والطريقة المبسطة للفائقة منخفضة الكثافة، طويل الأجل الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

تزايد الخلايا العصبية الحصين تحت ظروف في المختبر تمكن الملاحظة والتلاعب التجريبية من هذه الخلايا العصبية التي هي على خلاف ذلك غير ممكن في الجسم الحي. ويستخدم هذا المنهج التجريبي على نطاق واسع للكشف عن الآليات العصبية للنمو، والاستقطاب، والمواصفات محوار والاتجار وتوطين التحت خلوية من البروتينات، تشكيل المشبك والنضج الوظيفي ^1. هذه في المختبر الخلايا العصبية الحصين مثقف، عندما تحصد من المراحل الجنينية في وقت متأخر، ونقي نسبيا (> 90٪) خلايا glutamatergic مورفولوجيا هرمي ^2. لأن كانت تزرع الخلايا العصبية في سطح 2-D في ظل ظروف المختبر، يسمح هذا الأسلوب المراقبة سهلة، مثل التصوير الحي أو مناعية (ICC) تلطيخ خلال البؤري واحدة ^3؛ أو التلاعب، مثل العلاج من تعاطي المخدرات وتعداء ^3-6. عندما نمت في كثافة عالية، تميل الخلايا العصبية لديهم معدلات عالية من البقاء على قيد الحياة بسبب ارتفاع المشتركncentrations من عوامل النمو يفرز بالإضافة إلى دعم الهضمية من وسائط النمو، وأيضا بسبب الآليات التي تعتمد على الاتصال محوار ^7. ومع ذلك، وانخفاض كثافة الخلايا العصبية قرن آمون مرغوبة للدراسات المورفولوجية، حيث الخلايا العصبية الفردية يمكن تصويرها في مجملها أو الملون للتحليل للمحكمة الجنائية الدولية. الخلايا العصبية منخفض الكثافة من الصعب الحفاظ في الثقافة نظرا لعدم وجود دعم نظير الصماوي وبالتالي غالبا ما تتطلب الدعم الغذائي من الدبقية (عادة القشرية نجمية) طبقة المغذية، التي يجب أن تكون مستعدة قبل ثقافة العصبية ^2. عندما شارك في تربيتها مع طبقة تغذية الخلايا الدبقية، وتزرع الخلايا العصبية منخفض الكثافة coverslips على، ثم انقلبت على أعلى طبقة الدبقية بحيث الخلايا العصبية كثافة منخفضة والدبقية في مواجهة بعضهما البعض. يتم إنشاء مكان ضيق صغير بين الدبقية والخلايا العصبية عن طريق وضع النقاط شمع البارافين على زوايا لل coverslips، وبالتالي خلق "ساندويتش" تخطيط ^2،8،9. سوف تنمو الخلايا العصبية منخفض الكثافة ثithin مكان ضيق بين الدبقية وساترة، مما يخلق المكروية متساهلة مع العوامل المركزة التي يفرزها الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. هذا النهج غلة منخفض الكثافة، الخلايا العصبية كاملة النمو التي يتم بصرف النظر متباعدة إلى حد معقول، وبالتالي تسهيل وضع العلامات للمحكمة الجنائية الدولية أو الدراسات التصويرية الحية.

لكن هناك عائقا واضحا من الخلايا العصبية الدبقية الثقافة المشتركة، بصرف النظر عن كونها تستغرق وقتا طويلا وشاقة، هو أنه يمنع دراسة الخلايا العصبية محددة، أو خلية مستقلة، وآليات. على الرغم من أن هذا النظام هو أقل تعقيدا بكثير مما كانت عليه في الجسم الحي الأنسجة العصبية، والأثر الدبقية على تطوير الخلايا العصبية من خلال عوامل محددة لا ولكن في ذات بالكامل يفرز يمكن أن يتغلب على تجارب ^10. لذلك، في التجارب التي تتطلب التحقيق في آليات محددة الخلايا العصبية، وظروف ثقافة المعرفة التي تعمل على إزالة الدم وطبقة دعم الدبقية ضرورية. نجحت وكانت دراسة سابقة في زراعة تركيزات منخفضة من الخلايا العصبية (~ 9000 خلية / سم ²⁾ باستخدام الالعناصر الأرضية النادرة الأبعاد مصفوفة هيدروجيل ^11. منذ السكان العصبية نقي نسبيا يمكن تربيتها في كثافة عالية في ظل ظروف خالية المصل دون دعم الدبقية، ونحن نفترض أن كثافة منخفضة للغاية من الخلايا العصبية قرن آمون يمكن زراعتها في المصل محددة مجانا مستنبت من شارك في زرع لهم الخلايا العصبية عالية الكثافة، في بطريقة مشابهة لالخلايا العصبية الدبقية الثقافة المشتركة اعتمدت تقليديا. في الواقع، استخدمت عالية الكثافة الثقافات الخلايا العصبية قرن آمون في تكوين "ساندويتش" مؤخرا لدعم عدد صغير من الخلايا العصبية والغدد الصماء كبير الخلايا المتخصصة ^12.

