مقالة منهجية

التصوير إعادة التنظيم المكاني لMAPK اشارة المسار باستخدام نظام التعبير عابر التبغ

DOI:

10.3791/53790

⸱

مارس 20, 2016

 , 
1The Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Plant Biology and Pathology, Rutgers, The State University of New Jersey

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على المستوى تحت الخلوي ، يتم تعديل أحداث الإشارات ديناميكيا بواسطة الإشارات التنموية والبيئية. نصف هنا بروتوكولا يستخدم نظام التعبير العابر للتبغ لمراقبة التفاعل الديناميكي بين البروتين والبروتين والكشف عن التنظيم المكاني لنقل الإشارة في الخلايا النباتية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت تصور الأحداث الإشارات الحيوية في الخلايا الحية تحديا. قمنا بتوسيع نظام التعبير عابرة المعمول بها، والجزيئية البيولوجية تكامل فلوري (BiFC) الفحص في خلايا البشرة التبغ، من التفاعل اختبار البروتين البروتين لمراقبة التوزيع المكاني لنقل الإشارة في الخلايا النباتية. في هذا البروتوكول، ونحن استخدام فحص BiFC لإظهار أن التفاعل والإشارات بين نبات الأرابيدوبسيس MAPKKK يودا وMAPK6 تحدث في غشاء البلازما. عندما كان يشارك في اعرب عن بعسل بروتين سقالة، والتفاعل يودا-MAPK توزيعها مكانيا وشارك الاستقطاب مع CFP-بعسل. يسمح هذا النظام التعبير التبغ المعدلة للفحص السريع للإشارات توطين ودينامية التغيرات (أقل من 4 أيام) ويمكن أن تستوعب متعددة الألوان بروتين فلوري (ثلاثة على الأقل). قدمنا ​​أيضا طرق مفصلة لتحديد توزيع البروتين (توطين المكاني غير المتماثلة، أو "الاستقطاب"؛) في الخلايا التبغ. هذا النظام التعبير التبغ متقدمة لديه القدرة على أن تستخدم على نطاق واسع لاختبار سريع للأحداث الإشارات الحيوية في الخلايا النباتية الحية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتفاعل البروتينات داخل المجمعات شبكة وشكل هرمي المعقدة التي تلعب دورا محوريا في العمليات الحيوية كلها تقريبا التي تحدث في بيئة الخلوية لا يمكن التنبؤ بها. ومع ذلك، من تطوير المصنع لاستجابات النمو، فقد كان هناك نقص في أدوات ملائمة من لا يمكن بسرعة فحسب، بل أيضا في تحديد كفاءة ورصد هذه الأحداث يشير إلى ديناميكية على مستوى التحت خلوية.

نظام بروتين تعبير عابر في البشرة أوراق التبغ وجذابة المزايا لتصور البروتينات الفلورية في الخلايا الحية. ويوفر هذا النظام شبه في الجسم الحي الظروف التي تسمح تعديل البروتين ما بعد متعدية والفحص السريع للتوطين البروتين. عن طريق فحص إشارة YFP تستكمل، وتكامل فلوري (BiFC) الفحص ثنائي الجزيء بإعلام إمكانية التفاعل البروتين البروتين في الخلايا النباتية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، على سبيل المثال، الخميرة اثنين الهجين (Y2H) وشارك-immunoprecipitation (المشارك IP)، ويوفر BiFC أيضا وسيلة قوية للتصور مقصورات حيث قد تحدث تفاعلات البروتين البروتين على مستوى التحت خلوية.

بسبب انقسام الخلايا غير المتماثلة (ACD) يحافظ على وقف سكان الخلية أثناء إنشاء أنواع الخلايا الجديدة لتشكيل نسيج / الجهاز، وهو آلية لا غنى عنها لتعزيز multicellularity حقيقية النواة. وقد استخدمت تنمية نبات الأرابيدوبسيس الثغور كنظام نموذج لدراسة ACD في النباتات. الخلية السلائف، الخلية الأم meristemoid، يقسم غير متماثلة لإنتاج خليتين ابنة مختلفة، وmeristemoid (يخضع لوقف الانقسامات تشبه الخلايا قبل إنهاء في زوج من خلايا الحرس) وخلية الثغور النسب الأرض (SLGC) (قد الانقسام والتمايز إلى خلية الرصيف)، على التوالي (الشكل 1). في خلايا الثغور ACD، والاستقطاب في كسر رواية البروتين من عدم التماثل في النسب الثغور (بعسل) premitotically لدفع التماثل الانقسام، الذي المؤتمر الوطني العراقيعدم التكافؤ المادي lude ومصير خلية التباين 1. وتبدأ عملية متسلسلة MAPK تتألف من MAPKKK يودا وMAPKs، MPK3 و 6 هي المركزية لالزخرفة قسم الثغور واعتماد مصير 2،3، 4،5.

