5'UTR جنبا إلى جنب (الشكل 1) 12. وقد وصفت الإصدارات السابقة من هذا البناء في الدراسات التي تستخدم الخميرة والثقافات الخلية البشرية 13،14،15. اثنين من المروجين CMV متميز يقع في 5 'و 3' تنتهي من ناقلات، مع نهاية 3 'وضعت في اتجاه عكسي لدفع التعبير من النيوميسين بعد الربط والتكامل. الكاسيت مؤشر retrotransposition في نهاية 3 'يتكون من الجين إدراج العقاقير بالنيوميسين إلى L1 -ORFs وتقديم نشط من فصل إلى نصفين بواسطة غلوبفي إنترون مع الجهات المانحة تقسم (SD) ومواقع تقسم متقبل (SA) (الشكل 1). على الاندماج في كروموسوم، وكتب L1 من المروج مشترك لإنتاج الرنا المرسال الذي يتكون من مرنا bicistronic ومرنا بالنيوميسين غير نشط. أثناء معالجة RNA، وتقسم على إنترون الغلوبين من الجين بالنيوميسين لاستعادة جين بالنيوميسين تعمل بكامل طاقتها. يتم حزم مرنا الهجين في الأداء الملاحي المطلوب في رابطة الدول المستقلة وtranslocated الى نواة حيث يتم دمجها في الجينوم إما كامل طول أو اقتطاع الإدراج باستخدام TPRT.

نحن هنا وصف المنهجية التي تستخدم مضان في الموقع التهجين (FISH) مع تحقيقات موجهة تحديدا في الجين بالنيوميسين تقسم (SNeo) لتتبع أنماط -retrotransposiition L1 ومعدلات الإدراج في مستوى نواة واحدة. وأكد كفاءة وخصوصية كشف باستخدام retrotransposition المختصة وبنيات غير كفء وتحقيقات لديتإلخ SNeo أو النيومايسين وغلوبين إنترون تقاطع 16. حسابات هذه المنهجية لبعض من أوجه القصور في المقايسات retrotransposition ثقافة خلية مقرها، مثل الإدراج متعددة، ومقاومة مستعمرة والتوسع استنساخ مواتية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. يرجى الرجوع إلى قسم الكواشف حصول على تفاصيل حول كيفية تحضير الكواشف الفردية.

1. التعريف L1 تحقيقات

ملاحظة: المسابر يمكن أن توصف بوصف الكيميائي أو PCR.

  1. وضع العلامات الكيميائية
    1. جعل جل الاغاروز 0،7-1٪ في تريس، خلات-EDTA (تاي) العازلة، الحرارة في الميكروويف حتى يذوب، والسماح للهلام لتبرد ثم قم بإضافة إيثيديوم بروميد (0.5 ميكروغرام / مل). تصب في صينية هلام، إضافة أمشاط، والسماح للهلام ليصلب في درجة حرارة الغرفة.
    2. تسمية التحقيق SNeo (1-2 ميكروغرام) مع CY3 أو FITC عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: SNeo يدل على S pliced ​​الجدد الجينات mycin أعرب بعد دورة كاملة من retrotransposition. وهذا التحقيق هو ~ 1000 BP في الحجم. SNeo يمكن PCR تضخيمها من أي ناقل أو من genomجيم الحمض النووي. انظر الجدول المواد والكواشف لمعلومات عن Streptavidin-CY3 / FITC الكواشف وضع العلامات.
    3. خلط SNeo حل المسبار المسمى العازلة مع 1X الحمض النووي تحميل، تحميل في كل بئر وتشغيلها في 75-100 فولت لمدة 15-20 دقيقة.
    4. تصور الفرقة التحقيق باستخدام-الأشعة فوق البنفسجية (UV) المنور. لاحظ أن حجم التحقيق SNeo يمكن تعديلها وقفل نوى حمض (LNA) ويمكن أيضا أن تضاف (الشكل 2).
