تقدم هذه المقالة طريقة سريعة وبسيطة لإدارة بليوميسين مباشرة إلى القصبة الهوائية الماوس عبر التنبيب. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تكرار للغاية، وسهلة لسيده، ولا يتطلب معدات متخصصة أو أوقات الانتعاش طويلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
افضل طريقة لرابيد تنبيب القصبة الهوائية في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
على الرغم من بعض الاختلافات التشريحية والفسيولوجية ، لا تزال نماذج الفئران أداة أساسية لدراسة أمراض الرئة البشرية. سمية البليومايسين هي نموذج شائع الاستخدام لدراسة كل من إصابة الرئة الحادة والتليف ، وقد تم تطوير طرق متعددة لإدارة البليومايسين (والعوامل السامة الأخرى) في الرئتين. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الأساليب ، مثل التقطير عبر القصبة الهوائية ، لها عيوب متأصلة ، بما في ذلك الحاجة إلى التخدير القوي وجراحة البقاء على قيد الحياة. تشير هذه الورقة إلى طريقة سريعة وقابلة للتكرار للتنبيب داخل القصبة الهوائية تتضمن تخديرا استنشاقيا خفيفا ، وتصور القصبة الهوائية ، واستخدام مقياس التنفس البديل لتأكيد التعرض. كدليل على المفهوم ، تم إعطاء الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-12 أسبوعا إما 2.0 وحدة / كجم من بليومايسين أو حجم مكافئ من PBS ، وتم قياس كل من الضرر ونقاط النهاية الليفية بعد التعرض. يسمح هذا الإجراء للباحثين بعلاج مجموعة كبيرة من الفئران في فترة قصيرة نسبيا بتكلفة قليلة وأقل قدر من الرعاية بعد العملية.
المقدمة
على الرغم من بعض الاختلافات التشريحية والفسيولوجية، تستمر 1 نماذج الفئران أنها لا تقدر بثمن لنمذجة البيولوجيا البشرية والتسبب بالمرض. 2 من وجهة نظر لتربية والفئران من السهل التعامل معها، ويكون وقتا تربية منخفضة، والعمر المتوقع تسارع، وغير مكلفة نسبيا الى المنزل. مع تطور سلالات متنوعة الوراثية واستراتيجيات (على سبيل المثال، مشروطة تدق الرافضة والفئران مراسل والنهج تتبع النسب، وما إلى ذلك)، فضلا عن مجموعة واسعة من الكواشف المتاحة (على سبيل المثال، الأجسام المضادة، والبروتينات المؤتلف، مثبطات، وما إلى ذلك)، أصبحت الفئران والضروري نموذج الفقاريات كائن لكشف عمليات التوازن وأمراض الإنسان. 3
وكانت الفئران ذات قيمة خاصة لدراسة أوضاع الرئوية، بما في ذلك الإصابات الحادة الرئة (علي) والتليف الرئوي. 4 ALI في البشر يمكن أن تكون ناجمة عن الصدمة أو الإصابة، أو تعفن الدم ويتميز الظهارية وتسرب البطانية (أي، وذمة)، والتهاب، والتليف الوليدة. في كثير من المرضى، ALI يتقدم لفي شكل حاد، متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)، والذي غالبا ما يؤدي إلى تليف وفاة بسبب فشل في الجهاز التنفسي. 5،6 التليف الرئوي هو تقدمي، علم الأمراض القاتلة والتي تتميز ترسب الزائد من المصفوفة خارج الخلية ، وأبرزها النوع الأول من الكولاجين، مما يؤدي إلى عرقلة وظيفة الرئة. 7،8 إدارة بليوميسين (بلم) هو النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع وأفضل وصف لإحداث ALI وتليف في حيوانات التجارب. 9 وعلى الرغم من بلم الناجم عن التليف الرئوي في القوارض يفعل لا ألخص تماما الظواهر التليفية الإنسان، أدت 10 دراسات الفأر مع هذا النموذج إلى اكتشاف العديد من العوامل الهامة التي تؤثر على ظهور وتطور المرض. 11
