يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

علاج الفئران SCA1 مع للذوبان في الماء المركبات لغير وجه التحديد زيادة وظيفة الميتوكوندريا

10.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53758

⸱

يناير 22, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Skidmore College, 2Chemistry Department, Skidmore College, 3Health and Exercise Science Department, Skidmore College

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا كيميائيا حيويا وسلوكيا لتقييم فعالية المركبات القابلة للذوبان في الماء التي تستهدف الميتوكوندريا لعلاج الرنح الشوكي المخيخي من النوع 1 (SCA1) والأمراض التنكسية العصبية المخيخية الأخرى.

الملخص

ضعف الميتوكوندريا يلعب دورا هاما في عملية الشيخوخة والأمراض العصبية بما في ذلك عدة الرنح النخاعي المخيخي وراثية وغيرها من اضطرابات الحركة تميزت الضمور التدريجي من المخيخ. والهدف من هذا البروتوكول هو تقييم ضعف الميتوكوندريا في مخيخي شوكي نوع ترنح 1 (SCA1) وتقييم فعالية استهداف الدوائية التنفس الأيض عن طريق مركب حمض السكسينيك للذوبان في الماء لإبطاء تطور المرض. هذا النهج هو الذي ينطبق على أمراض المخيخ الأخرى، ويمكن أن تتكيف مع مجموعة من العلاجات للذوبان في الماء.

يستخدم خارج الجسم الحي تحليل التنفس الميتوكوندريا لكشف وتحديد التغيرات المرتبطة المرض في وظيفة الميتوكوندريا. مع الدليل الجيني الوراثي (بيانات غير منشورة) والأدلة البروتين من ضعف الميتوكوندريا في نموذج SCA1 الماوس، نحن تقييم فعالية العلاج مع ذوبان في الماء الأيض الداعم الصورةحمض uccinic عن طريق إذابة هذا المركب مباشرة في مياه الشرب المنزلية القفص. قدرة المخدرات لتمرير حاجز الدم في الدماغ يمكن استخلاصه باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC). فعالية هذه المركبات يمكن أن يكون من الممكن اختبارها باستخدام نماذج سلوكية متعددة بما في ذلك rotarod تسريع والتوازن اختبار شعاع وتحليل البصمة. سلامة Cytoarchitectural من المخيخ يمكن تقييم باستخدام المقايسات المناعي التي تكشف عن نوى الخلايا العصبية والتشعبات الخلية العصبية وسوما. وهذه الأساليب هي أساليب قوية لتحديد الخلل الميتوكوندريا وفعالية العلاج مع مركبات قابلة للذوبان في الماء في أمراض الاعصاب المخيخ.

المقدمة

الميتوكوندريا هي المنتجين الرئيسيين للالأدينوساين ثلاثي (ATP)، وهو أنزيم أساسي للطاقة الخلوية، مع غالبية ATP الميتوكوندريا تنتج من خلال الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) باستخدام سلسلة نقل الإلكترون. الدماغ، نظرا لمطالب الأيض عالية واعتمادها على الفسفرة التأكسدية لتوفير الطاقة النشاط العصبي، هو عرضة للضعف الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، يتم تشغيل ضعف الميتوكوندريا أثناء عملية الشيخوخة 1 والمتورطين في التسبب في العديد من الأمراض العصبية 2، 3، 4. وبالتالي، فإنه يترتب على ذلك أن الميتوكوندريا هي الأهداف العلاجية جذابة للالتنكس العصبي.

في هذا البروتوكول، الذي اعتمدناه استخدام مخيخي شوكي نوع ترنح 1 (SCA1) بأنه مرض الاعصاب نموذجي لدراسة الميتوكوندرياضعف لتر وتطوير علاجات تستهدف الميتوكوندريا. ويتسبب SCA1 عن طفرة polyglutamine (polyQ) تكرار التوسع في الجين المنتج ataxin-1 الذي يؤدي التنكس التدريجي للخلايا العصبية العصبية في المخيخ والخلايا العصبية من مناطق أخرى من الدماغ. خط المعدلة وراثيا الماوس المستخدمة هنا (تسمى الماوس SCA1)، الذي يعبر عن ataxin-1 التحوير-polyQ متحولة تحت سيطرة أحد المروجين محددة العصبية خلية، يسمح لتحليل المستهدفة من عنصر العصبية خلية من SCA1 5. الفئران SCA1 تخضع تدريجيا انحطاط الخلايا العصبية وتطوير مشية اانتظامية 6.

اختلال وظيفي معقد الميتوكوندريا والتي تستهدف الميتوكوندريا العلاج فعالية يمكن تقييمها مع بطارية من المقايسات الجزيئية والسلوكية. يتم قياس الخلل معقدة الميتوكوندريا خارج الجسم الحي بواسطة فحوصات التنفس التي تكشف عن استهلاك الأوكسجين تغير في أنسجة دماغ في حالةوجود ركائز سلسلة نقل الإلكترون ومثبطات 7. سبق استخدامها فحوصات التنفس مع الأنسجة permeabilized، العزلات الميتوكوندريا، والنسيج كله 7 و 8 و 9. أنها تسمح للتقييم المباشر وظيفة الميتوكوندريا على عكس طرق جمع البيانات المورفولوجية مثل المجهر الإلكتروني النافذ أو تلطيخ المناعي. استخدام النسيج كله بدلا من الميتوكوندريا معزولة يمنع اختيار منحازة الميتوكوندريا الصحية التي قد تحدث أثناء عملية عزل 7. عندما تكييفها وفقا لبروتوكول كما هو موضح، وفحص التنفس هو طريقة قيمة للكشف عن ضعف الميتوكوندريا في الحالات المرضية العصبية للدماغ.