    5. قطع صفت SNeo المسبار من هلام بشفرة نظيفة، إذابة وتنقية التحقيق SNeo من الجل باستخدام مجموعة PCR تنظيف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      تنبيه: تغطية كل جزء المكشوفة من الجسم مع الدروع الواقية (أي، معاطف المختبر والأشعة فوق البنفسجية واضح قناع الوجه) عند عرض وقطع هلام. انظر الجدول من المواد والكواشف للمعلومات إلى هلام تنقية المنتجات PCR.
    6. إعادة تشغيل 5 ميكرولتر من SNeo صفت التحقيق مع SNeo التحقيق وصفت الامم المتحدة على هلام الاغاروز 0.7٪ (انظر 1.1.1) لخداعزيادة حجم الشركة وفقدان كثافة إشارة (الشكل 2).
    7. تحديد كمية وصفت التحقيق SNeo عن طريق قياس الامتصاصية في 260 نانومتر، وتمييع التحقيق SNeo إلى 10 نانوغرام / مكل في نوكلياز H مجانا 2 O. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية.
  2. PCR وصفها (طريقة بديلة لوضع العلامات التحقيق)
    1. الجمع بين SNeo الاشعال محددة (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 "و 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3 ') مع الكواشف PCR في أنبوب واحد: 13.6 ميكرولتر نوكلياز مجانا H 2 O؛ 0.1 dATP ميكرولتر، dCTP، dGTP (10 نانومتر)؛ 0.05 ميكرولتر dTTP (10 نانومتر)؛ 0.05 ميكرولتر dUTP البيوتين / dUTP-FITC / CY3 (10 نانومتر)؛ 4 ميكرولتر العودة الكلمات الدلالية 5X العازلة؛ 0.4 ميكرولتر العودة الكلمات الدلالية البلمرة. قالب SNeo 1 ميكرولتر (10 نانوغرام). انظر الجدول المواد والكواشف لمعلومات عن الكواشف PCR.
    2. ضبط كمية من كل كاشف عن طريق ضرب من قبل عدد من العينات.
    3. استخدام المعلمة الدراجات PCR التاليةالصورة لتضخيم والتسمية SNeo تحقيقات: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 62 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
      ملاحظة: درجة الحرارة الصلب يمكن تعديلها أو يمكن الانتهاء التدرج PCR لتحديد درجات الحرارة الصلب المثلى لتحقيقات أخرى.
    4. جعل جل 0،7-1٪ كما في القسم 1.1.1، تحميل ووضع تصور لفرقة التحقيق كما هو الحال في القسم 1.1.4.
    5. قطع وتنقية SNeo التحقيق المسمى كما هو الحال في القسم 1.1.5.
    6. إعادة تشغيل 5 ميكرولتر من SNeo صفت التحقيق مع المسمى الامم المتحدة SNeo التحقيق لتأكيد زيادة حجم وفقدان كثافة إشارة (انظر الشكل 2).
    7. تحديد كمية وصفت التحقيق SNeo التي كتبها الامتصاصية قياس في 260 نانومتر، وتمييع SNeo التحقيق إلى 10 نانوغرام / مكل في نوكلياز H مجانا 2 O.

2. إعداد ينتشر كروموسوم

  1. توليد الحيوانات المستنسخة مستقرة التعبير عن ناقلات العمود الفقري (كنترولل) أو retrotransposition L1 المختصة باستخدام منهجيات اختيار القياسية. 12،16 بينما استخدمت للصحفيين غير episomal لربط النتائج مع دراسات من النسخ، ويمكن أيضا أن تستخدم ناقلات episomal. تنمو الخلايا معربا عن ستابلي السيطرة أو ناقل L1 (1 × 10 6 خلايا في 10 سم لوحة، مع تعديلات في حجم لوحة مصنوعة حسب الحاجة) في وسائل الاعلام النمو الكامل. لخلايا HepG2، استخدم RPMI-1600، و 10٪ FBS و 200 ميكروغرام / مل من هيغروميسين. تنمو الثقافات إلى 70٪ التقاء عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: إن اختيار المتوسطة النمو يعتمد على نوع من الخلايا. وبالنظر إلى أن البلازميدات المستخدمة هنا تحمل أشرطة اختيار كل من هيغروميسين والنيوميسين، ويمكن أيضا أن يتم اختيار مستقرة من الحيوانات المستنسخة مع النيومايسين بعد اختيارهم على هيغروميسين، ولكن المبلغ من النيوميسين يحتاج إلى أن يكون الأمثل لتحديد مستويات التسامح مع كل نوع من الخلايا.
