العلاجات الفيروسية الحالة للأورام قيد التطوير كعلاجات جديدة لعلاج سرطان الخلايا الكبدية (HCC). نصف هنا طريقة للعلاج الموضعي لسرطان الكبد عن طريق إعطاء الشرايين الكبدية للفيروس حال للأورام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إدارة Transarterial من حال الورم فيروسات للعلاج العلاج الموضعي من مثلي HCC في الجرذان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو مرض ذو خيارات علاجية محدودة وتشخيص ضعيف. في السنوات الأخيرة ، أثبتت العلاجات الفيروسية الحالة للأورام أنها أدوات قوية محتملة لمحاربة الأورام الخبيثة. نظرا لإمدادات الدم المزدوجة الفريدة في الكبد ، من الممكن تطبيق العلاجات محليا على أورام الكبد التقويمية ، والتي يتم تغذيتها في الغالب عن طريق تدفق الدم الشرياني. لقد أثبتنا سابقا أن توصيل الشرايين الكبدية للفيروسات الحالة للأورام يؤدي إلى كفاءة نقل آمنة وفعالة لآفات سرطان الكبد متعددة البؤر ، مما يؤدي إلى إطالة كبيرة في البقاء على قيد الحياة في الفئران المؤهلة للمناعة. يحاكي هذا الإجراء عن كثب تطبيق الانصمام عبر الشرايين في المرضى ، وهو الرعاية التلطيفية القياسية المقدمة للعديد من مرضى سرطان الكبد. تسمح القدرة على إدارة علاجات الأورام من خلال الشريان الكبدي في الفئران بنموذج ما قبل السريري المتطور للغاية لتقييم النواقل الفيروسية الجديدة قيد التطوير. نصف هنا البروتوكول التفصيلي للتشريح المجهري للشريان الكبدي لتسريب ناقلات الفيروس حال للأورام لعلاج سرطان الكبد التقويمي.
المقدمة
سرطان الكبد (HCC) هو خامس أكثر السرطانات انتشارا في جميع أنحاء العالم، والسبب الرئيسي الثالث للوفاة المتصلة بالسرطان، مما يجعله مشكلة صحية كبيرة 1،2. بالنسبة للمرضى الذين ليسوا مؤهلين لاستئصال الورم، أو أولئك الذين ينتظرون زرع الكبد، والعلاج الموضعي تنطوي الانصمام transarterial (تاي) أو chemoembolization transarterial (TACE) يتم تطبيقها عن الرعاية الملطفة القياسية 3،4. هذه العلاجات تستغل ميزة فريدة من إمدادات الدم المزدوج في الكبد حيث يتم تغذية الأورام بشكل حصري تقريبا من كبدي تدفق الدم في الشرايين، بينما يتلقى الكبد المحيطة بها معظم إمدادات الدم من الوريد البابي 5،6.
ويرجع ذلك إلى كفاءات محدودة للغاية من العلاجات التي أنشئت لسرطان الكبد، ظهرت فيروسات حال الورم كما العلاجات البديلة واعدة. JX-594، والتي سميت مؤخرا Pexa-مركزنا، هو الثيميدين-حذف كيناز ناقلات اللقاحية المسلحة مع محببة متحفيز مستعمرة acrophage عامل (GM-CSF)، التي أكملت المرحلة الثانية من التجارب السريرية لسرطان الكبد 7. وفي الآونة الأخيرة، وهو حويصلي ناقلات فيروس التهاب الفم المؤتلف (VSV) معربا عن الإنسان الانترفيرون بيتا قد دخل مرحلة الاولى من التجارب السريرية لHCC-سورافينيب الحرارية (NCT01628640). كما الفيروسات حال الورم الاقتراب من الحصول على الموافقة على التطبيق السريري لسرطان الكبد في المرضى، والحاجة لطريق إدارة فعالة لاستهداف أمراض متعددة البؤر هو واضح. في حين تسليم النظامية غير فعالة إلى حد كبير بسبب تنبيغ الورم غير فعالة، يمكن أن التطبيقات intratumoral تحد من فعالية العلاج من الأورام حقن، وترك آفات مجهرية uninjectable عرضة لتطور المرض.