المنشطات غير محددة من عملية التمثيل الغذائي يمكن أن تستخدم للاستدلال ضعف الميتوكوندريا في نماذج الفئران المعدلة وراثيا من الامراض العصبيةه والمساعدة في تطوير علاجات جديدة. كلها قد أظهرت كيرسيتين، أنزيم Q10 والكرياتين لتحسين علم الأمراض العصبية التنكسية في المرضى وفي النماذج الحيوانية من مرض الاعصاب 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16. هنا نقدم منشط الأيض الرواية، وحمض السكسينيك، لتحفيز عملية التمثيل الغذائي وتعزيز وظيفة الميتوكوندريا في الأمراض العصبية التنكسية. للتأكد من أن المنشط هو عبور حاجز الدم في الدماغ، كان يعمل HPLC للكشف عن تسليمها إلى الأنسجة العصبية في الفئران التي عولجت 17.

لتقييم الآثار العلاجية من المياه المستهدفة عملية الأيض المركبات القابلة للذوبان مثل حمض السكسينيك، وبطارية من النماذج السلوكية والدراسات immunopathological يمكن استخدامها. دووتستخدم البريد إلى عجز في التنسيق الحركي وجدت في أمراض المخيخ الاعصاب، البصمة المدرج الفحص، شعاع الفحص وتسريع الدورية فحص قضيب للكشف عن إنقاذ علم الأمراض السلوكية 6 و 18 و 19. وتستكمل هذه الإجراءات مع تقييم immunopathological من التهندس الخلوي للدماغ من خلال تقييم سمك طبقة الجزيئية (كما هو موضح العصبية خلية شجيري طول الشجرة) والعصبية تعداد خلايا سوما ضمن فصيص محددة من الأنسجة المخيخ 6 و 20 و 21. هنا نقدم عدة طرق عصبية مرضية والسلوكية للكشف وعلاج ضعف الميتوكوندريا مع المركبات القابلة للذوبان المياه المستهدفة عملية الأيض.

نحن نستخدم خارج الجسم الحي تحليل التنفس الميتوكوندريا لتحليل ضعف الميتوكوندريا في تران SCA1الماوس sgenic. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن أعراض المرض وعلم الأمراض وتحسن من الميتوكوندريا حمض معززة السكسينيك للذوبان في الماء، مما يزيد من تورط ضعف الميتوكوندريا في تطور المرض SCA1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية IACUC في كلية سكيدمور للعمل مع الفئران.

1. المعاملة مع المركبات للذوبان في الماء

  1. حل حمض السكسينيك إلى تركيز 0.75 ملغ / مل في مياه الشرب القفص. لاحظ أن أي مركب للذوبان في الماء من الفائدة في التركيز المطلوب يمكن أن تكون بديلا في هذه المرحلة. يحرك الحل للتأكد من أن المركب يذوب تماما.
  2. بعد الفئران تصل إلى سن المرجوة من العلاج، واستبدال مياه الشرب المنزلية قفص من المجموعة شرط المعاملة مع الحل في الخطوة 1.1.
  3. قياس وزن كل من العلاج والسيطرة زجاجات المياه جماعة يوميا لضمان أن كلا من المعالجة والسيطرة على الفئران وشرب نفس الكمية من المياه. استخدام هذه القياسات لحساب مجموع جرعة الدواء في قفص. مواصلة العلاج في كافة مراحل التجربة ومراقبة الوزن زجاجة.

2. تحليل البصمة

  1. وضع المدرج على الأرض أوعلى طاولة في غرفة المحصورة. تعيين المدرج في زاوية بزيادة طفيفة نحو مربع المنزل واصطف مع الفراش ومكافأة الغذائية (مثل الحبوب السكرية). خط طول المدرج مع ورقة بيضاء. السماح للموضوع حتى يتأقلم في مربع المنزل لمدة 5 دقائق.
  2. إزالة موضوع من مربع المنزل وطلاء قدميه الخلفيتين اليسار واليمين، على التوالي، مع الطلاء المستندة إلى الماء الأزرق والأحمر غير سامة. وسوف تستخدم طباعة الطلاء لحساب المخرجات المتعددة القياسات السلوكية.
  3. ضع هذا الموضوع في بداية المدرج والسماح موضوع سيرا على الأقدام إلى المربع المنزل. مرة واحدة وصلت موضوع مربع المنزل، وأغلق الباب فخ، والسماح للموضوع للبقاء ضمن مربع المنزل لمدة دقيقة واحدة قبل أن يعود إلى قفص المنزل المعني. تنظيف مربع المدرج ومنزل مع 30٪ من الإيثانول، ويستعاض عن الفراش، ومكافأة الغذائية، والورق المدرج في الموضوع التالي.
  4. تحديد عدد من الخطوات، عرض البوابة، زاوية الخطوة، وعدد من الأدوار التي اتخذتحسب الموضوع وفقا للأساليب التحليلية التي سبق وصفها 6. يتم تعريف محاكمة بصمة نجاح كحد أدنى من 5 أقدام متتابعة في هذا الموضوع الذي يسير نحو المربع الهدف دون الدوران في المكان أو توقف.