  2. إضافة colcemid (0.4 ميكروغرام / مل) إلى مستنبت واحتضان لمدة 90 دقيقة لاعتقال الخلايا في metaphبورصة عمان. في حالة استخدام أنواع مختلفة من الخلايا، تحديد تركيز الأمثل للcolcemid ووقت التعرض (60، 90، و 120 دقيقة) لاعتقال الطورية الأمثل تجريبيا.
  3. غسل الخلايا 2X مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X Dulbecco و(DPBS)، ويعرض للتريبسين بإضافة 3-5 مل من 0.25٪ التربسين حل للخلايا واحتضان لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا. تعطيل التربسين مع مبلغ مساو من وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FBS.
  4. الطرد المركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، ونضح المتوسطة من الخلية بيليه وغسل الخلايا مع DPBS. نضح كل DPBS، وترك 200 ميكرولتر من DPBS لاعادة تعليق الخلايا. يتم خلط ضمان الخلايا بشكل جيد وأن جميع كتل متفرقة. استخدام الخفقان أو pipetting لطيف لخلط وتفريق كتل وتجنب vortexing ل.
  5. إضافة 5 مل من محلول منخفض التوتر (أي 75 ملي بوكل) التي هي قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية قطرة من الحكمة في حين تناوب أنبوب 15 مل أفقيا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انظر الجدول المواد وReagenالخبر للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل حل ناقص التوتر.
  6. خلايا الطرد المركزي في 120 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وكرر الخطوات من 2،4-2،5 3X ترك ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول منخفض التوتر لاعادة تعليق الخلايا بعد كل غسل. ضمان أنه في نهاية 3 يغسل، بيليه الأبيض بشكل واضح ومنتفخة.
  7. إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من حل Carnoy تثبيتي، وجعل 1: 2، 1: 4، 1: 8، 01:16 التخفيفات في حل Carnoy مثبت. إسقاط 10 ميكرولتر من كل تخفيف على شريحة نظيفة وجافة من حوالي 1 سم فوق وفضح فورا الجانب خالية من انتشار لالبخار الساخن من الماء المغلي لمدة 30 ثانية. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية جعل حل Carnoy مثبت.
  8. تجفيف فروق في درجة حرارة الغرفة، وصمة عار مع 0.1 ميكروغرام / مل هويشت-33342 عن طريق الغمر لمدة 15-20 دقيقة في Coplin جرة وغسل 3X مع DPBS. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية جعل حل هويشت-33342.
    9. <لى> مشاهدة ينتشر في مضان المجهر / المرحلة على النقيض في 40X التكبير. بعد تحسين إعداد انتشار، ليس من الضروري أن تكون ملطخة ينتشر مع هويشت-33342. رأي ينتشر على المجهر مرحلة التباين في 10X التكبير لتحديد نوعية انتشار والانفصال كما هو موضح في قسم النتائج (انظر الشكل 3).
  9. اختيار ودائرة هوامش جيدة مع نقطة علامة الماس على الجانب الآخر من الشريحة (أي نشر خالية من الجانب).
  10. متجر ينتشر في -20 درجة مئوية لمدة تصل الى شهر واحد. تجنب التعرض للرطوبة.

3. الإسفار في الموقع التهجين (FISH)

  1. استقرار والتجفيف ينتشر
    ينتشر يوازن الطورية كروموسوم إلى درجة حرارة الغرفة إذا المخزنة في -20 ° C: ملاحظة. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل الكواشف.
    1. ينتشر احتضان كروموسوم الطورية مع 200 ميكرولتر ريبونوكلياز ألف ل1 ساعة على 37 درجة مئوية.
    2. غسل الشرائح العازلة-2X SSC مرتين لمدة 5 دقائق كل تليها الشطف مع 10 ملي حل حمض الهيدروكلوريك.
