Method Article

على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

DOI:

10.3791/53824

⸱

April 18th, 2016

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Medicine (Rheumatology), Albert Einstein College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجد مجموعات فرعية متميزة للخلايا التغصنية كمجموعات نادرة في الأعضاء اللمفاوية ، وبالتالي يصعب عزلها بأعداد كافية ونقاء للتجارب المناعية. نصف هنا طريقة عالية الكفاءة وعالية الإنتاجية لعزل جميع المجموعات الفرعية الرئيسية المعروفة حاليا من الخلايا المتغصنة الطحالية للفأر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية (DCS) هي المهنية الخلايا المقدمة للمستضد المسؤولة في المقام الأول لاكتساب ومعالجة وعرض المستضدات على مستضد الجزيئات لبدء الحصانة بوساطة الخلايا التائية. الخلايا الجذعية يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات فرعية ظاهريا وغير متجانسة وظيفيا. ثلاث مجموعات فرعية مهمة من الخلايا الجذعية الطحال هي بلازماوية الشكل، وخلايا CD8α نقاط البيع وCD8α NEG. في البلدان النامية بلازماوية الشكل والمنتجين الطبيعي الإنترفيرون من النمط الأول ومهمة لمكافحة الفيروسات مناعة الخلايا التائية. فرعية CD8α NEG العاصمة متخصصة لMHC من الدرجة الثانية تقديم المستضد وشملت مركزي في فتيلة خلايا CD4 T. وCD8α نقاط البيع البلدان النامية هي المسؤولة في المقام الأول عن عبر تقديم المستضدات الخارجية وCD8 T فتيلة الخلية. وقد أظهرت CD8α نقاط البيع البلدان النامية أن تكون أكثر كفاءة في تقديم المستضدات شحمي سكري جزيئات CD1d إلى سل تي المتخصصةالسكان ل المعروفة باسم ثابتة القاتلة الطبيعية خلايا T (iNKT). إدارة FLT-3 يجند يزيد من وتيرة هجرة الأسلاف الخلايا الجذعية من نخاع العظام، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى توسيع الخلايا الجذعية في الأعضاء الليمفاوية الطرفية في نماذج الفئران. تكيفنا هذا النموذج لتنقية أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية وظيفية لاستخدامها في التجارب نقل خلية للمقارنة في الجسم الحي الكفاءة من مجموعات فرعية العاصمة مختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اكتشاف الخلايا الجذعية (DC) منذ ما يقرب من أربعين عاما باسم "النجمية الكبيرة (تغصن اليوناني) خلية" وجدت في الأجهزة اللمفاوية 1. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن البلدان النامية هي خلايا مقدمة للمستضد الوحيدة التي يمكن أن تحفز على نحو فعال خلايا T ساذجة 2. والمهمة الرئيسية لهذه الخلايا هي امتصاص وعرض المستضدات والمعالجة بكفاءة وتحميل هذه على تقديم المستضد الجزيئات. في الطحال الماوس، البلدان النامية يمكن فصلها إلى بلازماوية الشكل وفرعية التقليدية. وتتميز البلدان النامية بلازماوية بانخفاض التعبير عن CD11c وومستويات عالية من B220 وGR-1. بل هي أيضا إيجابية للسطح علامة mPDCA1 وتفرز النوع الأول الإنترفيرون ردا على حصيلة مثل مستقبلات 9 (TLR9) بروابط. في البلدان النامية التقليدية مرتفعة عن CD11c ووMHC من الدرجة الثانية التعبير. ويمكن تقسيمها إلى ثلاث مجموعات فرعية مختلفة تعتمد على التعبير عن سطح علامات المظهرية مثل CD4، CD8α، DEC205، CD11B والخلايا الجذعية مستقبلات المثبطة 2 (DCIR2، معترف بها من قبل الأجسام المضادة 33D1) البروتينات 3،4. ومن المعروف أيضا CD8α نقاط البيع البلدان النامية كما cDC1، هي ايجابية لDEC205، ولكن سلبية لعلامات الدم النخاعي مثل CD11b و33D1. وCD8α NEG البلدان النامية، كما دعا cDC2، إيجابية ل33D1، CD11b وCD4 ولكنها تفتقر DEC205. فرعية سلبية مزدوجة (أي سلبية لكلا CD4 وCD8α) هي نادرة نسبيا، وسلبية للDEC205 و33D1. هو أقل فرعية السمات التي تميزت وقد يكون شكلا أقل تميزا من CD8α NEG العاصمة.