لذلك، وشارك في الثقافة مع الخلايا العصبية عالية الكثافة قد تسمح الخلايا العصبية منخفض الكثافة لتلقي عوامل غذائي الدعم غير كافية لتمكين البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. وهكذا وضعت هذا البروتوكول من الخلايا العصبية فائقة الكثافة المنخفضة والتحقق من صحتها. ويمكن تنفيذ البروتوكول، خلال تجربة واحدة واحدة، من خلال إعداد كثافة عالية (~ 250000 خلية / مل) ديسالخلايا العصبية قرن آمون sociated أولا، ثم جعل التخفيف أن تسفر عن كثافة ~ 10،000 الخلايا العصبية / مل (~ 3000 الخلايا العصبية / ساترة، أو ~ 2000 الخلايا العصبية / سم ^2)، وهو أقل بكثير من معظم التقارير الثقافات منخفض الكثافة ^{2،3،9 ، 11،13.} ويشار إلى هذه الحالة ثقافة فضفاضة باسم الثقافة "فائقة الكثافة المنخفضة" وتستخدم مع "منخفض الكثافة" بين changeably. ومطلي الخلايا العصبية عالية الكثافة على بولي-D-يسين المغلفة 24 لوحات جيدا. في حين أن المصنف الخلايا العصبية منخفضة الكثافة على بولي-D-يسين المغلفة coverslips الزجاج 12 ملم التي يتم وضعها داخل 24 لوحة جيدا آخر. وانقلبت لل coverslips مع الالتزام الخلايا العصبية منخفضة الكثافة على أعلى من الخلايا العصبية عالية الكثافة في وقت لاحق 2 ساعة بعد ينحدرون من الخلايا العصبية وتعلق لل coverslips. وبالإضافة إلى ذلك، بدلا من استخدام النقاط شمع البارافين لرفع لل coverslips فوق طبقة الخلايا العصبية عالية الكثافة، وقد استخدم حقنة إبرة 18 G لحفر الجزء السفلي من 24 لوحات جيدة مع اثنين من خطوط متوازية. وdispl الناتجةACED والبلاستيك المجاورة توفر الدعم المرتفع للcoverslips الزجاج. يتم قياس هذه المساحة باستمرار على 150-200 ميكرون، والذي يسمح كافية من الأوكسجين والمتوسطة التبادل الثقافي مع توفير المكروية مع العوامل الغذائية المركزة. تحت هذا الشرط، والخلايا العصبية منخفض الكثافة تنمو على نطاق واسع، ويمكن البقاء على قيد الحياة أكثر من ثلاثة أشهر في الثقافة. عندما و transfected هذه الخلايا العصبية مع البلازميد GFP بعد ثلاثة أسابيع في الثقافة، ورصع التشعبات بغزارة مع العمود الفقري شجيري. كدليل على المبدأ، وتعرض البيانات التي تبين أن هذا النظام المشترك الثقافة يدعم منخفضة للغاية الثقافات كثافة الخلايا العصبية قرن آمون المصنف على بولي-D-ليسين "، الجزر الصغيرة، حيث تشكل الخلايا العصبية اتصالات autaptic التي قد تسهل التحقيق في خلية ، آليات شبكة مستقلة -autonomous.

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على الفئران عن طريق لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة أريزونا، وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة.

1. النسيج المصدر للالحصين العصبية الثقافة

1. لتوليد الجراء الماوس قبل الولادة للثقافة العصبية قرن آمون، استخدام الفئران في الوقت حاملا (C57Bl6 / J) التي يتم تربيتها في المنزل ^17. تم تعيينه اليوم مع الكشف عن المكونات المهبلية كما E0.5. وقت الحصاد المخطط للثقافة هو E16.5-E17.5.
   ملاحظة: هذا البروتوكول يصف الثقافات اثنين من 24 لوحات جيدة اثنين من الخلايا العصبية عالية الكثافة شارك في زراعة الخلايا العصبية مع منخفض الكثافة (مجموع 48 coverslips). لمزيد من لوحات والمواد والكواشف يمكن زيادتها تبعا لذلك.