    3. احتضان ينتشر بنسبة 1٪ البيبسين لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وشطف مع H 2 O منزوع الأيونات ويغسل مرتين مع العازلة-2X SSC لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. احتضان ينتشر مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة ويغسل العازلة في SSC 2X مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    5. يذوى ينتشر عن طريق احتضان لمدة 2 دقيقة في سلسلة الايثانول: 70٪، 80٪، و 95٪ من الإيثانول.
    6. الشرائح الهواء الجاف.
  2. التهجين ينتشر مع L1 تحقيقات retrotransposition -labeled (أي SNeo)
    تنبيه: للتحقيقات مباشرة المسمى، والابتعاد عن الضوء في جميع الأوقات. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل الكواشف.
    1. إضافة 30 نانوغرام من SNeo إلى عازلة التهجين، الحرارة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وبارد لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة 30 ميكرولتر من SNeo حل التحقيق إلى البريدانتشار منظمة العمل ضد الجوع، وتغطي مع ساترة وختم حواف مع الاسمنت والمطاط. ضمان عدم تشكيل فقاعة.
    3. حرارة الشريحة عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة الحرارة، وانخفاض تدريجي في درجات الحرارة إلى 37 درجة مئوية، واحتضان بين عشية وضحاها في غرفة ترطيب المظلمة عند 37 درجة مئوية.
  3. غسل وعرضها (أو إضافة الجسم المضاد الثانوي)
    تنبيه: للتحقيقات مباشرة المسمى، والابتعاد عن الضوء في جميع الأوقات.
    ملاحظة: انظر جدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية إعداد. يوصى باستخدام كمية كافية لتغطية انتشار كروموسوم كامل. تذكر أن حجم الفائض سوف تضيع عند إضافة ساترة.
    1. تزج الشرائح العازلة في SSC 2X لإزالة coverslips.
    2. غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن-2X SSC في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. غسل الشرائح عن طريق الغمر في غسل العازلة في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 2X.
    4. غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن SSC 0.1X في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    5. غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن SSC 2X في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: ضع جرة Coplin تحتوي عازلة الموصى بها في حمام مائي، وضبط درجة الحرارة إلى 45 درجة مئوية.
    6. الشرائح باردة لدرجة حرارة الغرفة ويوازن الشرائح العازلة في الكشف.
    7. لتحقيقات المسمى مباشرة، انتقل إلى الخطوة 3.4.10.
    8. لتحقيقات المسمى غير المباشرة، كتلة في عرقلة العازلة لمدة 20-30 دقيقة ويغسل 3X في DPBS.
    9. احتضان مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، 5 ميكروغرام / مل streptavidin-FITC، أو αCY3 في عرقلة العازلة) لمدة 1 ساعة.
    10. غسل الشرائح في 2X SSC لمدة 5 دقائق مرتين.
    11. مباين مع هويشت-33342 حل (0.1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: يتم ذلك تلطيخ وصمة عار الكروموسومات للمشاركة في توطين مع التحقيق.
    12. يغسل في DPBS 3X، إضافة قطرة من المتوسطة المتزايدة، وضع ساترة وختم حواف مع طلاء الأظافر.