في حين أن الآلية الدقيقة (ق) وراء تكون الألياف التي يسببها بلم غير معروفة، وإصابة بدءويعتقد أن تنشأ من فواصل حبلا الحمض النووي التي تعتمد على الاتصال في الخلايا الظهارية المبطنة الشعب الهوائية التي تقوم بتنفيذ أو الحويصلات الهوائية، وعلى وجه الخصوص، نوع 1 pneumocytes 12 الحاجة للاتصال المباشر بين بلم والظهارة الرئوية يسلط الضوء على أهمية وجود مسار تسليم قوي وهذه المخاوف هي أيضا ثيق لمجموعة واسعة من العلاجات التي تستهدف الشعب الهوائية البعيدة، بما في ذلك البروتينات المؤتلف، والأجسام المضادة، سيرنا، الفيروسات، البكتيريا، والجسيمات، وأكثر من ذلك. طموح الفم والبلعوم (OPA) وقد استخدم على نطاق واسع لهذا الغرض 13، ولكن أحد أوجه القصور الرئيسية من التلوث النفطي هو جزء من وكيل تسليمها قد ابتلع في الجهاز الهضمي، مما يؤدي إلى عدم الدقة في الجرعة. مقاربة أخرى تستخدم على نطاق واسع هو تقطير عبر الرغامى، الذي ينطوي على القصبة الهوائية تحت التخدير قوية لفضح القصبة الهوائية وتقطير وكيل مباشرة في الجهاز التنفسي. 14 ومع ذلك، لا يجوز هذا فقطإجراء يكون غير مرغوب فيه بسبب invasivity لها، ولكنها أيضا وقتا طويلا، ويتطلب عادلة قليلا من التدريب، ويؤدي إلى إصابة قوية في الجهاز التنفسي وقد وضعت. 15،16 العديد من البروتوكولات التي تنطوي على الإدارة المباشرة للعملاء في القصبة الهوائية دون الحاجة للتدخل الجراحي، 16،17،18،19،20 أوقات الانتعاش ولكن هذه الطرق تتضمن تمديد الناجمة عن التخدير قوية، واستخدام معدات باهظة الثمن (أي، منظار الأذن / المنظار، لوحات إجراء المتاحة تجاريا، بالألياف البصرية الأسلاك، وما إلى ذلك)، وجود فائض من التلاعب في تجويف الفم، وعدم اليقين بشأن الجرعة.
توضح هذه الورقة طريقة سهلة نسبيا للإدارة عبر التنبيب التي تسمح للباحث بسرعة، غير مكلفة، وغرس موثوق كاشف في الرئة الفئران مع خطر محدود من الضرر المتبقية إلى الأنسجة المحيطة بها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت اللجان المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة واشنطن وسيناي الطبي مركز العمل الحيوان اللازم لهذه الدراسات.
1. إعداد
- تعقيم كل من ملقط نهاية حادة والأوتوكلاف خافضة عبر.
- استخدام خزانة السلامة البيولوجية، وإعداد مخزون عمل بلم في برنامج تلفزيوني من مسحوق مجفف بالتجميد. يصوتن الحل لمدة 10 دقيقة في 35 كيلوهرتز لضمان حتى الاختلاط.
ملاحظة: ينصح الحجم الكلي يتراوح بين 30 و 45 ميكرولتر لمنع الاختلاف pipetting لفي نهاية منخفضة، والاختناق مع كميات أكبر. - إعداد مساحة العمل النظيفة التي تضم حوالي 1 م 2 لإجراء العملية نفسها، وكذلك المواقع المخصصة لأقفاص قبل وبعد العملية على حد سواء.
- إصلاح قاعدة في مجلس الإجراء على مقاعد البدلاء على الفور أمام الباحث من خلال وضع 2 أو 3 شرائح من الشريط مختبر عبر قاعدة وunderlيينغ مقاعد البدلاء. انظر الشكل 1 لمزيد من مواصفات على خلق لوحة.
- تعادل طول واحد من حجم 4.0 خيوط الجروح بين المسمارين المواقع من مجلس الإجراء.
- توليد مقياس التنفس مؤقت عن طريق إزالة والتخلص من المكبس من ثلاثة 1 مل الحقن، وإيداع 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الجزء العلوي من كل برميل لتشكيل ختم محكم. تأمين مركز القسطرة فضفاضة إلى واحدة من الحقن ووضعه على جانب واحد من مجلس الإدارة.