2. لوحات 24-جيدا استعدادا لارتفاع الكثافة الثقافات العصبية

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية (2-3) قبل يوم من الحصاد المخطط لها من الأجنة.

1. جلب اثنين من 24 جيدلوحات في غطاء محرك السيارة زراعة الخلايا، وفتح العبوة الفردية.
2. توصيل إبرة 18 G حقنة ل1 مل بلاستيكية تستخدم مرة واحدة حقنة.
3. عقد المحقنة، وتهدف طرف الإبرة في ~ 1 ملم من اليسار إلى وسط قاع البئر. استخدام القوة المعتدلة (~ 250 غ) لحفر قاع البئر (~ 1 مم طويلة). وسيتم تشكيل لأخدود والمواد البلاستيكية تشريد ستشكل دعما مرتفع فوق السطح جيدا مسطحة القاع. حفر أخدود آخر ~ 1-طويلة مم مواز في ~ 1 مم إلى يمين وسط أسفل بطريقة مماثلة.
4. كرر هذه الخطوة لجميع الآبار من اثنين من 24 لوحات جيدا. الاثنين 24 لوحات جيدا تستخدم لثقافة عالية الكثافة هي الآن جاهزة لطلاء مع بولي-D-ليسين (راجع الخطوة 3.8 أدناه).

3. Coverslips التحضير لمنخفض الكثافة الثقافات العصبية

1. استخدام 12 مم # 1 جولة الزجاج.
2. وضع 50 coverslips داخل قطر 100 مم بلاستيكية معقمة طبق بتري، وغمر coverslipsفي 20 مل 70٪ محلول الإيثانول. وضع هذا الطبق بتري على منصة دوارة مع المعتدلين (70 دورة في الدقيقة) سرعة دوران لمدة ساعة. إزالة 70٪ من الإيثانول ثم قم باستبدال مع دفعة جديدة من 70٪ من الإيثانول. تدوير وغسل لمدة ساعة أخرى.
3. تجاهل 70٪ محلول التنظيف الإيثانول. إضافة الماء المعقم (تصفيتها من خلال وحدة تصفية 0.2 ميكرون). شطف لل coverslips بدقة عن طريق تدوير طبق بتري باليد. شطف ثلاث مرات، وفي كل مرة تحل محل مع الماء المعقم النقي.
4. وضع طبق بتري مع coverslips داخل الخلية هود الثقافة العقيمة مع تدفق الصفحي. نضح الماء الشطف من خلال خط فراغ، وإضافة 10 مل تصفية الماء المعقم أن تزج لل coverslips. وينبغي أن يكون لل coverslips معقمة والسطح يجب أن تكون نظيفة بما فيه الكفاية لطلاء بولي-D-يسين.
5. فتح اثنين من 24 لوحات جيدا من التعبئة الفردية، ووضعها في غطاء محرك السيارة.
6. تشغيل خط فراغ في غطاء محرك السيارة. توصيل 200 ميكرولتر ماصة للخط فراغ، واستخدام المصارف الإنمائية المتخصصةسور لقطع رأس لإنشاء أكبر الافتتاح.
7. استخدام غرامة طرف # 5 منتاش لالتقاط coverslips من طبق بتري، واحدة في وقت واحد، واستخدام خط فراغ لتجف تماما ساترة. ثم ضع ساترة واحد في كل من الآبار من 24 لوحة جيدا. وينبغي أن يكون لل coverslips تنظيفها 50 ما يكفي لملء كل من الآبار من اثنين من 24 لوحات جيدا.
8. تمييع الحل الأسهم بولي-D-ليسين (1 ملغ / مل) في حل العاملة (0.1 ملغ / مل) مع المخزن بورات (درجة الحموضة 8.5). لأربع لوحات 24-جيدا (بما في ذلك اثنين من لوحات عالية الكثافة مع أسفل المحفور)، وإعداد 30 مل من مجموع حل العاملة.
9. إضافة 300 ميكرولتر 0.1 ملغ / مل حل العمل بولي-D-يسين على كل جانب مع coverslips الزجاج. تأكد مغمورة تماما لل coverslips في حل. إذا لم يكن كذلك، استخدام الملقط غيض # 5 في الضغط coverslips ضد قاع البئر، واستخدام معلومات سرية لتوجيه حل بولي-D-يسين لتغطية كل سطح لل coverslips. تفقد البصر كل لل coverslips لجعل سوإعادة أي الهواء كان محاصرا بين لوحة وcoverslips.
10. إضافة 300 ميكرولتر 0.1 ملغ / مل حل العمل بولي-D-يسين إلى كل بئر من لوحة ثقافة عالية الكثافة مع أسفل المحفور. تدوير باليد لنشر الحل لتغطية الجزء السفلي بأكمله من البئر.
11. عودة جميع لوحات أربعة مع بولي-D-ليسين إلى حاضنة الثقافة، واحتضان O / N.