    13. تحليل L1 retrotransposition باستخدام المجهر مضان في 40X أماهgnification.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد رسم تخطيطي للناقلات retrotransposition L1 في الشكل 1. ويتكون ناقل الجين بالنيوميسين في اتجاه مضاد لL1 ORFS التي تقطعها إنترون الغلوبين في توجيه معنى وتقع بواسطة SD والمواقع SA. عند دمجها بشكل مستقر في كروموسوم، وكتب L1 مرنا من CMV جنبا إلى جنب والمروج L1-5'UTR (الشكل 1). أثناء معالجة RNA، وتقسم على إنترون الغلوبين من الجين بالنيوميسين. يتم حزم الجدد L1 RNA، translocated ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد تم توظيف منهجيات مثل تسلسل الجينوم بأكمله، معكوس PCR والنشاف جنوب لدراسة L1 retrotransposition. على الرغم من أن هذه المنهجيات هي قيمة للغاية في تحديد مكان وقوع الإدراج L1 داخل الجينوم، تحديا الخلط لجميع من لهم هو الحاجة إلى برمجة في سيليكون لإعادة تجميع متواليات. تم تصميم منهجية الأسماك وصفها هنا لتكمل هذه الطرق، خاصة في حالة الدراسات التي تتطلب تحليلات خارج الرحم retrotransposition L1 في الخلايا المستزرعة. النهج يمكن أن تستخدم في كل من التق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المحتملة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (ES014443 و ES017274) و AstraZeneca إلى KSR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجموعة أدوات وضع العلامات Kit PCR يمكن مضان الغسيل التهجين للكشف
<قوي> مجسات الملصق< / قوي>
اذهب علامة DNA polymerasePromegaM3178
GO Tag 10x عازلة عديمة اللونPromegaM3178
Individual dNTPSigmaDNTP10ضبط تركيز dATP ، dGTP ، dCTP إلى 2 & nbsp ؛ mM و dTTP إلى 1.5   ؛ ملي مولار في الماء الخالي من النوكلياز.
dUTP-16-Biotin (0.5   م)روش11093070910
dUTP-FITC (0.5   ؛ م)Thermo ScientificR0101
dUTP-CY3 (0.5   ؛ م)على الأسماك من سيجماGEPA53022
MIRUSMIR3625
MIRUS FISHMIRUSMIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up Kit   ؛Qiagen1410/0030يمكن استخدام أي كاشف نظيف PCR بدلا من NucleoSpin PCR Clean Up
Kit آلةاستخدام أي آلة Thermocycler لتضخيم منتج الملصق.
AgaroseSigmaA9539
<قوي> تحضير انتشارات الكروموسوم< / قوي>
ColcemidLife Technologies 15212-012إضافة Colcemid مباشرة إلى وسائط النمو إلى تركيز نهائي قدره 0.4  ومايكرو. جم / مل
1   ؛ M KClSigmaP9541تمييع 1   ؛ حل M KCl إلى 75 & nbsp; محلول ملي مولار لصنع محلول منخفض التوتر
محلول كارنوي المثبتامزج 3 كميات من الميثانول و 1 حجم من حمض الأسيتيك لصنع محلول كارنوي المثبت. اجعلها طازجة في كل مرة.
الميثانولسيجما322415
حمض الخليكسيجما320099
Hoechst-33342Thermo Scientific62249يذوب Hoechst-33342 في PBS إلى التركيز النهائي ل 1 & nbsp ؛ ملغ/مل.
دايموند بوينت ماركرثيرمو سيانتيفيك750
بلوستيد سلايدزثيرمو ساینتيف2951-001
تربسين-EDTA (0.25٪)لايف تكنولوجيز R001100لإزالة تقنية الخلايا ، احتضان الخلية في التربسين لمدة 5 دقائق وغير نشطة بحجم متساو من الوسائط الكاملة.
شرائح الغطاءVWR48366067
Coplin JarsThermo Scientific107
Heat Block يمكناستخدام أي كتلة حرارية لهذا الغرض ، على الرغم من أنه يوصى باستخدام الكتل المجهزة لشرائح التدفئة.
دورق (600  مل)سيجماCLS1003600املأ الدورق بالماء ، سخنه حتى يغلي ، استخدم البخار الساخن لتفجير الكروموسومات.
نيكون المجهرنيكون125690يمكن استخدام أي مجهر للنظر في جودة الانتشار.
<قوي>كواشف ومواد للأسماك < / قوية >
ثلاثي الصوديوم ستراتسيجماS1804
كرورايد الصوديومسيجماS3014
فورماميدسيجماF9037
توين -20سيجماF1379
كبريتات ديترانسيجماD8906
SDSسيجماL3771
سمك السلمون المنوية الحمضالنووي تقنيات الحياة 15632-011
ألبومين مصل البقر (BSA)سيجماA8531
حمض الهيدروكلوريك (N)سيجما38283
الكحول الإيثيليسيجما459844
الميثانولسيجما322415
DPBSLife Technologies 14190-250
هيدروكسيد الصوديومسيجماS8045
رناز AسيجماR4642
بيبسينسيجماP6887
بارافورمالدهيد (PFA)سيجماP6148
Hoechst-33342Thermo Scientific62249إذابة Hoechst-33342 في PBS إلى التركيز النهائي ل 1 & nbsp ؛ ملغ/مل.