في الآونة الأخيرة، وتشانغ وآخرون. ربط بعسل البروتين القطبية إلى مسار الإشارات YDA-MAPK في نبات الأرابيدوبسيس خلايا الثغور ACD 6. الكنسي يودا-MAPK الطريق، من خلال MPK3 / 6، phosphorylates بعسل وينشط الاستقطاب. وظائف بعسل فسفرته كما سقالة ويجند يودا (YDA) وMPK3 / 6 لتشكيل مجمع البروتين ويركز الإشارات في الخلية قشرة 6. الاستقطاب من المكونات MAPK وحلقة التغذية المرتدة الإيجابية بين بعسل ومسار YDA-MAPK يمثل آلية جديدة لاستقطاب البروتين في الخلايا النباتية. وافترض المخصب محليا مما يشير الى MAPK أن تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا التمايز مصير خلية في خلايا الثغور ACD 6 (الشكل 1). واحدة من كإرنست و يونغ البيانات التجريبية التي دعمت هذا النموذج جاء من المقايسات التبغ التي أظهرت إعادة توزيع المكاني للMAPKs الناجم عن التعبير عن بعسل 6.

بشكل عام، فإنه ليس من السهل لمراقبة حيث تحدث MAPK إشارات لأن جزيئات MAPK وكثيرا ما وجدت في كل مكان داخل الخلية. في هذه الدراسة، ونحن الاستفادة من نظام تقسيم YFP لتصور التفاعل بين كيناز المنبع والمصب منها تشير إلى مكان حدوث تتابع الإشارات. مددنا كذلك استخدام نظام BiFC عن طريق المشاركة في التعبير عن بروتين الثالث (CFP الموسومة) مع انقسام YFP الزوج (موحية للتفاعل البروتين البروتين) لتصور ما إذا كانت وكيف YFP تستكمل يمكن التضمين مكانيا من قبل المشارك وأعرب البروتين CFP. وبذلك، أثبتنا أن شارك في التعبير عن الحراجية المعتمدة بعسل الناجم عن إعادة تنظيم المكاني للالتفاعلات بين جمعية تنمية الشباب وMPK6، حتى من توزيعها على الزخرفة الاستقطاب في القشرة خلية من epiderm التبغخلايا تنظيم. ولهذا النظام لديه القدرة على أن تكون المتقدمة لرصد الأحداث إشارات حيوية في خلايا النبات تحت ظروف عندما تحدى الخلايا عن طريق المحفزات الداخلية أو الخارجية (على سبيل المثال، وشارك في التعبير عن البروتينات الأخرى، تطبيق الكيميائية، مهاجمة مسببات الأمراض أو التغيرات البيئية وغيرها. ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البلازميد البناء

  1. توليد بنيات بواسطة تكنولوجيا الاستنساخ كما هو موضح سابقا 1،6.
    1. أول استخدام البلمرة DNA عالية الدقة مع الاشعال المناسبة لتضخيم متواليات ترميز بعسل، جمعية تنمية الشباب وMPK6 ودون استنساخ لهم في ناقلات دخول. العثور على بروتوكول مفصلة في 7.
    2. لتوليد إصدارات السلبية السائدة في MPK6 وجمعية تنمية الشباب (DNmpk6 8 و DNyda 4 على التوالي)، استخدام البلازميدات دخول MPK6 وYDA كقالب وإدخال الطفرات نقطة بطريقة الطفرات موقع الموجه 9.
  2. لبناء بنيات لفحوصات عابرة التبغ، وإجراء LR القياسية (attL س ATTR إعادة التركيب) ردود الفعل (إجراءات مفصلة في 7) لدمج بعسل إلى pH35CG 10، DNyda وDNmpk6 إلى pXNGW وpXCGW ناقلات 11، على التوالي.
    1. تأكيد البلازميدات الناتجة بواسطة انزيم الهضم والتسلسل. مرة واحدة قuccessful، تحويل بنيات الثنائية في الأجرعية المورمة سلالة GV3101 12 وتنمو لهم على لوحات مختارة عند 28 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.