3. تحليل الشعاع

  1. إعداد جهاز شعاع وفقا للمواصفات عبر شريط الموصوفة سابقا 6 مع 6 الحزم التالية: شعاع 1 = مستطيل، عرض 28 مم؛ شعاع 2 = الجولة 28 ملم قطر. شعاع 3 = مستطيل، عرض 12 مم؛ شعاع 4 = الجولة، مم 12؛ شعاع 5 = مستطيل، عرض 6 مم؛ شعاع 6 = الجولة، مم 6. في نهاية واحدة من الحزم، وإنشاء صندوق منزل مظلمة مع الطعام مكافأة.
  2. لتدريب المواضيع المدرجة على شعاع، تجميع الجهاز مع شعاع 3. وضع بلطف الموضوع على نهاية شعاع مقابل مربع المنزل، والسماح الموضوع إلى السير عبر. يسمح لكل موضوع ما يصل الى ثلاث محاكمات 2 دقيقة لتحقيق مسيرته الناجحة، الذي يعرف بأنه عبور شعاع ودخول المربع الوطن في غضون 2 دقيقة. في بين التجارب، والسماح للبقية الموضوع في المربع المنزل لمدة 2 دقيقة. بين الموضوعات، تنظيف مربع شعاع والمنزل مع 30٪ من الإيثانول، ويستعاض عن الطعام مكافأة استعدادا للموضوع القادم.
  3. كرر الخطوة 3.2 مرة واحدة في اليوم لمدة اليومين المقبلين مما أدى إلى ما مجموعه 3 أيام تدريبية متسلسلة. اليوم اختبار، يوم 4، يجب أن تتبع بالتسلسل أيام التدريب.
  4. لاختبار المواد في يوم 4، أولا تجميع الجهاز مع شعاع 1 و إعداد مربع المنزل كما هو موضح في الخطوة 3.1. وضع كاميرا فيديو أمام الجهاز والتحقق من أن الجهاز شعاع الكامل يمكن التقاط صور واضحة في الفيديو. بدء التسجيل ووضع موضوعك الأول على شعاع مقابل مربع المنزل، والسماح لتصل إلى 3 محاولات 2 دقيقة لإكمال محاكمة بنجاح. في بين التجارب، والسماح تخضع لبقية لمدة 2 دقيقة في المربع المنزل.
  5. مواصلة اختبار الموضوع على كل من الحزم ستة في الترتيب العددي،يسمح هذا الموضوع للراحة لمدة 2 دقيقة في مربع المنزل قبل البدء في شعاع المقبل. بين الموضوعات، تنظيف كل شعاع ومربع المنزل مع 30٪ من الإيثانول، ويستعاض عن الطعام مكافأة استعدادا لكل موضوع.
    1. شريط فيديو كل محاكمة وتسجيل عدد من التجارب الناجحة في الموضوع في شعاع كما يلي: "1" يشير إلى أن موضوع ناجحة في المحاكمة الأولى، "2" تشير كان موضوع ناجحة في المحاكمة الثانية، "3" يشير إلى أن هذا الموضوع النجاح في المحاكمة الثالثة والأخيرة، و"4" يشير إلى أن هذا الموضوع لم يكن ناجحا في أي من التجارب الثلاث.
  6. استخدام تسجيلات الفيديو من footslips المحاكمات التدبير الهدافين الذين أعمى لظروف تجريبية من هذا الموضوع. تحديد footslip كما مؤخر القدم التي هي في إطلالة مباشرة على غمس الكاميرا دون خط الوسط النظري عبر طول شعاع. متوسط ​​درجات footslip من الهدافين متعددة.
  7. تحليل عدد من لياليالمحاكمات uccessful وعدد من البيانات footslips، حساب المتوسط ​​والخطأ المعياري في كل الوراثي وحالة تجريبية الفوج. إجراء في اتجاه واحد أنوفا ومقارنات متعددة تحليل ما بعد مخصصة لتحديد ما إذا كان هناك تأثير للعلاج وراثي على عدد من التجارب الناجحة وعدد من footslips.

4. تسريع Rotarod

  1. تأقلم المواضيع إلى دقيقة غرفة فحص 10 قبل بدء المحاكمة. خلال هذه الفترة التأقلم، وإعداد جهاز rotarod، وتنظيف كل حارة من الجهاز مع 30٪ من الإيثانول.
  2. فتح البرنامج rotarod ويحدد بداية الإعدادات إلى 4 دورة في الدقيقة، وإعدادات تسارع إلى 5 إعدادات دقيقة والسرعة النهائية إلى 40 دورة في الدقيقة. توفر هذه الإعدادات في تسارع مستمر 4-40 دورة في الدقيقة على مدى فترة من 5 دقائق. يمكن أن تبقى الفئران على rotarod في 40 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق إضافية إلى ما بعد فترة تسارع لطول المدى الأقصى لمدة 10 دقيقة.
  3. بعد التأقلم، والموضوعات مكان سn إلى rotarod في الممرات التابعة لها، فيما قضيب يدور في 4 دورة في الدقيقة. مرة واحدة كل المواضيع التي هي في الممرات الخاصة بهم، بدء المحاكمة الأولى. تسجيل الكمون في الانخفاض باستخدام برنامج الصك؛ جهاز توقيت الثانوي يمكن استخدامها على سبيل الاحتياط.
  4. بعد إتمام المحاكمة، والسماح لكل مادة للراحة في الخزانات حارة كل منها لمدة عشر دقائق قبل المحاكمة المقبلة لمنع التعب.
  5. كرر الخطوات من 4.3 و 4.4 ليصبح المجموع أربعة المحاكمات.
  6. كرر الخطوات من 4،3-4،5 ليصبح المجموع أربعة أيام متتالية، مواصلة العلاج طوال فترة المحاكمة. عند الانتهاء، تحديد الكمون لتسقط من على قضيب الدورية لكل محاكمة في موضوع (6).