4. غسل وتكييف قبل لوحات للثقافة

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية (4-9) من يوم الحصاد الأنسجة.

1. بعد مرور فترة الحضانة / طلاء coverslips و24 لوحات جيدا O / N، جلب جميع لوحات الأربعة (اثنان مع coverslips المانحة، واثنان متقبل لوحات عالية الكثافة مع أسفل البلاستيك محفورا) في غطاء الثقافة. استخدام خط فراغ لإزالة حل بولي-D-يسين.
2. مباشرة بعد إزالة الحل بولي-D-يسين، إضافة ~ 1 مل من الماء المعقم إلى كل بئر باستخدام ماصة نقل البلاستيكية. بعد أن يتم شغل كل الآبارمع الماء، واسمحوا الوقوف لمدة 10 دقيقة. إزالة المياه من فراغ، ثم يضاف 300 ميكرولتر غسل المتوسطة في كل بئر لتغطية قاع البئر (مع أو بدون coverslips الزجاج). لا تدع طلاء بولي-D-يسين تجف.
3. عودة جميع لوحات أربعة إلى حاضنة الخلية. لوحات جاهزة للاستخدام مرة واحدة يتم إعداد الخلايا العصبية الحصين تفرقوا.

5. إعداد المتوسطة ثقافة كاملة، والتربسين الحل لالأنزيمية الهضم

1. إعداد 60 مل الثقافة المتوسطة كاملة عن طريق خلط المكونات (انظر المواد). استخدام حقنة 50 مل اتصال مع 0.2 ميكرون المسام مرشح حجم حقنة، تصفية الثقافة المتوسطة كاملة إلى قسمين أنابيب مخروطية 50 مل. كل أنبوب يحتوي على 30 مل كاملة الثقافة المتوسطة.
2. في 50 مل أنبوب مخروطي منفصل، إضافة ~ 30 مل غسل المتوسطة (انظر المواد) وتدفئتها إلى 37 درجة مئوية. وسوف تستخدم هذه لغسل الأنسجة بعد الهضم الأنزيمي.
3. إعداد المتوسطة انزيم الهضم. في 15 مل أنبوب مخروطي، إضافة 4.5 مل غسل المتوسطة و 0.5 مل 2.5٪ محلول التربسين، و 50 ميكرولتر 100X الدناز أولا
4. ضع المتوسطة ثقافة كاملة، غسل المتوسطة، وانزيم الهضم المتوسطة في حمام الماء 37 درجة مئوية.

6. إعداد أدوات جراحية

1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الحقيبة التعقيم: اثنان مقص صغير، وزوج من الملقط واثنين من 5 ملاقط #.

7. إزالة أدمغة من E16.5-E17.5 أجنة الفئران، وتشريح الحصين

1. إعداد كل منهما 10 سم أطباق بتري مليئة حل الجليد الباردة العقيمة هانك المتوازنة الملح (HBSS).
2. الموت ببطء السد الفأر مع حقنة داخل الصفاق من الفينوباربيتال الصوديوم (100 ملغ / كغ في حجم ~ 0.5 مل). بعد الحقن، وبمجرد أن السد يفقد استجابة لقرصة أخمص القدمين، وتضحية مع خلع عنق الرحم.
3. رش منطقة السد البطن مع الايثانول 70٪، وجعل شق طويل 2-سم على طول خط الوسط من البطن لفضحالرحم.
4. إزالة الأجنة ووضع تلك الفردية في 10 سم، وقطره طبق بتري مع العازلة HBSS تشريح الباردة.
5. عقد الجنين عن طريق الرقبة باستخدام ملقط، واستخدام مقص صغير لأداء أول خفض الحق في خط الوسط دون مستوى المخيخ والقسم عبر أنسجة المخ. لا قطع رأس الجنين.
   1. إدراج غيض الجانب الأيمن من مقص صغير من المنطقة الذيلية الذي قطع مفتوحة، على طول الطريق من خلال الجزء منقاري من الدماغ الجنيني (لا عبر خط الوسط)، واجراء خفض على الجانب الأيسر على مستوى قاعدة الجمجمة.
   2. إدراج الجانب مقص طرف اليسار مرة أخرى لاجراء خفض على الجانب الأيمن. ترك شريط ضيق من عظم الجمجمة تقطيعه وأنسجة الجلد في نهاية منقاري، بحيث الدماغ كله يمكن أن انقلبت جانبا لسهولة استخراج.
   3. استخدام غيض من مقص ليستخرج المخ الجنينية في حل HBSS. تفقد الدماغ تحت المجهر تشريح. وينبغي أن يكون الدماغ سليمة مع عدم وجود الإجمالي قطع سالمناطق وما يليها.
   4. كرر هذه الخطوات لجمع كل العقول الجنين.
6. جمع كل العقول سليمة في طبق بتري جديدة تحتوي على 20 مل العازلة HBSS الباردة. وضع طبق بتري تحت المجهر تشريح.
7. عرض الدماغ من الجانب البطني. أثناء الضغط باستمرار على الدماغ مع ملقط في نهاية الذيلية، اضافة الى وجود الحاد # 5 منتاش قطريا لاجراء خفض بين نقطة منقاري الوسطى والمنطقة الذيلية الزمني. كرر هذا لنصف الكرة الأرضية الأخرى. بعد القطع، ومنفصلة نصفين مع الحصين سليمة من بقية أنسجة جذع الدماغ.
   1. كرر ذلك لكل من العقول.
8. تجمع كل من نصفي الكرة الأرضية تشريح، وإزالة السحايا باستخدام اثنين من أزواج من # 5 ملاقط.
9. تحديد الحصين النامية وبنية المنحني الذي يتم طي داخل الفص الصدغي. بالتناوب أزواج اثنين من ملاقط لفصل الحصين من الأنسجة المجاورة القشرية. جمع وتجميع جميع hippocamالأنسجة بي (انظر الشكل 1).