2. إعداد الحل الأجرعية تسلل

  1. تطعيم عدد قليل من المستعمرات الأجرعية تحولت حديثا إلى 10 مل من المتوسط ​​مع المضادات الحيوية المناسبة لوريا، Bertani (LB) (جنتاميسين 25 ميكروغرام / مل، ريفاميسن 25 ميكروغرام / مل، سبيكتينومايسين 100 ميكروغرام / مل لpH35CG، pXNGW وpXCGW يبني، ونفس تركيزات من الجنتاميسين وريفاميسن مع كانامايسين 50 ميكروغرام / مل لP19 (التعبير عن البروتينات ضد إسكات المعدلة وراثيا) 13.
  2. تنمو الثقافات الأجرعية في 28 درجة مئوية شاكر بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة ومن ثم قياس OD 600 (يتوقع أن يصل إلى 1،5-1،8) (الشكل 2A-B). تدور باستمرار الثقافات في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة. اعادة تعليق وواSH الكريات الخلايا مع 10 ملم من MgCl 2 (الحل تسلل).
  3. تدور باستمرار الثقافات مرة أخرى واعادة تعليق الكريات مع كمية مناسبة من الحل تسلل للوصول الى OD النهائي 600 = 0.5 (الشكل 2C-D). قبل التسلل النباتات، وترك المزيج من الخلايا في درجة حرارة الغرفة ل1-3 ساعة. هذه الخطوة تساعد على الحفاظ على التوازن الخلية.

3. التبغ نبات ورقة حقن

  1. استخدام نباتات التبغ (النيكوتين benthamiana)، ونمت 4 - القديم أسابيع 5 في غرفة نمو النبات القياسية (23 درجة مئوية مع دورات 16 ساعة الضوء / 8 ساعات الظلام) 14 للحقن ورقة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، نباتات التبغ وعادة ما يكون 6 أوراق (2 كبير، 2 متوسطة، و 2 صغيرة). واثنين من يترك المتوسطة الحجم هي الاكثر الأمثل للحقن ورقة (وهما الكبيرة هي قديمة جدا، في حين أن اثنين من الشركات الصغيرة غالبا ما تكون صغيرة جدا).
  2. قبل يوم تسلل، يسقي tobacمحطات شارك إلى تشبع التربة.
  3. في اليوم تسلل، قبل احتضان النباتات في الظلام لمدة 1-3 ساعة. هذه الخطوة تسمح الثغور في البشرة لفتح على نطاق واسع، مما يسهل كثيرا من الأجرعية عند اختراق في خلايا ورقة البشرة.
  4. باستخدام الأشرطة اللون المسمى مع التمر والعلم الأوراق مخترقة. كافة المجالات التي سيتم تسلل مع sharpie سميك أسود (اختياري، والمناطق تسلل واضحة بعد إصابتها.).
  5. أخذ كميات متساوية من الأجرعية اعادة تعليق ومزجها في 100 × 15 ملم طبق بيتري من قبل يحوم طيف (الشكل 2E). ملاحظة: في حالتنا، نحن مختلطة 1 مل من P19 مع 1 مل من الحراجية المعتمدة بعسل، 1 مل من DNyda-nYFP و 1 مل من DNmpk-cYFP.
  6. في عملية تسلل، وملء 3 مل حقنة needleless مع مزيج تسلل (1-2 مل)، ودفع إلى الجانب السفلي (مجافي المحور) من أوراق التبغ (الشكل 2F). في حين اختراق، فإنه من المفيدلاستخدام يد واحدة لدفع واليد الأخرى لدعم بلطف الجانب العلوي (متجه نحو المحور، ضد قوة دفع).
    ملاحظة: عندما يتم حقن خليط تسلل بنجاح، سوف المناطق المصابة تصبح التعرف عليها بسهولة في البشرة. ومع ذلك، قد تفشل تسلل بسبب حقن القاسي (تلف الأنسجة) أو دفع كافية (لا اختراق السائل). لكل اختبار، نقترح اثنين على الأقل من الحقن في اثنين من يترك مستقلة (من نباتات مختلفة).
  7. وضع النباتات المصابة مرة أخرى في غرفة النمو. عموما، والتعابير البروتين يمكن اكتشافها بعد 48 ساعة تسلل التالية.