5. مخيخي استخراج والتثبيت

  1. الموت ببطء الفئران عن طريق الخنق ثاني أكسيد الكربون وفقا لمبادئ توجيهية IACUC المؤسسية. وضع الموضوع في غرفة غاز ثاني أكسيد الكربون، وإطلاق ثاني أكسيد الكربون في الغرفة. راقبالحيوان في جميع الأوقات خلال الخطوة القتل الرحيم ولا تترك الحيوان غير المراقب.
  2. مرة واحدة لم يعد التنفس وتظهر المواضيع لا الإحساس بالألم المتبقية ضغط القدم الخلفية، وإزالة موضوع من الغرفة وجعل شق خط الوسط متفوقة من خلال الأنسجة الطلائية من منتصف الجمجمة caudally إلى قاعدة الجمجمة من خلال الأنسجة الطلائية.
  3. باستخدام مقص تشريح، وقطع الجمجمة من القاعدة في الحبل الشوكي من خلال الدرز السهمي إلى bregma. قطع أفقيا من خلال كل الدرز الإكليلي قبل سحب قبالة أمامي، والجداري الجداريين العظام باستخدام ملقط حادة.
  4. استخدام الملقط حادة لقطع جانبي العظم لالمخيخ. استخدام ملقط لفصل المخيخ من أكيمات والدماغ وقذف عن باقي الأنسجة. فصل المخيخ في نصفي الكرة اليمين واليسار مع ملقط.
  5. المكان على الفور المخيخ الأيمن في النيتروجين السائل لانقاذ لHPLC آناتحلل والمخيخ اليسرى في قبل المبردة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لتثبيت الأنسجة. حصاد أي نوع من الأنسجة الأخرى ذات الاهتمام قبل قطع الشريان الأورطي والتخلص من الجثة وفقا لقواعد IACUC المؤسسية.
    تنبيه: PFA هو شديدة السمية، قابلة للاشتعال، وتآكل.
  6. أربع وعشرين ساعة بعد القلع، وغسل الأنسجة الثابتة في PFA (4٪ في برنامج تلفزيوني) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (ثلاث مرات، 5 دقيقة / غسيل) قبل وضع الأنسجة في 30٪ سكروز في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