8. الأنزيمية الهضم، منفصلة إلى الخلايا العصبية واحدة

1. باستخدام ماصة نقل البلاستيكية، ونقل جميع الحصين تشريح في حل الهضم الأنزيمي تحتوي على 5 مل غسل المتوسطة مع 0.25٪ التربسين + 1X الدناز أنا في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
2. وضع أنبوب داخل حمام ماء واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة، مع قلب طيف متقطع من الأنبوب مرة واحدة في كل 5 دقائق.
3. بعد 25 دقيقة، وإزالة بعناية حل انزيم باستخدام اليد التي عقدت ماصة بلاستيكية بواسطة الطموح. إضافة الدافئة غسل المتوسطة إلى 10 مل وغسل بلطف الأنسجة التي كتبها قلب ببطء الأنبوب 5 مرات. إزالة المتوسطة غسل، وإضافة 10 مل غسل المتوسطة مرة أخرى لغسل إضافية.
4. إزالة المتوسطة غسل، وإضافة 3 مل من جديد غسل المتوسطة دافئ مرة أخرى. هز أنبوب باليد صارم لمدة 15 مرات لطرد الخلايا العصبية هضمها من الأنسجة. وينبغي أن تصبح وسيلة العكرة مرة واحدة في خلاياإعادة فصلها عن الأنسجة في المتوسط ​​غسل. جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل مخروطي الشكل الجديد مع ترك الأنسجة المتبقية في الأنبوب.
5. إضافة 2 مل غسل وسيلة أخرى للأنسجة، وبلطف فصل الأنسجة المتبقية من قبل الطحن من خلال ماصة بلاستيكية ل~ 15 مرة. اتركيه لمدة 5 دقائق. تجمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل مخروطي الشكل الجديد الذي يحتوي على جمع الخلايا هزة قبالة '.
6. عد كثافة الخلايا العصبية مع عدادة الكريات. عادة، 3،000-5،000 الخلايا لكل ميكروليتر يمكن الحصول اعتمادا على عدد من الأجنة تشريح. ويقدر متوسط ​​عدد 2.5 × 10 ⁷ الخلايا العصبية إذا افتراض ستة أجنة وتشريح.
7. حساب حجم الحاجة من هذا التعليق الخلية لانتاج كثافة من 250000 خلية عصبية / مل عند إضافته إلى 30 مل الثقافة المتوسطة كاملة. هذا إضافة إلى حجم واحد من اثنين من أنابيب مخروطية تحتوي على 30 مل ثقافة كاملة المتوسطة لانتاج عالية الكثافة الخلايا العصبية الطلاء المتوسطة.
<لى> نقل 1.2 مل من هذا المحلول الخلايا العصبية عالية الكثافة إلى 30 مل أخرى كاملة الثقافة المتوسطة لتسفر عن تركيز ~ 10،000 الخلايا العصبية / مل. استخدام هذا التخفيف البذور لل coverslips منخفض الكثافة.