أنشأنا وسيلة لعزل الشريان الكبدي في الفئران لإدارة العلاج الفيروس حال الورم بطريقة الموضعي لاستهداف HCC مثلي. لقد أثبتنا أن هذا الطريق الإدارة النتائج في آمنة وeffectiلقد تنبيغ العقيدات HCC متعددة البؤر، مما أدى إلى إطالة أمد بقاء كبير في الفئران المختصة المناعي 8-10. هنا، نحن تصف طريقة الوصول، تشريح، وحقنه في الشريان الكبدي في الفئران. ويرد مخطط الإجراء في الشكل 1 (نشرت سابقا 9)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات التالية وفقا للمبادئ التوجيهية لمؤسستنا والحكومة المحلية في بافاريا، ألمانيا. ويجب بذل كل المحاولات لإعادة إنتاج هذا البروتوكول في الالتزام مع المبادئ التوجيهية المحلية من أجل المعاملة الإنسانية للحيوانات، وفقا لما تمليه رعاية الحيوانات المحلية واللجنة الاستخدام. على سبيل المثال، تتطلب العديد من المعاهد التي قفازات معقمة يتم ارتداؤها أثناء الجراحة القوارض. وعلاوة على ذلك، والعمل مع الفيروسات يجب أن يؤديها وفقا للقوانين المحلية، مع الحرص على سلامتهم الشخصية والبيئية. يجب الحرص على التخلص السليم من النفايات الملوثة ولتنظيف الأدوات ومساحة العمل (أي عن طريق التعقيم والتنظيف مع مطهر مضاد للفيروسات المناسب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة).
1. الاستعدادات قبل بداية جراحة
- تعقيم الأدوات الجراحية (أي قبل التعقيم).
- تمييع الفيروس إلى approprتركيز iate، والتي سوف تختلف اعتمادا على سمية فيروس معين المستخدمة وحساسية من سلالة الفئران.
ملاحظة: على سبيل المثال، عند استخدام فيروس التهاب الفم الحويصلي في الفئران الجاموس الذكور، ونحن حقن عادة 10 7 PFU في حجم 1 مل، وهو الحد الأقصى التسامح الجرعة في هذا النموذج.- ملء مسبق فيروس (باستخدام تقنية العقيم) في 1 مل الحقن، ونعلق 30 الإبر G، مع الحرص على إزالة الهواء من المحاقن والإبر.
- إعداد الفضاء الجراحي مع جميع المواد والمعدات المطلوبة، ورش المنطقة مع الايثانول لتطهير. ملء وعاء صغير مع محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم) لتبليل مسحات الشاش وتطبيقها من القطن ذات الرؤوس.
2. إعداد الجرذ
- إدارة مسكن (كما هو محدد من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المحلية)، في مناسبة جرعة 30 دقيقة قبل البدء في إجراء العمليات الجراحية. فمثلا،إدارة جرعة عالية من ميتاميزول (100-200 ملغ / كلغ).
- تخدير الفئران باستخدام استنشاق (الأيزوفلورين) أو عن طريق الحقن (أي خليط من Medetomidine (0.15 ملغ / كلغ)، ميدازولام (2 ملغ / كلغ)، والفنتانيل (0.005 ملغ / كلغ)، المعروف أيضا باسم MMF) التخدير. إدارة isolflurane من خلال المرذاذ في 1-3٪ وتعديل عند الضرورة للحفاظ على التنفس الطبيعي ومعدل ضربات القلب.
- قبل المتابعة، تأكد من أن الفئران تم مخدرا تماما وغير قادر على الشعور بالألم عن طريق معسر لوحة القدم ومراقبة لرد فعل.
- تطبيق مرهم العين البيطرية لمنع جفاف أثناء التخدير.
- حلق منطقة البطن من القص إلى أسفل إلى ما فوق الأعضاء التناسلية باستخدام صغير البيطري الشعر مجز. الحرص على تحقيق حلاقة قريبة دون إصابة الجلد.
- إصلاح الفئران على السرير الجراحي باستخدام الشريط على fore- وhindlimbs، وإذا كان استخدام التخدير عن طريق الاستنشاق، ضع خطم في مخروط الأنف مناسب الحجم. وضع وسادة التدفئةتحت الفئران للحفاظ على درجة حرارة الجسم. تطهير منطقة البطن باستخدام مطهر الجراحية الصف، تليها شطف الكحول وتطبيق والطلاء مطهر.