4. متحد البؤر التصوير

  1. في 48 ساعة بعد تسلل، استخدم الناخس حفرة لاستئصال قرص ورقة من منطقة حقن (عادة 3-4 أقراص / منطقة يمكن أن تنتج) (الشكل 2G). استخدام ملاقط لنقل بلطف الأقراص ورقة إلى شريحة (الجانب مجافي المحور الصاعد) وجبل لهم قطرات الماء. تجنب الضغط هار جداد على غلاف زلة لأنه لن تقلص / الخلايا التالفة لا تظهر بشكل جيد تحت المجهر متحد البؤر (الشكل 2H).
  2. قبل التصوير متحد البؤر، تفحص عينات التي شنت على مجهر مركب برنامج التحصين الموسع الفلورسنت للتحقق من مستويات التعبير. ملاحظة: استنادا إلى تجربتنا، فإن الخلايا التي تظهر مستويات التعبير وسيطة هي أفضل ممثلة تحت المجهر متحد البؤر.
  3. نبدأ مع 40X (NA 1.3) عدسة على المجهر متحد البؤر. ضبط الشريحة إلى الموضع المطلوب بحيث تبقى الخلايا معربا عن مستويات متوسطة من البروتين الفلورسنت في المركز. أطياف الإثارة / انبعاث لCFP و YFP هي 458 نانومتر / 480-500 نانومتر و 514 نانومتر / 520-540 نانومتر، على التوالي.
  4. تفعيل زر "لايف" لمعاينة الصور ثم ضبط كثافة الليزر وزيادة الذكية للحصول على نسبة مضان كثافة / الضوضاء الأكثر توازنا. لتحسين جودة التصوير، وزيادة بكسل مسح و / أو المتوسط ​​إطار / خط. وأخيرا، وضبط مقبض التركيز على الجرميةالفصل البؤري متوسط ​​وفوق "لقطة" لاتخاذ صورة.
    ملاحظة: CFP والصور YFP يمكن التقاط أو بالتتابع في وقت واحد عن طريق فحص أو إيقاف خيار "متسلسلة" وضع المسح الضوئي، على التوالي.
  5. عند الرغبة Z-الإسقاط للرأي في عمق الخلايا، حدد "س ع ص" واسطة التصوير، وتحديد عمق نطاق المسح (10-15 ميكرون)، وجمع الصور من أعلى إلى أسفل الخلية المستهدفة . تجميع الصور التي تم الحصول عليها مع برنامج لايكا عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على ملف الصورة لتحديد "إعادة تسمية" وتصدير الصور على هيئة ملفات TIFF..
  6. صورة 30 - 40 خلايا للتحليل الكمي.