6. الباثولوجيا المناعية الفحص

  1. إرفاق أنابيب من مشراح ثقيلة لصنبور المغسلة ومربع التحكم في درجة الحرارة. استخدم مربع التحكم في درجة الحرارة لتبريد المرحلة مشراح إلى -25 درجة مئوية. ضبط قرص سمك باجتزاء إلى 50 ميكرون.
    ملاحظة: إذا كان الطلب على مشراح زلاجة لا تصل إلى 50 ميكرون، تعيين الطلب إلى إعداد أرق ومضاعفة سمك من خلال التحول الإعداد وفقا لذلك (على سبيل المثال تعيين دالاتحاد العالمي للتعليم إلى 10 ميكرون وتحويل خمس مرات قبل باجتزاء لسمك ما مجموعه 50 ميكرون).
  2. ربت جزء بحجم الدايم من الأمثل درجة الحرارة قطع (OTC) حل على خشبة المسرح. قبل تجمد OTC، واستخدام الملقط لوضع نصف الكرة الأرضية بحيث سطح قطع منتصف السهمي هو وجهه لأسفل على طبقة OTC. العمل بسرعة، وتوجيه بلطف الأنسجة مع ملقط بحيث يتم أشار غيض الوحشي من نصف الكرة نحو النصل، متفوقة على خشبة المسرح. السماح للOTC لتجميد تماما.
    1. العمل في الطبقات، يضيف إضافية OTC حول الأنسجة السماح للOTC لتجميد تماما قبل إضافة الطبقة التالية. إضافة طبقة رقيقة من OTC على أعلى من الأنسجة والتجميد.
  3. قسم الأنسجة، توزيع متساو وزن الجسم على شفرة القطع في حين باجتزاء. جمع المقاطع باستخدام الفرشاة الفنان الجميلة والمكان إلى لوحة جيدا وصفت بشكل مناسب يحتوي على برنامج تلفزيوني 1X. بين أقسام، إعادة تعيين سمك القطع علىالزلاجة الطلب مشراح، إذا لزم الأمر، إلى 50 ميكرون.
  4. استبدال برنامج تلفزيوني في كل بئر من لوحة جيدا مع محلول اليوريا [0.01 م اليوريا في برنامج تلفزيوني] ووضع لوحة على الجليد. عندما تصبح جاهزة، وإزالة لوحة من الجليد ويغلي المقاطع في محلول اليوريا ثلاث مرات لمدة 15 ثانية في كل مرة لكشف الحواتم لimmunolabeling. هذه الخطوة يمكن أن يتحقق بسهولة عن طريق وضع لوحة على كتلة التدفئة المقرر أن درجة حرارة الغليان. بين كل خطوة المغلي، تبرد لوحة تحتوي على أقسام الأنسجة على الجليد.
    ملاحظة: إذا كان أداء اليوريا، ومنع، الأجسام المضادة الأولية، الضد الثانوية والخطوات دابي في لوحة 96-جيدا، استخدم 100 مجلدا ميكرولتر طوال الوقت. إذا تم استخدام بئر مختلفة الحجم، وضبط كميات كاشف وفقا لذلك. بدلا من كتلة التدفئة وميكروويف يمكن أن تستخدم لغلي عينات الأنسجة في اليوريا. عينات الميكروويف على ارتفاع الطاقة وضع لمدة ثلاثة 15 ثانية فترات.
  5. غليان ما بعد، وغسل أقسام ثلاث مرات، في كل مرة إزالة الحل الحالي ليحل محل الحلمع 1X برنامج تلفزيوني وتهييج لمدة 10 دقيقة.
  6. أقسام كتلة مع حل حمار مصل (3٪ الحمار العادي المصل، 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) التي يحتضنها الأنسجة في مصل الدم لمدة ساعة واحدة مع الإثارة لطيف في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل المصل حمار.
  7. أقسام التسمية مع 0.2 ميكروغرام / مل مكافحة calbindin و 1: 2000 لمكافحة ataxin-1 الأجسام المضادة (11NQ) 16 في محلول المصل حمار واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 72 ساعة مع الإثارة لطيف.
  8. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 6.5 قبل احتضان المقاطع في الضد الثانوية المناسب (1: 500 اليكسا فلور-488 المضادة للماعز و 1: الأجسام المضادة 500 اليكسا فلور-594 المضادة للأرنب مخففة في حل المصل حمار) في 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة مع الإثارة لطيف.
  9. غسل أقسام ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 6.5 قبل نوى وسم الخلية مع دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindol) محلول مخفف إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. يجب أن لا يتجاوز دابي حضانة عشر دقائق. إزالة محلولن ويغسل مع برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 6.5.
  10. جبل الأنسجة على 2٪ الشرائح المغلفة الجيلاتين مع تصاعد المتوسطة للحد من photobleaching من. ساترة وختم بطلاء الأظافر.
  11. مع المجهر متحد البؤر تحديد الشق الأساسي من المخيخ تحت ضوء brightfield. مع هدف 10X UIS2 والمسح الضوئي وبالتتابع تثير دابي، AlexaFluor-488 و AlexaFluor-594 القنوات باستخدام ليزر ديود 405 نانومتر، وهو 488 نانومتر ليزر غاز الأرجون و559 نانومتر ليزر ديود، على التوالي، بالتعاون مع DM488 / 559 نانومتر مزدوج اللون شعاع الخائن. فصل وجمع الضوء المنبعث باستخدام SDM490 وSDM560 مقسم الأشعة ومرشح BA575-675 ممر الموجة، على التوالي.
    1. لكل قناة، بناء ض المكدس داخل الشق الأساسي مع ض = 20 ميكرون وخطوة = 0.1 ميكرون. استخدام البرمجيات مرحلة ما بعد المعالجة المقدمة مع المجهر متحد البؤر لإضافة في علامة حجم الصورة النهائية.
      ملاحظة: ليزر البديلة والفلاتر وfluorophores يمكن أن تكون بديلا يقوم على availabiliتاي. إذا AlexaFluor-488 أو AlexaFluor-594 كشف ضعيف، والغاليوم فوسفيد (GaAsP) ذات حساسية عالية للكشف ويمكن استخدام لتعزيز إشارة إذا كانت متوفرة.

7. تحديد مقدار الجزيئية طبقة سمك والعصبية أرقام الخليوي

  1. باستخدام يماغيج، فتح صورة ض المكدس من الشق الأساسي الملون وتقسيم كل صورة إلى قنواتها الأحمر والأزرق والأخضر عن طريق اختيار 'صورة' من شريط القوائم، "اللون" من علامة التبويب صورة و"قنوات سبليت" من اللون علامة التبويب.
  2. إنشاء Z إسقاط الحد الأقصى من كل قناة أن تم تقسيم. عندما تكون الصورة قناة الفائدة مفتوحة، اختر 'صورة' من شريط القوائم، "أقسام" من علامة التبويب صورة و "Z-مشروع" من علامة التبويب "أقسام". ضمن "المشروع Z 'القائمة الأوامر، حدد" ماكس Z توقع' وانقر على 'حسنا'. كرر لكل قناة.
  3. فتح المساعد عداد خلية عن طريق اختيار 'الإضافات' من عشرالبريد شريط القوائم، "تحليل" من علامة التبويب الإضافات و"خلية مكافحة" من علامة التبويب تحليل.
    ملاحظة: يماغيج ويماغيج عداد خلية المساعد يمكن تحميلها على المواقع الواردة في جدول المواد والمعدات.
  4. تحديد عدد الخلايا العصبية عن طريق عد نوى المسمى ataxin-1-التي تقع على طول محدد مسبقا 200 ميكرون امتداد الأمامية والخلفية أطوال الشق الأساسي. استخدام الخريطة عتبة عن طريق تحديد "صورة" من شريط القوائم، "ضبط" من علامة التبويب صورة و "عتبة" من علامة التبويب ضبط لعمل خريطة عتبة قناة الفائدة (أحمر في حالة نوى ataxin-1 المسمى ).
    1. اختيار مجموعة بكسل التي يمكن تطبيع جميع أنحاء الكمي (31-225 بكسل على سبيل المثال). تجاهل الضجيج من الصور عن طريق التحقق من مربع "الخلفية المظلمة" في إطار عتبة. إشارة الصورة يمكن أن تكون معكوسة لسهولة الفرز.
  5. تحديد الجزيئي thic طبقةkness يمكن في القناة الخضراء باستخدام "قنوات سبليت" وأداة "عتبة خريطة 'كما في خطوات 7.1 و 7.2. باستخدام علامة الحجم على كل صورة كدليل، وقياس عشوائيا ثلاثة أطوال طبقة الجزيئية داخل كل اثنين المعينة 200 ميكرون تمتد من كل صورة الشق الأولية. إجراء قياسات من نهاية القريبة من شجيري جذع العصبية في قاعدة سوما العصبية إلى نهاية البعيدة للجذع شجيري العصبية.
  6. سجل العصبية عدد الخلايا والجزيئات سمك طبقة وسائل زائد أو ناقص الخطأ المعياري. أداء في اتجاه واحد أنوفا مع مقارنات متعددة تحليل ما بعد مخصصة لاختبار تأثير ظروف العلاج أو التركيب الوراثي على عدد من الخلايا وطول الشجرة شجيري.