- نضح 300 ميكرولتر من الهواء إلى حقنة 1 مل ووضعه على جانب واحد من مجلس الإدارة.
- قطع قطعة إضافية من الشريط حوالي 6 بوصات في الطول، ومكان لجانب واحد. وسوف تستخدم هذه لتأمين الحيوان إلى المجلس في الخطوة 2.4.
- انشاء غرفة الأيزوفلورين. إرفاق O 2، الأيزوفلورين، والفراغ إلى الموانئ المناسبة على كل من غرفة التعرض والفراغ التخليص. بدلا من ذلك، إدارة مخدر في الأيزوفلورين متوافق مع البيولوجيةمجلس الوزراء السلامة.
2. التنبيب
- تخدير الماوس مع isoflurane في غرفة حتى يفقد وعيه والتنفس يتباطأ إلى المعدل المناسب. ويشمل التعرض نموذجي 4٪ الأيزوفلورين و 2٪ O 2 لمدة 3 إلى 4 دقائق، والنتيجة المثالية هي 2-2،5 دقيقة من التخدير. وهذا يتوافق مع معدل التنفس من 1 التنفس كل ثانية 2.
- أثناء انتظار التخدير لوضع في، نضح ما بين 30 و 45 ميكرولتر من بلم في pipettor ومكان لجانب واحد.
- عندما تصبح جاهزة، تعليق الماوس مخدرا بواسطة القواطع العلوية من موضوع تعلق على مسامير المواقع من منصة الإجراء. تأكد من أن ظهر الحيوان شقة تقع ضد سطح المنصة.
- والحرص على عدم تقييد التهوية، ضع قطعة من الشريط فضفاضة عبر (الذيلية) الجزء السفلي من التجويف الصدري، وذلك فوق الحجاب الحاجز. وينبغي أن يكون وضع ما يكفي من ضيق للحفاظ على التوافق السليم خلال بروكedure، ولكن ليس ضيق بحيث أنه يحد من التنفس.
- بدوره على إضاءة ما بين 80٪ و كثافة 100٪ وتوجيه معقوفة بحيث يكون 1-2 سم من سطح الجلد، قرب الضفيرة الشمسية. فحص دوري غيض من معقوفة للحرارة للتأكد من أنه لا تجرح الماوس.
- يقف وراء المنصة، استخدام معقم، ملقط نهاية حادة لتحديد اللسان. الحرص على تجنب القواطع السفلية، بلطف قبضة ورسم اللسان من تجويف الفم.
- استعمال اليد المتبقية، إدراج خافضة واستخدامها لتسطيح اللسان ضد الكلمة من تجويف الفم. الافراج عن ملقط، ولكن ترك خافضة في مكان لالخطوتين التاليتين.
- توجيه الضوء بحيث القصبة الهوائية مرئيا من خلال توجيه معقوفة بشكل قريب من مستوى الضفيرة الشمسية حتى تصل إلى مستوى القصبات mainstem.
ملاحظة: القصبة الهوائية يمكن تمييزها بسهولة عن طريق عمل التنفس، مبادرة الخوذ البيضاءالفصل يسبب الضوء المنبعث أن تتقلب في كثافة. عند وضعه بشكل صحيح، وهذا الهيكل أن يكون ملحوظ في الطائرة المحورية كما دبوس في موقع مركزي الضوء مع الإضاءة المحيطة الحد الأدنى في تجويف الفم نفسه. - زاوية الحقنة بحيث يتبع مسار الطبيعي للالقصبة الهوائية، وخفض القسطرة طرف 22-G، مع حقنة المرفقة التي تحتوي على الحبرية، مباشرة في التجويف. ستبدأ فقاعة برنامج تلفزيوني لترتفع وتنخفض مع كل نفس على وضع ناجحة.
ملاحظة: قد يتم تأخير هذا الإجراء من قبل عدة ثوان نتيجة التخدير العميق. - تغذية القسطرة في 5 ملم إضافية. إزالة خافض اللسان.
- التحول المحقنة إلى الجانب المعاكس، والتي تجتاح المحور، وإزالة بلطف الحقنة.
- إيداع ما بين 30 و 45 ميكرولتر من بلم في وسط المناطق الداخلية من مركز القسطرة، ونعلق الحقنة الثانية والاستغناء 300 ميكرولتر من الهواء إلى المركز.