3. البطن
- باستخدام مشرط المنحني صغيرة، مثل رقم 15، وجعل شق صغير الرأسي في طبقة الجلد مباشرة على طول خط الوسط. تمديد شق وصولا إلى عملية سيفي الشكل. بعد ذلك، شق طبقة العضلات عن طريق رفع بلطف صعودا مع زوج من ملقط أدسون إلى إجراء شق مشرط، ومن ثم توسيع شق وصولا إلى عملية سيفي الشكل مع مقص جراحي. الحرص على عدم ثقب أجهزة تجويف البطن أو تضر السفن الصغيرة على جانبي عملية سيفي الشكل.
- وضع ضام عبر البطن لنشر العضلات والجلد وفضح منطقة البطن بأكملها.
- بلل اثنين من 7.5 × 7.5 سم 2 مسحات الشاش مع محلول فسيولوجي معقم ونشر واحدة عبر الجزء العلوي من العمليات الجراحيةفتح واحدة عبر الجزء السفلي، كما هو مبين في الشكل 2A.
4. عزل الشريان الكبدي
- باستخدام اثنين من القطن مبللة مسحات قضيب مبللة بمحلول ملحي الفسيولوجية العقيمة، ورفع بلطف الأمعاء والأعور من تجويف البطن، ووضعها على أقل مسحة الشاش. طي الشاش فوق للحفاظ على أجهزة رطبة وتحميلهم للخروج من الطريق.
- باستخدام اثنين مبلل قطعة قطن قضيب، ورفع بلطف صعودا اليسار الفص الجانبي الكبد، والتي سوف يكون الفص الأكثر السائد في الرأي في هذه المرحلة. الوجه الفص صعودا، و، باستخدام زوج من مقص صغير الربيع، وقطع من خلال غشاء ليفي على الجانب السفلي من الفص، والسماح للالفص إلى أن انقلبت تماما صعودا والراحة على رأس المسحة الشاش وضعت سابقا. أضعاف المسحة الشاش على الفص ليثبت في مكانه.
- تواصل مع الفص التالي (المذنبة الأمامي)، وهو الآن الفص الأمامي أكثر في الرأي. مع المساعدات (ه) من مجهر تشريح وملقط غرامة، تشريح الغشاء الرقيق الذي يحيط الفص من أجل الإفراج عنها والسماح لها أن انقلبت بحرية صعودا. وضع الفص تحت المسحة الشاش مع الفص الجانبي الأيسر.
- لاحظ الفص الخلفي المذنبة، والتي سوف تكون الآن مرئية. كرر الخطوة 4.3 لتشريح تماما الخلفي المذنبة الفص والوجه لأعلى وداخل الشاش مع فصوص الكبد وضعت سابقا.
- فقط تحت موقف الأصلي للالفص المذنب، والعثور على الشريان الكبدي شيوعا، والتي سوف الآن أن تكون واضحة ومعترف بها بسهولة بواسطة نبض قوي. بعد الشريان إلى اليمين التشريحية، ومراقبة المواد غشائي سميك يحجب الشرايين الكبدية للمعدة والسليم عن الأنظار. باستخدام ملقط غرامة، وترفع هذه المواد المسيل للدموع وبرفق، مع الحرص على تجنب أي السفن الصغيرة في هذا المجال. استخدام قطعة قطن قضيب لوقف أي نزيف التي قد تحدث.
- تحديد موقع لفروع rterial، والتي سوف تكون مرئية بشكل واضح مع المعونة من مجهر تشريح عندما يتم تشريح الأغشية بشكل صحيح.
- باستخدام اثنين من غرامة، ملقط ارضحي، تشريح بعناية الشريان الكبدي شائع، الشريان معدي، والشريان الكبدي السليم بحيث أنها تحررت من الأغشية المحيطة بها (الشكل 2B).
5. إعداد شريان للحقن
- تمرير 7-0 البرولين خياطة تحت الشريان معدي، واستخدام الإبر حامل الجزئي لربط ربطة دائم في نهاية البعيدة، فقط فوق التشعب (انظر الشكل رقم 1 لتحديد المكان المناسب). السماح حوالي 2 بوصة من مواد خياطة الجروح المتبقية على الغايات، والمشبك لهم مع حامل إبرة لسحب الشريان تدريسها، كما في الشكل 2C.
- وضع المشبك صغير على الشريان الكبدي شيوعا لمنع تدفق الدم بشكل مؤقت (الشكل 2C).