9. التصفيحات من الخلايا العصبية وطويلة الأجل المشارك الثقافة

1. جلب اثنين من لوحات 24-جيدا مع قيعان محفورا على الخلايا العصبية كثافة عالية في الخلية هود الثقافة. إزالة المتوسطة 300 مسبق ميكرولتر من فراغ. لوحة 0.6 مل عالية الكثافة الايقاف الخلية في الخلايا العصبية 250000 / مل.
2. جلب اثنين من لوحات 24-جيدا أخرى مع coverslips في غطاء محرك السيارة والثقافة، وإزالة المتوسطة 300 مسبق ميكرولتر من فراغ. لوحة 0.6 مل تعليق خلية منخفض الكثافة في 10،000 الخلايا العصبية / مل على لل coverslips داخل اثنين من 24 لوحات جيدا.
3. العودة كل 24 لوحات جيدا أربعة إلى الحاضنة. اتركيه لمدة 2 ساعة.
4. الوجه لل coverslips منخفضة الكثافة مع الالتزام الخلايا العصبية للثقافة عالية الكثافة. تأكد من الخلايا العصبية مواجهة بعضهما البعض (أي، نبعد التمديد مفصولة ساترة الزجاج). ثم العودة لوحتي مع زملاء الثقافة الحاضنة.

استدامة 10. المشارك الثقافة

1. إطعام المشترك الثقافات من خلال إضافة 300 ميكرولتر تغذية متوسطة جديدة (انظر المواد) في يوم واحد في المختبر (DIV) 5. ليست هناك حاجة لإزالة 50٪ من الأصلي الثقافة المتوسطة كاملة، كما ذكرت من قبل العديد من الدراسات الأخرى. يحتوي المتوسطة تغذية أيضا 15 ميكرومتر السيتوزين الأرابينوزيد (آرا-C، لتسفر عن تركيز النهائي من 5 ميكرومتر) لتقليل فرصة التلوث الدبقية والانتشار.
2. وبعد هذه التغذية الأولية، إضافة 300 ميكرولتر الطازجة تغذية وسيط وبدون آرا-C إلى جانب كل أسبوع. يجب أن تبقى الثقافة لأكثر من شهر واحد، استبدال نصف المتوسطة مع تغذية جديدة كل أسبوع إلى ما بعد نقطة زمنية شهر واحد (مع الأول المتوسط ​​نصف استبدال في DIV33). شكليا، سواء كثافة عالية والخلايا العصبية منخفض الكثافة تبدو صحية تصل إلى ثلاثة أشهر (وقتا أطول لاحظها EXPERimenters).

11. رسم توضيحي لالتجريبية المنخفض الكثافة التلاعب العصبية ترنسفكأيشن

ملاحظة: عندما يكون المطلوب ترنسفكأيشن في الخلايا العصبية ومنخفض الكثافة، ويمكن اعتماد بروتوكول فوسفات الكالسيوم بسيط. لقد وجدنا أن الثقافات منخفض الكثافة لديهم الكفاءة ترنسفكأيشن أفضل مع بروتوكول فوسفات الكالسيوم قبل DIV12، ولكن يمكن transfected مع أقل بكثير كفاءة في DIV21 أو أكثر، وخلال هذه الفترة العمود الفقري شجيري بارزة. ويتضح جدوى ترنسفكأيشن للمثقف منخفضة الكثافة الخلايا العصبية التي transfecting الخلايا العصبية مع البلازميد pEGFP-C3 (أنظر أدناه).