8. تحليل HPLC من مخيخي السكسينك حمض تركيزات ما بعد العلاج

  1. إعداد نموذج لتحليل
    1. تزن كل حصاد نصف الكرة المخيخية الأيمن قبلاستخدام في تحليل HPLC. تخطر على نصفين نصف الكرة الغربي في وقت واحد في الخالط dounce قبل المبردة وإضافة 0.5 مل من 75:25 (من حيث الحجم) المياه: الحل الميثانول إلى كل شوط المتجانس 17.
    2. باستخدام الخالط ضيق قبل المبردة، وكسر صارخ يصل الأنسجة مع 5 ضربات dounce. تواصل اللحم المفروم ناعما كل عينة الأنسجة مع الخالط أوسع، تطبيق 20 السكتات الدماغية dounce.
    3. نقل الخليط إلى ما قبل المبردة أنبوب microcentrifuge. بعد كل عينة، وشطف الخالط مع 0.5 مل من الماء المثلج: حل الميثانول وإضافة إلى شطف أنبوب microcentrifuge.
    4. عينات جناسة أجهزة الطرد المركزي في 1300 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية وجمع طاف في أنبوب microcentrifuge نظيفة.
    5. تصفية طاف من خلال وحدة تصفية الطرد المركزي يضم مع فلتر السليلوز مجدد من 10 كيلو دالتون (كيلو دالتون) الاسمي الجزيئي الحد الوزن. إذا لم يكن قيد التشغيل على الفور تحليل HPLC، مخزن تصفية العينات في -80 °C.
  2. HPLC الأجهزة والشروط
    1. إرفاق العمود اللوني الاستبعاد أيون بطول لا يقل عن 30 سم وحجم الجسيمات من 7 ميكرون إلى الكروماتوجرافي السائل عالي الأداء.
    2. إعداد وديغا وجود كمية كافية من 1 العازلة خلات ملي تعديلها لدرجة الحموضة من 5.
    3. تعيين HPLC مع سرعة الطور المتحرك من 0.8mL / دقيقة. إذا كنت تستخدم جهاز كشف الأشعة فوق البنفسجية تجاه، حدد الطول الموجي للكشف من 224 نانومتر. مرات شطف نموذجية للحامض السكسينيك في ظل هذه الظروف ما بين 10 و 12 دقيقة.
  3. تشغيل ومعايير ونماذج تحليل
    1. إعداد مجموعة من المعايير في المرحلة عازلة خلات المحمولة مع تركيز حمض السكسينيك بين 0 و 250 جزء في المليون.
    2. تشغيل كل معيار وإعداد منحنى المعايرة باستخدام الذروة منطقة يقاس من كل شوط.
    3. مرة واحدة يتم الحصول على منحنى معيار دقيق، تشغيل عينات معدة مسبقا المخفف في المخزن خلات.لمزيد من الدقة في القياس، وعينات يمكن ارتفعت مع تركيزات معروفة من حمض السكسينيك التي تم مخففة في الطور المتحرك. تشغيل جميع العينات في ثلاث نسخ.
    4. تحليل الاستشرابية HPLC لتحديد تركيز حمض السكسينيك من العينات باستخدام منحنى المعايرة وبعد ذلك ضرب من قبل حجم العينة وقسمة كتلة العينة الأصلية.