تجهيز 5. صورة والتحليل الكمي

  1. استخدام البرمجيات فيجي (http://fiji.sc/Fiji) لمعالجة الصور وإجراء القياس الكمي.
    1. رسم الرسوم البيانية كثافة مضان.
      1. لتصور أفضل ما إذا كان التعبير CFP / YFP هوبشكل موحد وزعت، استخدم فيجي للتدليل على قوة إشارة CFP و YFP على طول محيط الخلية. ولتحقيق ذلك، إطلاق أول فيجي ثم حدد "ملف" و "فتح" لبدء صورة. انقر على "خط" في القائمة أداة وحدد "خط مجزأة" طريق النقر على الحق. تقرر المنطقة من اهتمام ورسم خط على طول محيط الخلية لتتبع CFP أو إشارة YFP (الشكل 3A-C).
        ملاحظة: فيجي يقيس قيمة كثافة مضان المطلقة على طول خطوط مجزأة.
      2. اختر من القائمة المنسدلة "تحليل" و "الملف مؤامرة" لإنشاء رسم بياني مع الموقف وشدة القيم التي تمثل مستويات CFP / YFP على طول خط مجزأة. إذا رغبت في ذلك، مكررة قيم الكثافة (من خلال اختيار قائمة "نسخ") في EXCEL أو غيرها من برامج الرسم لتوليد الرسوم البيانية كثافة مماثلة.
    2. قياس درجة القطبية.
      1. جمع ما يقرب من 20 تمثيلا وخلايا tative من 3 تجارب تكرار لتقييم درجة قطبية CFP و YFP في الخلايا التبغ. حساب درجة الاستقطاب على أساس نسبة كثافة عالية مضان (كما هو موضح H) على مدى كثافة مضان منخفضة (كما هو موضح L). ملاحظة: يتم شرح طريقة الكمي في الشكل (3).
        1. لقياس القيم H و L، رسم خط مجزأة على طول المنطقة المهتمة في محيط الخلية (المذكورة أعلاه)، انقر فوق "تحليل" من القائمة المنسدلة، ثم حدد "القياس". عندما ملوثات العضوية الثابتة "نتائج" نافذة تصل، استخدم "يعني" القيم لأداء الكمي.
        2. من الخلايا التي تظهر التعبير موحدة نسبيا من CFP و YFP، على سبيل المثال، الحراجية المعتمدة بعسل (الشكل 3A) أو YFP تستكمل من شارك في التعبير عن DNyda-nYFP وDNmpk6-cYFP (الشكل 3B)، للحصول على القيم H و L عن طريق قياس اثنين تم اختيارها عشوائيا قطاعات هامشية على قدم المساواة مع الطول.
        3. من الخلايا العارضة تراكم القطبي واضح من البروتينات الفلورية، في هذه الحالة، وشارك في التعبير عن الحراجية المعتمدة بعسل، DNyda-nYFP وDNmpk6-cYFP (الشكل 3C)، وجمع القيم H من المناطق الطرفية مع إشارات مضان المخصب وليرة سورية من المناطق مع عدم وجود تراكم منخفض / مضان.
        4. تجمع النسب الناتجة من H / L من 20 زنزانة معا، واختبار للتوزيع الطبيعي. حساب القيم p بواسطة اختبار ر الطالب (على التوزيع الطبيعي) أو اختبار كولموجوروف-سميرنوف (KS) (للتوزيع غير عادي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لمنع موت الخلايا الناجم عن إشارات MAPK مفرط، تم استخدام الإصدارات كيناز غير نشطة من YDA (DNyda) وMPK6 (DNmpk6) في فحص شاركت في التعبير في الخلايا التبغ. لا التفاعل بين DNyda وDNmpk6 التي كشفت عنها BiFC ولا الحراجية المعتمدة بعسل نفسها ولدت نمط التوزيع غير المتكافئ (الشكل 3A-B). ومع ذلك، عندما قدم الحراجية المعتمدة بعسل إلى الزوج التفاعل DNyda-DNmpk6، تم توزيعها على حد سواء CFP وإشارات YFP إلى نحو الاستقطاب عالية (الشكل 3C)....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاستخدام العام والتعديلات الممكنة للنظام التعبير عابر التبغ لنقل الإشارة: overexpression من البروتين الفلوري (FP) -tagged البروتينات في البشرة التبغ استخدمت بنجاح لفحص سريع للبروتين توطين التحت خلوية في الخلايا النباتية. ومع ذلك، ودراسة توزيع الإشارات الديناميكي للمجمع البروتين في أخمص هو موضوع تحديا بسبب سياقات التحت خلوية معقدة، عابرة تفاعل البروتين البروتين والأحداث نقل الإشارة. لمواجهة هذا التحدي، اتخذنا الاستفادة من نظام BiFC لدراسة MAPK يشير الأحدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أعلنت أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Yumeng (Helen) Xia (جامعة روتجرز) على تحرير المخطوطات. يتم دعم العمل على تكوين قطبية BASL من خلال منح من المعهد الوطني الأمريكي للعلوم الطبية العامة إلى JD (R01GM109080) وجامعة روتجرز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Phusion DNA polymeraseNew England BiolabsM0530S
pENTR / D / TOPOLife TechnologiesK2400-20
QuickChange II XL مجموعة الطفرات الموجهة للموقعAgilent Technology200521
مرق رطلAMRESCOJ106-2KG
باكتو أجارأمريسكوJ673-1KG
جنتاميسينسيجما ألدريتشG3632-1G
ريفامبيسينسيجما ألدريتشR3501-1G
كاناميسينسيجما ألدريتشK4000-25G
سبيكتينوميسينسيجما ألدريتشS4014-5G
MgCl2< / sub>سيجما ألدريتشM8266-100G
25 × 75 مم شريحةVWR16004-382
24 × 50 مم غطاء زجاجيVWR48393-241
مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزرLeica & nbsp ؛TCS SP5 IILAS AF Lite software
40X عدسة موضوعيةLeicaHCX & nbsp ؛ خطة APO HCX  خطة APO ، NA 1.30
جهاز طرد مركزيThermo ScientificSORVALL 6 +
ثقب مثقابدبابيس
50 مل أنابيب الصقرجينيسي Scientific21-108
رقم 5 ملقطCanemco & Marivac205EQA-المواصفات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
  2. Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
  3. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
  4. Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
  5. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
  6. Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
  7. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4(2008).
  8. Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
  9. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
  10. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
  11. Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
  12. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
  13. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
  14. Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
  15. Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
  16. Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
  17. Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
  18. Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
  19. Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
  20. Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
  21. Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BASL

مقالات ذات صلة