ملاحظة: هذا هو عفريتortant لمنع نزيف حاد مرة واحدة تتم إزالة الإبرة من الشريان. وعلاوة على ذلك، فإن انسداد تدفق الدم في الشرايين تسمح للإدارة فيروس أبطأ وأفضل كفاءة ترنسدوكأيشن.- هام: العمل بسرعة للحد من مقدار الوقت الذي تدفق الدم يتم إيقاف - إجراء حقن وربط لاحق من الشريان خلال 5 دقائق من تحامل الشريان الكبدي.
- إذا كان ذلك ممكنا، وزيادة التكبير على المجهر تشريح، بحيث الشريان معدي هو في التركيز الحاد ويبدو كبيرا بما يكفي لادخال بدقة إبرة G 30. وضع إبرة حقن حقنة في تجويف الشريان معدي ودفع ببطء على المكبس.
ملاحظة: سوف التنسيب المناسب للإبرة يؤدي إلى حل يحقن تتدفق مباشرة عن طريق الشريان الكبدي السليم ونحو الكبد.- إجراء الحقن ببطء شديد لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة تنبيغ.
<لى> وبمجرد تدار حجم الحقن بأكمله، يتراجع ببطء الإبرة من الشريان.
ملاحظة: يجب أن يكون هناك نزيف من موقع الحقن. في حالة أن النزيف لا يحدث ذلك، فإنه يشير إلى أن المشبك لا وضعها بشكل صحيح ويجب تعديلها بسرعة.
6. الإنتهاء
- تمرير الثانية 7-0 البرولين خياطة تحت الشريان معدي، وربطة عنق ربطة دائم الثاني فوق موقع الحقن.
- إزالة المشبك من الشريان الكبدي. تأكد من أن تدفق الدم خلال الشريان الكبدي السليم نحو الكبد وقد تم تجديده.
- قطع المغفلة من الأربطة.
- تأكد من عدم وجود نزيف قبل أن تعود الأمعاء والكبد لتجويف البطن. الحرص على أن يتم إرجاع التذييل في اتجاه الأصلي الخاص به.
- خياطة العضلات والجلد في طبقات منفصلة باستخدام 4-0 vicryl مواد خياطة الجروح مع إبرة منحنية. مكان continuouالصورة الغرز حوالي 1 ملم، وبصرف النظر سحب بإحكام.
- خلال المرحلة خياطة وإدارة مسكن مثل البوبرينورفين (0.05 ملغ / كلغ).
- إزالة الفئران من التخدير. إذا تم استخدام الأيزوفلورين، ينبغي أن الفئران استعادة وعيه في غضون عدة دقائق. إذا استخدمت MMF بمثابة التخدير عن طريق الحقن، يعادي مع الحقن تحت الجلد من Atipamezole (0.75 ملغ / كلغ)، فلومازينيل (0.2 ملغ / كلغ)، ونالوكسون (9.12 ملغ / كلغ)، والتي سوف عكس آثار التخدير والسماح للحيوانات لاستعادة وعيه في غضون 20 دقيقة. حافظ على الفئران دافئة مع مصباح ارتفاع درجة حرارة الأشعة تحت الحمراء في مرحلة الصحوة الأولية.
- لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
- لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
- مراقبة الفئران بعد العملية عن علامات مرضية الشدة، وما تبعهمع المسكنات على النحو المطلوب من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المحلية. على سبيل المثال، البوبرينورفين يمكن أن تدار على 0.05 ملغ / كغ كل 12 ساعة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مع الخبرة، ونسبة نجاح ما يقرب من 100٪ (وهذا يعني أن الشرايين وتشريح بنجاح وحقن، ونجا من الحيوانات الجراحة) لا يمكن أن يتحقق. ومع ذلك، فإن الحالة الصحية للفأر قبل الجراحة (درجة عبء الورم، الكامنة وراء وظيفة الكبد، وغيرها) من الواضح أن تلعب دورا في نتائج التدخل الجراحي. بعد الجراحة، ومن المتوقع أن تواجه فقدان الوزن عابرة وخفيفة، والارتفاع عابرة انزيمات الكبد، حتى لو العازلة وحدها، دون الفيروس، تم حقن الفئران.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من أن الحقن المباشر داخل الورم هو بلا شك أبسط طريقة تؤدي إلى نقل الورم بكفاءة لعقيدة ورم واحدة ، إلا أن التسريب الشرياني الكبدي يمثل طريقا مثاليا للإدارة لاستهداف سرطان الكبد متعدد البؤر وتقويم العظام. أثبتت هذه الطريقة أنها آمنة وفعالة لعلاج سرطان الكبد في الفئران المختصة بالمناعة مع فيروسات حال الأورام. علاوة على ذلك ، نظرا لأن مرضى سرطان الكبد يعالجون بشكل روتيني عن طريق تطبيق الانصمام الكيميائي عبر الشرايين ، فإن الطريقة الموضحة هنا يمكن ترجمتها بسهولة إلى بيئة سريرية.