9. السابق تحليل فيفو من مخيخي الميتوكوندريا وظائف عن طريق وحدة تحكم كهربائي الأوكسجين

  1. إنشاء كلارك من نوع الكهربائي باستخدام نظام متاح تجاريا من خلال تطبيق أول قطرة من كلوريد البوتاسيوم (50٪ بوكل ث / ت) حل على المهبط البلاتين، وقطع 1.5 سم 2 قطعة من التبغ التجاري المتداول الورق ووضع بلطف ورقة على الكاثود البلاتين.
    1. تغطية الكاثود والأنود المحيطة بها مع 2.5 سم 2 قطعة من تترافلوروإيثيلين (PTFE) ورقة وتأمين سنججلي كلا membranes مع الحلقات، والتأكد من عدم وجود طيات أو فقاعات داخل الأغشية. بالتنقيط 50٪ بوكل حل في المحيط أيضا.
  2. تأمين القطب ولم يضف الى غرفة الفحص وملء مع المياه المشبعة الهواء. حرارة الغرفة إلى 30 درجة مئوية، إضافة بقضيب 0.8 سم إلى حل ويحرك في 70 دورة في الدقيقة باستخدام أداة البرمجيات. معايرة الغرفة من خلال إنشاء صفر الأكسجين. للقيام بذلك، متسلسل إضافة بضع بلورات من الحد dithionite كيل الصوديوم إلى الحل.
    1. وبمجرد تحقيق المعايرة، وغسل غرفة واحدة مع 70٪ من الإيثانول، ثم يغسل ست مرات مع الماء منزوع الأيونات قبل السماح للغرفة حتى يتأقلم في 1.5 مل من العازلة التنفس (5 ملي MgCl 2 و 60 ملي بوكل، 100 ملي مانيتول، 10 ملم KH 2 PO 4، 0.5 مم نا 2 EDTA، 60 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.4 درجة الحموضة]) 7.
      ملاحظة: كل آثار ثنائي ثيونيت الصوديوم يجب إزالتها تماما خلال خطوات غسل قبل محاولة قياستركيزات الأكسجين أثناء التجارب التنفس.
  3. التجانس بلطف نصفي المخيخ وزنه في 0.5 مل من العازلة جناسة (0.25 M السكروز، 0.5 ملي EDTA، 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.4 درجة الحموضة]). نقل جناسة لأنبوب 1.5 مل microcentrifuge نظيفة والحفاظ على برود حتى بداية الفحص.
  4. إضافة جناسة إلى غرفة، وبلغ حجم النهائي من 2 مل. Permeabilize جناسة المخيخ عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من ديجيتونين أو سابونين (5 ملغ / مل). تسمح الأنسجة المتجانس لاحتضان لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: ديجيتونين وسابونين سامة، ويجب أن تبقى حضانة مرات إلى أدنى حد ممكن.
  5. لبدء تسجيل استهلاك الأكسجين، وتحديد وظيفة الميتوكوندريا من خلال تفعيل وتثبيط سلسلة الفسفرة التأكسدية باستخدام ركائز ومثبطات، على التوالي (3 تسجيلات دقيقة لكل الركيزة).
    1. إضافة ركائز باستخدام الحقن النظيفة على النحو التالي: 10 ميكرولتر 2 M الغلوتامات [التركيز النهائي (FC) 0.01 م]،5 ميكرولتر 0.8 M مالات [FC 2 مم]، 20 ميكرولتر 0.5 M أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) [FC 5 ملي]، 1 ميكرولتر 1 ملم روتنون [FC 0.5 ميكرومتر]، 20 ميكرولتر 1M حمض السكسينيك [10 ملي]، 1 ميكرولتر 5 ملي أنتيمايسين إيه [FC 2.5 ميكرومتر]، 1 ميكرولتر 0.8 M أسكوربات [FC 0.4 ملي]، و 5 ميكرولتر 0.2 M ميثيل-ص-phenylenediamine (TMPD). [FC 0.5 ملي] عند إضافة ركائز إلى الغرفة يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في النظام.
      ملاحظة: معلومات مفصلة عن تأثير وظيفي الناجمة عن كل ركيزة والمانع الموضح في بروتوكول نشرت سابقا 7. قد تحتاج إلى أن تتولد لتحديد تركيزات الأمثل من ركائز ومثبطات في الأعمال التحضيرية / الأنسجة / الأنواع لم تدرس سابقا منحنيات الاستجابة للجرعة الفردية. وبالمثل، يمكن أن يكون الأمثل بروتوكول للميول فطرية التمثيل الغذائي في الأنسجة / الأنواع التي تجري دراستها، مثل تفضيلات الركيزة.
  6. بمجرد الانتهاء من جمع البيانات، بلطفspirate في الخليط دماغ وتنظيف الغرفة مع الايثانول والماء منزوع الأيونات. يمكن تشغيل مرة واحدة نظيفة، إضافية عينات جناسة المخيخ دون معايرة إضافية لطالما يبقى الغشاء PTFE سليمة. بعد الانتهاء النهائي، القطب نظيفة مع الماء منزوع الأيونات والايثانول ومخزن مع هلام السيليكا أو المجففة.
    ملاحظة: بين يعمل في نفس اليوم، وملء الغرفة مع الماء منزوع الأيونات ضمان أن الغشاء لا تجف.
  7. باستخدام ورقة البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج الصك، تصدير 40 دقيقة من البيانات التنفس ابتداء دقيقتين نشر الركيزة بالإضافة إلى برنامج جدول بيانات.
  8. حساب معدل التنفس في الركيزة أو مثبط. تطبيع البيانات عن طريق تقسيم التنفس الإجمالي في معدل التنفس أثناء الركيزة بالإضافة أسكوربات-TMPD.
    ملاحظة: معدل التنفس يمكن زيادة طبيعية لمحتوى البروتين في الأنسجة التي قد يكون مرغوبا فيه وخاصة في التجارب التنكس العصبيالتي قد تختلف محتويات الأنسجة. للقيام بذلك، حجز 50 ميكرولتر من جناسة العينة (من الخطوة 9.3) لاستخدامها في فحص البروتين القياسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من خلال استهداف الدوائية الميتوكوندريا المخيخ مع حمض السكسينيك ونحن قادرون على منع ضعف الميتوكوندريا في نموذج الفأر من SCA1 مرض الاعصاب المخيخ. تم حل المانحة الإلكترون الكنسي نازعة سكسينات، حمض السكسينيك، في مياه الشرب المنزلية قفص من الفئران SCA1 لمدة شهر واحد، مع بداية تقييم السلوكية خلال الأسبوع الثاني من العلاج والتقييم عصبية مرضية بعد العلاج (الشكل 1A). علاج حمض السكسينيك 22 