الأسمنت المطاطي / Cytobond مانع التسرب 2020-00-1
سبع برطمانات كوبلينThermo Scientific107
غرفة رطبة داكنةSigmaCLS2551
الشرائح الشرائحVWR48366067
كتلة حرارية رقمية جافةVWR13259
مجهر
20x سترات الصوديوم المالحة (20x SSC)يمزج 175 جم من كلوريد الصوديوم ، و 88.2   ؛ ز من سترات ثلاثي الصوديوم مع 800 مل من الدرجة الجزيئية H2< / sub>O. يقلب أثناء الضبط على الرقم الهيدروجيني 7. بمجرد أن تذوب جميع الأملاح ، اضبط الحجم على 1 لتر وقم بالتصفية من خلال 0.22 & م ورق تصفية. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
1  ملغ / مل من Rnase Aيخفف 20x SSC buffer إلى 2x SSC buffer. قم بإذابة RNase A في 2x SSC buffer إلى تركيز نهائي 1 & nbsp ؛ ملغ/مل. اصنع حلا جديدا في كل مرة.
1٪ بيبسينقم بإذابة البيبسين (W / V) في 10 ملي مولار حمض الهيدروكلوريك إلى تركيز نهائي من محلول 1٪. اجعلها طازجة في كل مرة.
4٪ بارافورمالدهيد (4٪ PFA)وزن4.0 غرام من PFA في غطاء الدخان ، أضف 50 مل من 1xPBS ، سخن إلى 60 & nbsp ؛ ° C أثناء التقليب وضبط الرقم الهيدروجيني بقطرات من هيدروكسيد الصوديوم حتى يذوب كل PFA ويصبح المحلول صافيا. اضبط مستوى الصوت على 100   ؛ مل ، تصفية من خلال 0.22 وميكرو ؛ م ورق الترشيح وتخزين 5 مل من الكميات عند -20   ؛ °C. ذوبان الجليد من PFA عند 37° C لمدة 10-15 دقيقة للاستخدامات اللاحقة. اضبط حجم الفلتر حسب كمية بارافورمالدهايد.
عازلةامزج 100 مل من الفورماميد (20٪) مع 2.5 مل من 20x SSC ، واضبط على الرقم الهيدروجيني 7 مع 1.0 M HCl وارفع الحجم إلى 500 مل مع H2< / sub>O.
عازلةاجمع بين 50٪ فورماميد ، و 10٪ كبريتات ديكستران ، و 0.1٪ SDS ، و 300 نانوغرام / مل من الحمض النووي للحيوانات المنوية من سمك السلمون في 2x SSC عازلة. تحدد كمية الفورماميد مدى تركيز الكروماتيدات. معايرة الكمية.
المخزن المؤقتيخفف 20x SSC المؤقت إلى 4x وإضافة 0.2٪ Tween-20 لإنشاء مخزن مؤقت للكشف.
المخزن المؤقتالمانع اجمع بين 5٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) مع 0.2٪ Tween-20 في 4x SSC buffer.
محلول تجفيف يصنع70٪ و 80٪ و 95٪ من محاليل الإيثانول.

المراجع

  1. Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
  2. Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
  3. Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
  4. Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
  5. Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
  6. Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
  7. Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
  8. Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
  9. Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
  10. Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
  11. Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
  12. Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
  13. Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
  14. Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
  15. Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
  16. Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
  17. Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
  18. Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
  19. Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
  20. Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
  21. Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
  22. McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
  23. Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
  24. Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
  25. Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التهجين الموضعي المتألقتحليل النواة المفردةخلايا HepG2وسم مسبار SNeoفروقات الكروموسومات في الطور الاستوائيمسابير FITC وCY3المعالجة بالمحلول ناقص التوترطريقة مثبت كارنويوسط تثبيت DAPI
تحليل الخط-1 Retrotransposition في واحدة نواة مستوى
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.