- استبدال الثانيةالمحاقن مع تحتوي على أول فقاعة من برنامج تلفزيوني. سيستمر فقاعة لترتفع وتنخفض إذا كان قد تم إجراء العملية بنجاح.
العناية 3. بعد الإجرائية
- إزالة القسطرة والشريط، ووضع الحيوان في مكان دافئ جاف حتى يستعيد وعيه - عادة في غضون بضع دقائق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم رصد الفئران تنبيب يوميا لفقدان الوزن والضيق، والتضحية في وقت لاحق 4، 10 أو 17 يوما عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2.5٪ 2،2،2- ثلاثي بروم إيثانول. تم جمع غسل القصبات (نال) في ثلاثة يغسل من برنامج تلفزيوني كما هو موضح في أماكن أخرى 21 وكان قد حدد في الرئة اليمنى في 10٪ من الفورمالين، البارافين جزءا لا يتجزأ، وملطخة ثلاثي الألوان ماسون من جامعة واشنطن الأنسجة والتصوير الأساسية 22.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الحالات التي تكون فيها هباء غير عملي نظرا لمحدودية كاشف، والسلامة، أو التكلفة، والإدارة القصبة الهوائية المباشرة هي طريقة مثلى لإيصال عوامل دخيلة إلى الرئتين عبر الرغامى 16 تقطير وقد استخدم على نطاق واسع لتحقيق ذلك؛ ومع ذلك، كما هو الحال مع كل تدخل جراحي، فإنه يحمل أيضا في طياته احتمالات المضاعفات الناجمة عن الإجراء في حد ذاته، وليس بالضرورة وكيل يجري تغرس 13 لهذه الأسباب، فقد أصبح شائعا بشكل متزايد لإدارة المواد مباشرة إلى القصبة الهوائ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
الكتاب أشكر براين جونسون علم الأنسجة والتصوير الأساسية في جامعة واشنطن للمساعدة في تلطيخ ثلاثي الألوان والتحليل. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL098067 وHL089455.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Bleomycin للحقن ، 30 وحدة / قارورة | APP Pharmaceuticals، LLC | 103720 | للحصول على أفضل النتائج ، يجب تعليق BLM في PBS ، وتخزينه كمواد |
| Blunt End | |||
| للاستخدام الفردي (أي Valleylab Blade Blade Electrode ، 2.4 بوصة) & nbsp ؛ | Covidien | E1551G | قبل الاستخدام ، قم بإنشاء منحنى 45 درجة 1.5 سم من طرف الشفرة. يمكن أيضا إنشاء خافض مناسب من أي أداة معدنية ذات أبعاد مماثلة. |
| قسطرة إكسيل سفليت 22 جم × 1 بوصة | إكسل إنترناشيونال | 26746 | |
| 1 مل حقنة درن قابلة للتصرف (200 / ليرة لباسية ، 1600 / كاليفورنيا) | 309659 | بحريني | |
| 0.2 مل ماصة وأطراف | |||
| إضاءة الألياف الخفيفة. الموديل 181-1: موديل 180 متزاوج مع إضاءة معقوفة مزدوجة قياسية | دولان جينر إندستريز، إنك. | 181-1 | لا ينصح باستخدام مصابيح LED ذات الإخراج المنخفض لأنها تفشل في إضاءة القصبة الهوائية بشكل كاف. |
| التنبيب | انظر الرسم البياني 1. | ||
| شريط الملصقات الملون: 0.5 ؛ في. | فيشربراند | واسع 15-901-15A | |
| أكسجين ؛ | |||
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 1X | Corning | 21-040-CV | يجب أن يكون المنتج معقما |
| بكرة خياطة مضفرة سوداء من الحرير غير المعقم ، 91.4 م ، مقاس 4-0 | جهاز هارفارد | 517698 | |
| آلة تخدير أعلى الطاولة معدات طبية http://www.highlandmedical.net/ | |||
| غرفة الأيزوفلوران التعريفي العلوي | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane ، USP) سائل للاستنشاق 100 مل & nbsp ؛ | باكستر | 1001936040 | |
| نظام علم الأمراض الرقمي Nanozoomer | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | مختبرات البيثيل | E90-101 |
المراجع
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis - preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. dR., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. dS. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601(2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261(2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