يحسن أداء ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إذا تم استخدام هذه الأساليب كما هو موضح، فهي قادرة على اكتشاف وتخفيف التأكسدي بوساطة الفسفرة ضعف الميتوكوندريا في نماذج الفئران مرض الاعصاب المخيخ. فحوصات الكيمياء الحيوية والسلوكية المشتركة هي طرق متعددة الأوجه لتحديد مدى مساهمة الميتوكوندريا إلى المخيخ علم الأمراض العصبية التنكسية. عن طريق علاج الفئران مع حمض السكسينيك لتحفيز عملية التمثيل الغذائي وتعزيز وظيفة الميتوكوندريا، ونحن قادرون على إظهار الانقاذ من العجز السلوكية للدماغ والتنكس الدماغي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نود أن نشكر الدكتور هاري أور في جامعة مينيسوتا على هديته السخية للفئران المعدلة وراثيا. نود أيضا أن نشكر خريجة كلية سكيدمور التالية أسماؤهم على عملهم في إجراء التجارب السابقة: مونيكا فيليجاس ، بورتر هول ، ميتشل سبرينج ، نيكولاس توكر ، جيني تشانغ ، كلوي لارسون وشيان سلوكوم. علاوة على ذلك ، نود أن نشكر كلية سكيدمور على تمويل تطوير هذه الأساليب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ثنائي فوسفات الأدينوزينسيجما ألدريتشA2754ADP
أسكورباتسيجما ألدريتشA7631
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتشA2153BSA
4 '، 6-Diamidino-2-phenylindoleSigma AldrichD9542DAPI
DigitoninSigma AldrichD141
Dithiothreitolسيجما ألدريتشD0632DTT
دونكي سيجمألدريتشD9663
غلوتاماتسيجما ألدريتش1446600
مالاتسيجما ألدريتش6994
مانيتولسيجما ألدريتشM4125
بارافورمالديهايدسيجما ألدريتشP6148
لاكتوبيونات البوتاسيومالسكريات الحيوية69313-67-3
روتينونسيجما ألدريتشR8875
سابونينسيجما ألدريتش47036
حمض السكسينيكسيجما ألدريتشS3674
N و N و N و Prime ؛ N & < / م > - تتراميثيل-<إم > ص < / م > فينيلين ديامينسيجما ألدريتشT7394TMPD
تريتون X-100سيجما ألدريتشT9284
اليورياسيجما ألدريتشU0631
Vectashield تصاعد متوسطمختبرات ناقلاتH-1000
<قوية >الأجسام المضادة< / قوي>
11NQ الجسم المضاد (مضاد للأتاكسين -1)سيرفاديو ، et al.< / i> 1995 ، PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأرLife TechnologiesA-11015
Alexa Fluor 594 الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانبLifeTechnologies A-11012
الجسم المضاد كالبيندين (الماعز) سانتاكروزC-20
Animals< / قوي>
السيطرة على الفئران المعدلة وراثياهاري أور ، دكتوراه.A02Burright ، et al.< / i> 1997 ، PMID: 9217978
فئران SCA1هاري أور ، دكتوراه.B05Burright ، et al.< / i> 1997 ، PMID: 9217978
الفئران من النوع البريمختبر جاكسون001800
Equipment< / strong>
ESM-100L microtomeERMASledge microtome
Fluoview FV1200 مجهر متحد البؤرأوليمبوس
شرائح الجلسرين الجيلاتينFD نيورو تكنولوجيزPO101
حقنة هاميلتونسيجما ألدريتشVCAT 80465
OXYT1 وحدة التحكم في القطب الكهربائي OxythermHansatech Instruments
P.T.F.E. ورقةCole-ParmerUX-08277-15
Rotallion RotarodPPP & Gالاتصال بالمؤلف المقابل للحصول على معلومات
في نهاية المطاف 3000 HPLCDionex
Software
ImageJالمعهد الوطني للصحةhttp://imagej.nih.gov/ij/< / a>
البرنامج المساعد عداد الخلية (ل ImageJ)المعهد الوطني للصحةhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html< / a>
3P & G Rota-Rod v3.3.3 (برنامج rotarod) PPP& Gاتصل بالمؤلف المقابل للحصول على معلومات
Phidget21.dll (مطلوب لبرنامج rotarod)DLL-Files.comhttps://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

المراجع

  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
  3. Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
  4. Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).
  5. Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
  6. Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  8. Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
  9. Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
  10. Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
  11. Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
  12. Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
  13. Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
  14. Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
  15. Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
  16. Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
  17. Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
  18. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
  19. Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
  20. Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
  21. Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
  22. Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
  23. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

علاج الفئران SCA1 مع للذوبان في الماء المركبات لغير وجه التحديد زيادة وظيفة الميتوكوندريا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.