1. في DIV21، وإزالة 600 ميكرولتر مكيفة متوسطة من كل بئر من الثقافة المشتركة، وتحويلها إلى لوحة 24-جيدا جديدة. ثم إضافة 600 ميكرولتر الأعلاف الطازجة المتوسطة إلى ثقافة مشتركة لإعادته إلى حجمه الأصلي.
   1. نقل لل coverslips في 24 لوحة جيدا الجديدة مع 600 ميكرولتر المتوسطة مكيفة. تأكد من أنتواجه الخلايا العصبية منخفض الكثافة الأعلى. وضع لوحات كثافة عالية ولوحات جديدة مع coverslips مرة أخرى في حاضنة.
2. إعداد اثنين من 1.5 مل أنابيب معقمة. في أنبوب واحد، إضافة 600 ميكرولتر 2X HEPES مخزنة المالحة (HBS) حل. حساب حجم 12 ميكروغرام pEGFP-C3 الحمض النووي على أساس تركيز البلازميد. في أنبوب آخر، إضافة 74 ميكرولتر CaCl ₂ (2 M الأسهم) وحجم المياه التي بعد إضافة البلازميد سيجعل 600 ميكرولتر. تخلط جيدا من قبل pipetting ثم إضافة DNA البلازميد. مزيج ببطء أيضا. دعونا كل من أنابيب الجلوس لمدة 5 دقائق على RT.
3. في حين تأخذ بيدها أنبوب 2X HBS وتهييج متوسطة الحل على خلاط، إضافة كافة 600 ميكرولتر انخفاض حل الحمض النووي CaCl ₂ قطرة إلى 600 ميكرولتر أنبوب 2X HBS. ومن الأهمية بمكان أن يعجل شكلت في شكل حبيبات "الرمال الناعمة". خلط قوية جدا وسريعة جدا غير مرغوب فيه، لأنه على الأرجح، إنتاج "الثلوج مثل flake' رواسب كبيرة، حركتيح لديها أقل بشكل كبير كفاءة ترنسفكأيشن بناء على ملاحظاتنا.
4. السماح للراسب تستمر في تشكيل في الظلام في RT لمدة 30 دقيقة.
5. إضافة 100 ميكرولتر راسب إلى كل بئر يحتوي على الخلايا العصبية منخفضة الكثافة على لل coverslips، قطرة قطرة وبشكل متساو. عودة لوحة لالحاضنة، واحتضان لمدة 2 ساعة. على افتراض معظم CaCl ₂ في شكل حر، وهذا يؤدي إلى تركيز ~ 17.6 ملي كا ^2+، والتي قد تكون سامة للخلايا العصبية التالية حضانة طويلة.
6. إعداد أنبوب مخروطي 50 مل مع ~ 50 مل غسل المتوسطة، تدفئتها إلى 37 درجة مئوية.
7. في نهاية 2 ساعة، جلب منخفضة الكثافة الخلايا العصبية مع الفوسفات الحمض النووي الكالسيوم يترسب في غطاء محرك السيارة. تلتقط كل ساترة الفردية مع حاد # 5 منتاش، وتراجع ثلاث مرات في 50 مل غسل المتوسطة لأنه يغسل لفترة وجيزة. ثم إعادته إلى الخلايا العصبية ذات الكثافة العالية في لوحات الأصلية ثقافة مشتركة، مع الخلايا العصبية منخفض الكثافة إلى أسفل.
8. تواصل الثقافة حتىويتم حصاد منخفضة الخلايا العصبية ثقافة كثافة coverslips على الدراسات.

بروتوكول صفها هنا يمكن ناجحة كثافة منخفضة للغاية، والثقافة، على المدى الطويل من الخلايا العصبية glutamatergic نقية من دون الحاجة إلى الخلايا الدبقية بمثابة طبقة المغذية. وdiagramed البروتوكول في الشكل رقم 1، الذي ينطوي على إعداد كثافة عالية (على بولي-D-يسين المغلفة 24 بئرا) والخلايا العصبية ذات الكثافة المنخفضة (على بولي-D-ليسين coverslips الزجاج المطلي) على حدة، واللاحقة الثقافة المشتركة التي يمكن أن الإبقاء تصل إلى ثلاثة أشهر.

الأرقام 2A و 2B والرسوم التوضيحية للكثافة العالية والمنخفضة الكثافة الخلايا العصبية في 5 أيام بعد الطلاء. انخفاض ثقافة كثافة ما يقرب من 30 أضعاف أقل كثافة. كل من الخلايا العصبية تخضع لمراحل تطور النموذجية على النحو المبين من قبل Kaech ومصرفي (2006). في يوم 14، على حد سواء كثافة عالية والخلايا العصبية منخفض الكثافة تظهر الهياكل شجيري تفصيلا، كما يتضح من الصور مدينة دبي للإنترنت (أرقام 2C،D، لاحظ كل من لوحات هي من نفس المجال مع طائرات التنسيق المختلفة، كما هو مبين في موقع حفر). عندما ملطخة هذه الخلايا العصبية مع الأجسام المضادة MAP2 للكشف عن التشعبات، لا توجد فروق كبيرة في عدد من التشعبات (ر 13 = 1.27، P> 0.05، يقاس عدد شجيري طرف) ويبلغ طول شجيري (ر 16 = 1.41، P> 0.05 ) في الخلايا العصبية بين الخلايا العصبية كثافة عالية ومنخفضة الكثافة وجدت (الشكل 2E، F).