الاختلافات المظهرية في مختلف مجموعات فرعية العاصمة تمتد أيضا إلى وظائفهم في الجسم الحي. وCD8α NEG البلدان النامية هي أكلة للغاية ويعتقد أن تقديم مستضد خارجي أساسا عن طريق معقد التوافق النسيجي الكبير الثاني لخلايا CD4 T 3. في المقابل، في نقاط البيع البلدان النامية CD8α هي متخصصة لتقديم المستضد البروتين القابلة للذوبان على MHC الصف الأولفي آلية تسمى عبر العرض. نتائج عبر العرض يعتمد على حالة تفعيل هذه البلدان النامية 5، وإما أن تؤدي إلى توسيع الخلايا التائية السامة (CTLs) أو تطور الخلايا التائية التنظيمية 6 2،7. استهداف مستضد إلى CD8α نقاط البيع البلدان النامية استخدام نتائج تسليم بوساطة مكافحة DEC205 الضد إلى حد كبير في حذف خلايا تي 8، في حين عرض المستضدات المشتقة من الخلايا أفكارك المصابة يؤدي الى CTL استجابة قوية 9.

بالإضافة إلى الاعتراف مستضدات الببتيد، تطورت الجهاز المناعي الثدييات الاعتراف الدهون ومولدات المضادات شحمي سكري. يتم عرض هذه المستضدات من قبل جزيئات CD1، التي هي معقد التوافق النسيجي الكبير الطبقة أحب بروتينات سطح الخلية الموجودة في النماذج الخاصة المتعددة في مختلف الثدييات. في الفئران، ونوع واحد من الحفظ جدا جزيء CD1 دعا CD1d هو المسؤول عن تقديم المستضدات شحمي سكري 10. الاختصاص ويطلق السكان من خلايا تي التي تعترف CD1d / المجمعات شحمي سكري خلايا NKT ثابتة (خلايا iNKT). هذه الخلايا تعبر عن شبه ثابتة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) يتألف من سلسلة TCRα ثابتة أن يقترن مع سلاسل TCRβ التي التنوع 11 محدودة. وخلافا للخلايا T التقليدية التي تحتاج لتتكاثر والتفريق لتصبح تنشيط خلايا T المستجيب، وجود خلايا iNKT باعتبارها السكان المستجيب وتبدأ الاستجابة بسرعة بعد تناوله شحمي سكري 12. تحديد الخلايا مستضد الدهون ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية هي منطقة نشطة للبحث، لذا تم اقتراح العديد من أنواع الخلايا المتميزة مثل B الخلايا، الضامة والبلدان النامية لأداء هذه المهمة. ومع ذلك، وقد تبين أن مجموعة فرعية CD8α نقاط البيع من البلدان النامية هي الخلية الأساسية التوسط امتصاص وعرض المستضدات الدهون في خلايا فأر iNKT 13 و شحمي سكري بوساطة عبر فتيلة من خلايا CD8 T 14.

ove_content "> لمقارنة كفاءة تقديم المستضد من قبل مختلف خلايا مقدمة للمستضد، نهج مباشرة هو لنقل أنواع مختلفة من ناقلات الجنود المدرعة النقاء نابض مع المبالغ المعادلة المستضد إلى المضيفين السذاجة. وغالبا ما يتم إجراء تجارب نقل خلية من هذا النوع للدراسات المناعية. ومع ذلك، إجراء الدراسات نقل مع البلدان النامية خارج الحي مستضد تعامل يشكل تحديا، لأن هذه الخلايا موجودة السكان نادرة كما هو الحال في الأجهزة اللمفاوية حيث أنها تشكل أقل من 2٪ من مجموع الخلايا (15). ولذا فمن الضروري تعزيز تطوير هذه الخلايا في الحيوانات المانحة لزيادة كفاءة بروتوكولات العزلة.

