نحن نقدم طريقة أساسية قابلة للتكرار للفحص المجهري طويل المدى لدورة الحياة الجنسية للخميرة الانشطارية. مع التعديلات الطفيفة الموصوفة ، يسمح البروتوكول المقدم بالتركيز البحثي على خطوات مختلفة من عملية الإنجاب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخميرة الانشطارية كانت خميرة Schizosaccharomyces pombe نظاما نموذجيا لا يقدر بثمن في دراسة تنظيم تقدم دورة الخلية الانقسامية ، وآليات انقسام الخلايا وقطبية الخلية. علاوة على ذلك ، أسفرت التجارب الكلاسيكية على التكاثر الجنسي عن نتائج محورية للفهم الحالي لإعادة تركيب الحمض النووي والانقسام الاختزالي. أثار التحليل الأحدث لتزاوج الخميرة الانشطارية أسئلة مثيرة للاهتمام حول آليات استجابة المحفزات الخارجية ونمو الخلايا المستقطبة واندماج الخلايا الخلوية. لدراسة هذه الموضوعات بالتفصيل ، قمنا بتطوير بروتوكول بسيط للفحص المجهري لدورة الحياة الجنسية بأكملها. الطريقة الموضحة هنا يمكن تعديلها بسهولة لدراسة مراحل التزاوج المحددة. باختصار ، بعد نموها إلى المرحلة الأسية في وسط غني بالنيتروجين ، يتم تحويل مزارع الخلايا إلى وسط محروم من النيتروجين لفترات زمنية مناسبة لمرحلة دورة الحياة الجنسية التي سيتم استكشافها. ثم يتم تركيب الخلايا على غرف وسادة agarose مخصصة سهلة البناء للتصوير. يسمح هذا النهج بمراقبة الخلايا من بداية التزاوج إلى التكوين النهائي للجراثيم.
المقدمة
على الرغم من صرف الجيني بين خليتين هو الحدث المركزي في التكاثر الجنسي، فإنه يعتمد على سلسلة من الفعاليات التي تعزز تمايز الخلايا، والسماح للاختيار الشريك، والقيام الانصهار خلية خلية والحفاظ على الاستقرار الجيني. وهكذا تقدم دورة الحياة الجنسية نفسها كنظام نموذج لدراسة عدد من المسائل الحيوية المتعلقة مفاتيح التنموية، والاستجابة للمؤثرات خارجي، والانصهار غشاء البلازما والعزل الصبغي، الخ استكشاف الانشطار الخميرة دورة الجنسية لدراسة هذه الظواهر يجلب فوائد لل علم الوراثة قوية نظام النموذج، راسخة النهج الإنتاجية العالية والفحص المجهري متطورة. الجنس في الخميرة الانشطار هو حدث مغاير بين P-خلية وM-خلية من أنواع التزاوج متميزة. أ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
التحليل المجهري التكاثر الجنسي الانشطار الخميرة
1. إعداد وسائل الإعلام
- إعداد الدنيا تبوغ المتوسطة (MSL-N) 15 عن طريق خلط المكونات التالية: الجلوكوز: 10 جم / لتر، KH 2 PO 4: 1 جم / لتر، كلوريد الصوديوم: 0.1 جرام / لتر، MgSO 4 · 7H 2 O: 0.2 غرام / L. إضافة عناصر تتبع (10،000x): 100 ميكرولتر / L، فيتامينات (1،000x): 1 مل / لتر، و 0.1 M CaCl 2 مل / لتر. فلتر تعقيم باستخدام حجم مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الانشطار نمو الخميرة والتزاوج حيوية عند إزالة مصدر النيتروجين
كما النيتروجين التجويع هو شرط أساسي لبدء التكاثر الجنسي في الخميرة الانشطار، تم رصد نوع السلالة البرية H90 homothallic على التحول من النيتروجين الغنية والمتوسطة الذين حرموا من النيتروجين (الشكل 2)، بعد بروتوكول المبينة في الشكل رقم 1 لفترة وجيزة، والخلايا كانت تزرع O / N إلى مرحلة الأسي (OD 600 = 0.5) في MSL + N المتوسطة، التي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الظروف البيئية، وتوافر المواد الغذائية على وجه الخصوص، تؤثر بقوة على علم وظائف الأعضاء الانشطار الخميرة. النيتروجين المجاعة ضروري للالتزام التكاثر الجنسي ويؤدي إلى ضرب التغيرات في الإنقسامية تقدم دورة الخلية (المرجع 21) والشكل (2) في البداية. على إزالة النيتروجين من النمو أضعافا مضاعفة عدد السكان وحجم الخلية في الانقسام يتناقص بسرعة (الشكل 2C) وغالبية خلايا اعتقال التقدم الإنقسامية أقصر من طول المولود حديثا الخلايا المزروعة أضعافا مضاعف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
وأيد AV من قبل EMBO على المدى الطويل زمالة ما بعد الدكتوراه. ويتم تمويل البحوث في مختبر مارتن من منحة ERC البداية (GeometryCellCycle) ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_155944) إلى SGM.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الجلوكوز | سيجما ألدريتش | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4• 7H2< / sub>O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088،0025 | |
| حمض النيكوتينيك | AppliChem | A0963،0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716،0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967،0250 | |
| حمض البوريك | سيجما ألدريتش | B6768-1KG | |
| MnSO4< / sub> | AppliChem | A1038،0250 | |
| ZnSO4< / sub>&# 8226; 7H2O | سيجما ألدريتش | Z4750 | |
| FeCl2• 6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| أكسيد الموليبدينوم (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4• 5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| حامض الستريك | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | ميرك | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| ملح الأدينين هيميسولفات ، ميني 99٪ | سيجما ألدريتش | A9126-100G | |
| Uracil ؛ | سيجما ألدريتش | U0750 | |
| لانولين | سيجما ألدريتش | L7387 | |
| فازلين | ريكتولب | 92045-74-4 | |
| بارافين | ريكتولب | 7005600 |
المراجع
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