من العيو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
هذا العمل مدعوم من قبل المشروعين الفرعيين SFB 824 C6 و C7 (DFG Sonderforschungsbereich 824) ، مؤسسة الأبحاث الألمانية ، بون ، ألمانيا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المقص البيطري | Aesculap | GT415 | ماكينة حلاقة صغيرة لاسلكية مثالية لإزالة الفراء من منطقة الجراحة |
| مجهر مجسم | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G إبر | براون | 4656300 | 30 G x ½ ؛ " |
| 1 مل محاقن | براون | 9161406V | حقنة توبركولين |
| ريشة مشرط يمكن التخلص منها | 2975 # 15 | # 15 شفرة ؛ | |
| مقص جراحي قياسي | أدوات العلوم الدقيقة | 14001-13 | حاد / حاد ، لفتح الجلد والعضلات |
| أدوات العلوم الدقيقة من ملقط Adson | 1101-12 | مع الأسنان ، لاستيعاب الجلد والعضلات | |
| ضام Alm | أدوات العلوم الدقيقة | 17008-07 | بأسنان حادة ، لنشر تجويف البطن المفتوح أثناء الجراحة |
| مسحات الشاش | Lohmann & amp Rauscher | 18504 | 7.5 سم × 7.5 سم ، يجب تعقيمها قبل استخدام |
| مسحات قضيب برأس قطني | Lohmann & amp Rauscher | 11970 | المعقمة |
| الرؤوس | الدقيقة 11063-07 | 0.4 مم ، طرف بزاوية ، لتشريح الشريان الكبدي | |
| مقص زنبركي Vannas | أدوات العلوم | الدقيقة 91500-09 | للقطع الدقيق |
| حامل إبرة دقيقة | أدوات العلوم | الدقيقة 12076-12 | لربط الشريان المعدي الاثني |
| حامل إبرة | أدوات العلوم الدقيقة | 12005-15 | فكوك كربيد التنجستن |
| 7-0 خيوط Prolene خيوط | Ethicon | 8648H | خياطة البولي بروبيلين بإبرة منحنية ، لربط الشريان المعدي الاثني |
| 4-0 خيوط فيكريل | Ethicon | V3040H | مع إبرة منحنية مرفقة |
| مصباح الاحترار بالأشعة تحت الحمراء | Beurer | IL11 | للحفاظ على درجة حرارة الجسم بعد الجراحة |
المراجع
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study. Science. 274, 740-743 (1996).
- Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Bruix, J., Sala, M., Llovet, J. M. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127, 179-188 (2004).
- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
- Breedis, C., Young, G. The blood supply of neoplasms in the liver. Am J Pathol. 30, 969-977 (1954).
- Nakashima, T., Kojiro, M. Pathologic characteristics of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis. 6, 259-266 (1986).
- Heo, J., et al. Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer. Nat Med. 19, 329-336 (2013).
- Altomonte, J., Marozin, S., Schmid, R. M., Ebert, O. Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma. Mol Ther. 18, 275-284 (2010).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Kournioti, C., Tai, Y. S., Woo, S. L. Oncolysis of multifocal hepatocellular carcinoma in the rat liver by hepatic artery infusion of vesicular stomatitis virus. Mol Ther. 9, 368-376 (2004).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Woo, S. L. Eradication of advanced hepatocellular carcinoma in rats via repeated hepatic arterial infusions of recombinant VSV. Hepatology. 41, 196-203 (2005).
- Altomonte, J., et al. Synergistic antitumor effects of transarterial viroembolization for multifocal hepatocellular carcinoma in rats. Hepatology. 48, 1864-1873 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