ومن المعروف أن اللمفاوية المشترك والأسلاف النخاعي المشتركة، التي مطلوبة من أجل جيل من الحزب الديمقراطي المسيحي، CD8 نقاط البيع وفرعية CD8 NEG العاصمة، صريحة تتعلق FMS مستقبلات التيروزين كيناز 3 (FLT-3). عليها في الجسم الحي FLT-3 يجند (FLT-3L) الإدارة، emigratوزيادة أيون من FLT-3 معربا عن الخلايا السلف من نخاع العظام، مما أدى إلى زيادة البذر من الأعضاء الليمفاوية الطرفية وتوسيع بهم ناضجة العاصمة ذرية 16. يتم فقدان التعبير عن FLT-3 خلال الالتزام B، T أو NK مسارات تمايز الخلايا. لذلك، لوحظ فقط الحد الأدنى من التعديلات في هذه الخلايا على إدارة FLT-3L. لوحظ توسع مماثل في السكان في العاصمة الفئران تحمل الأورام الناتجة عن زرع خط الخلية B16-سرطان الجلد إفراز الفئران FLT-3L، الذي يوفر طريقة بسيطة واقتصادية لتوفير مستويات النظامية مستمرة من FLT-3L 17،18. باستخدام هذا النهج، قمنا بتطوير بروتوكول على أساس زرع الخلايا B16-سرطان الجلد إفراز FLT-3L لتحفيز التوسع في جميع مجموعات فرعية العاصمة العادية في الطحال الماوس، وبالتالي زيادة كبيرة في العوائد من هذه الخلايا التي يمكن أن تكون معزولة عن تجارب لاحقة . نجد دائما أنه في غضون 10-14 يوما بعد ايم تحت الجلدمزرعة للورم إفراز FLT-3، والفئران تطوير تضخم الطحال مع تخصيب ملحوظ في البلدان النامية تشكل 40 - 60٪ من مجموع خلايا الطحال. من هذه الطحال، مجموعات فرعية العاصمة مختلفة يمكن أن تكون معزولة مع نقاء عالية باستخدام معيار المتاحة تجاريا مجموعات تنقية الخلايا التي تستخدم علامات المظهرية-فرعية معينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتم التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC). يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تتطلب العقم في خزانة السلامة البيولوجية.

1. زرع B16.Flt3L الميلانوما في الفئران

  1. ثقافة FLT-3 معربا عن B16 سرطان الجلد خط خلية في T25 قوارير زراعة الأنسجة في مناطق ذات كثافة من 0.5 × 10 6 خلية / مل في المتوسط ​​DMEM كاملة مع 10٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. تنمو حتى تصل إلى خلايا ~ 90٪ التقاء (~ 20 ساعة).
  2. حصاد الخلايا بواسطة التربسين الهضم. نضح وسائل الإعلام ثقافة الخلية وغسل الخلايا الملتصقة مع برنامج تلفزيوني. إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة الباردة 20 مل الكامل DMEM المتوسطة (4 درجة مئوية) التي تحتوي على مصل العجل الجنين (FCS) لإرواء عملية الهضم البروتيني. رفع الخلايا من قبل طفيفة البزل تليها pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
  3. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو آلية مكافحة بقاء الخلية. و resuspend إلى كثافة من 10 8 خلية / مل في برنامج تلفزيوني.
  4. الفئران زرع (C57BL / 6 أو سلالة متوافق نسيجيا آخر) مع الخلايا السرطانية عن طريق الحقن تحت الجلد كما وصفها Machholz وآخرون. 19 في قاعدة العنق مع 100 ميكرولتر من تعليق خلية (10 7 خلايا).
  5. السماح للورم أن ينمو حتى اضح أو مرئية (2-10 ملم في القطر، وعادة 7-12 أيام) قبل التضحية الحيوانات لأجهزة الحصاد.

2. إعداد الطحال تعليق خلية واحدة من ورم وإذ الفئران

  1. تخدير الفئران مع جرعة زائدة من الأيزوفلورين (ضبط معدل تدفق الأيزوفلورين ل> 5٪ ومواصلة التعرض 2 دقيقة على الأقل بعد توقف التنفس). التضحية FLT-3 الورم القتامي تحمل الماوس عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للقتل الرحيم.
  2. ديsinfect الجلد مع الايثانول 70٪ والطحال الحصاد باستخدام تقنية العقيم مع المعونة من مقص العقيمة 20.
  3. وضع الطحال في طبق بتري معقمة لنقلها إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تنفيذ جميع الخطوات من هنا تحت ظروف معقمة.
  4. نقل الطحال إلى طبق بيتري الطازجة وتغسل مع RPMI المتوسطة. قطع الطحال إلى قطع صغيرة (~ 0.2 سم 2) باستخدام مشرط. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 10 مل من محلول كولاجيناز / الدناز.
  5. صب تعليق هضمها جزئيا من أنسجة الطحال على مصفاة الخلية 70 ميكرون. ضغط شظايا الأنسجة المتبقية من خلال شبكة من مصفاة باستخدام 5 مل حقنة الغطاس.
  6. غسل فلتر شبكة مع 10 مل من متوسطة جديدة والتخلص من مرشح. الطرد المركزي تعليق في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لخلايا بيليه.
  7. نضح طاف و resuspend بيليه خلية في 2 مل من العازلة تحلل كريات الدم الحمراء. في احتضان RT وأو 10 دقيقة. إخماد العازلة تحلل كريات الدم الحمراء عن طريق إضافة 10 مل من المتوسط ​​RPMI كاملة.
  8. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. resuspend في حجم مناسب لتحقيق كثافة الخلية من 10 8 خلية / مل في الخلية فرز عازلة (على سبيل المثال، أجهزة ماكينتوش) التي تحتوي على 20 ميكروغرام / مل من FC-كتلة الجسم المضاد (2.4G2).