يستخدم العلامات مناعية للكشف عن نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic الوظيفية. نحن نستخدم تلطيخ مزدوج لتسمية NMDA مستقبلات فرعية NR1 وأمبا مستقبلات فرعية GluR1 (الشكل 3A)، ونقاط الاشتباك العصبي وظيفية (مترجمة شارك نقاط وباللون الأصفر) يمكن تحديدها بسهولة وكميا باستخدام يماغيج. وصفت الخلايا العصبية منخفض الكثافة أيضا مع الأجسام المضادة ضد شجيري MAP2 البروتين علامة،بالاشتراك مع البروتين المحاور علامة ف تاو. هذا وضع العلامات مزدوج يسمح تمييز واضح من التشعبات والمحاور (الشكل 3B). ويمكن أيضا أن الثقافات منخفض الكثافة يتم transfected بنجاح مع البلازميدات الحمض النووي باستخدام أساليب فوسفات الكالسيوم، على الرغم من أن معدل ترنسفكأيشن عادة منخفضة جدا في مراحل لاحقة (<0.2٪ الخلايا العصبية عند transfected في DIV21). ويوضح الشكل 3C أن EGFP ترنسفكأيشن يمكن أن تكشف عن مورفولوجيا الخلايا العصبية، و جعل الهياكل العمود الفقري شجيري غرامة مرئية. وأخيرا، كدليل على المفهوم، منخفضة للغاية الخلايا العصبية كثافة يمكن زراعتها تحت الظروف التي تعزز autapse تشكيل (الشكل 3D). هذه الخلايا العصبية autaptic منخفضة للغاية كثافة نمت على بولي-D-يسين المغلفة "، الجزر الصغرى" لا يمكن أن يستمر من خلال وحدة التغذية العصبية عالية الكثافة إلى ما بعد 2 أشهر مع هذا البروتوكول ثقافة مشتركة.

<وتجمع قوي> الشكل 1. توضيح تخطيطي لكثافة عالية ومنخفضة الكثافة بروتوكول التعاون ثقافة. (A) الماوس E16.5-E17.5 العقول الجنينية، يتم تشريح الحصين بها ويتفاعل مع التربسين. (ب) الحصين إستفتاء تغسل، وفصلها في الخلايا العصبية واحدة، ومطلي بمعدل كثافة عالية (250000 خلية / مل) في 24 لوحات جيدة. في هذه الأثناء، ومطلي منخفض الكثافة (10000 خلية / مل) الخلايا العصبية coverslips على. وحفرت الآبار للثقافة عالية الكثافة مع حقنة إبرة 18 G لتوفير الدعم المرتفع لللل coverslips. (ج) رسم توضيحي لثقافة مشتركة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. كلا لقد تعاونت كثافة عالية والخلايا العصبية منخفض الكثافة تطوير المورفولوجية mparable في الثقافة المشتركة. (A، B) Photomicrographs تظهر كثافة الطلاء كل من الكثافة العالية والمنخفضة طبقة الكثافة. الصور (C، D) مدينة دبي للإنترنت تظهر نمو محوار واسعة في كل من عالية (C)، ومنخفض الكثافة (D) الخلايا العصبية. الخلايا العصبية كثافة منخفضة على ساترة ويستريح الحق فوق الخلايا العصبية عالية الكثافة. لاحظ موقع الدعم البلاستيكية التي أثيرت. (E) سيتولوجية مناعية وسم MAP2 البروتين شجيري. (F) الكمي (يعني ± ووزارة شؤون المرأة) من إجمالي طول شجيري وشجيري عدد طرف في الخلايا العصبية. لا يوجد فرق كبير (م) كان ينظر بين الكثافة العالية والخلايا العصبية كثافة منخفضة نمت في الثقافة المشتركة. شريط النطاق في (ب، د)، و 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 3. التلاعب التجريبية من الخلايا العصبية كثافة منخفضة نمت في الثقافة المشتركة. (أ) وضع العلامات سيتولوجية مناعية في الثقافة منخفض الكثافة يسمح تحديد المشبك وظيفية محددة عن طريق المشاركة في وضع العلامات على GluR1 (الخضراء) وNR1 (الحمراء). (ب) المشاركة في وضع العلامات على الخلايا العصبية شجيري البروتين MAP2 (أرجواني) والبروتين المحاور ف تاو (الخضراء). (ج) ومنخفض الكثافة الخلايا العصبية قرن آمون transfected مع pEGFP-C3 البلازميد، والتي تبين العمود الفقري شجيري وافر. (D) والخلايا العصبية منخفض الكثافة التي أعدت حول بولي-D-ليسين "الصغيرة الجزيرة، ونمت على أعلى من الخلايا العصبية ذات الكثافة العالية. والقطب تسجيل التصحيح يملأ الخلايا العصبية مع اليكسا-555 هيدرازيد للكشف عن مورفولوجيا الخلايا العصبية. شريط النطاق في ميلادي، 20 ميكرون.7fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.