3. تنقية بلازماوية البلدان النامية، CD8α نقاط البيع البلدان النامية وCD8α NEG البلدان النامية من الطحال تعليق خلية واحدة

ملاحظة: عزل مجموعات فرعية العاصمة الطحال من تعليق خلية واحدة هو إجراء متعددة الخطوات كما هو موضح في الشكل رقم 1 تنفيذ كافة الخطوات باستخدام عازلة تبرد قبل وحمام الماء المثلج للحفاظ على درجة حرارة 4-8 درجة مئوية. يتم احتساب كافة وحدات التخزين كاشف في القسم التالي من بروتوكول للمساهمة الأولي من 200 ميكرولتر من تعليق خلية الطحال في 10 8 خلية / مل). يمكن زيادتها هذا الأمر أوأسفل على أساس الحاجة الخاص بك عن طريق تغيير حجم التعليق الخلية (دائما في كثافة 1 X 10 8 خلايا / مل)، والكواشف الأخرى نسبيا في الخطوة الأولى (3.1.1 و 3.2.1). ضبط كميات كاشف في كل خطوات لاحقة وفقا لذلك. على سبيل المثال، إذا بدءا من 100 ميكرولتر من تعليق خلية الطحال في 1 × 10 8 / مل، واستخدام نصف كميات كاشف ورد في جميع الخطوات.

  1. عزل بلازماوية البلدان النامية (PDC)
    1. إضافة 300 ميكرولتر من المسمى البيوتين كوكتيل الأجسام المضادة المنصوص عليها في بلازماوية عدة العزلة العاصمة إلى 200 ميكرولتر من تعليق خلية الطحال.
    2. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة. الاستفادة من أنبوب كل 3 دقائق للحفاظ على الخلايا مع وقف التنفيذ، وتحقيق أقصى قدر من الأجسام المضادة ملزمة.
    3. إضافة 12 مل الفرز الخلية العازلة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح طاف لإزالة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز غير منضم.
    4. Resuspend والخليةبيليه في 500 ميكرولتر من خلية عازلة الفرز. إضافة 300 ميكرولتر من مكافحة البيوتين الخرز الضد مترافق. كرر الخطوة 3.1.2 و3.1.3.
    5. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 2 مل من خلية عازلة الفرز. تنفيذ جميع الخطوات من هذه النقطة في RT باستخدام مخازن تبريد مسبقا.
    6. وضع الخلايا المغناطيسية جديدة تنشيط فرز عمود LS في الوقوف المغناطيسي. غسل وتتوازن العمود مع 5 مل من خلية عازلة الفرز.
    7. ماصة تعليق الخلية على العمود، وتطبيق برفق إلى وسط سطح سرير العمود. جمع التدفق من خلال.
    8. غسل العمود مع 10 مل من خلية عازلة الفرز. جمع هذا التدفق من خلال الجمع بين ومع تدفق من خلال من الخطوة 3.1.7. وأثرى PDCS في هذا التدفق عمود من خلال (FT1).
    9. بيليه الخلايا من FT1 بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، resuspend في 2 مل خلية عازلة الفرز وتمر الخلايا من خلال عمود LS جديدةبتكرار الخطوات 3.1.6 - 3.1.8. هذا الاستخدام من عمودين متتابعة غلة نقاء تعزيز الخلايا المعزولة.
    10. خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و resuspend مع 2 مل كاملة RPMI. وضع على الجليد لحين الحاجة إليها.
  2. عزل CD8α نقاط البيع وCD8α NEG البلدان النامية
    ملاحظة: الخطوة الأولى في هذا الإجراء هو استنزاف الخلايا البائية، PDC، T وNK.
    1. بدءا كله تعليق خلية الطحال (1 مل ​​10 8 خلية / مل حصلت عليه في الخطوة 2.8)، إضافة 100 ميكرولتر من البيوتين مترافق كوكتيل الأجسام المضادة المنصوص عليها في عدة العزلة CD8α نقاط البيع العاصمة.
    2. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة. الاستفادة من أنبوب بلطف كل 3 دقائق لتحقيق أقصى قدر ملزمة من الأجسام المضادة المسمى البيوتين إلى الخلايا المستهدفة.
    3. إضافة 12 مل الفرز الخلية العازلة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح السوبرعائم لإزالة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز غير منضم.
    4. إضافة 150 ميكرولتر من خلية عازلة فرز و 100 ميكرولتر من الخرز مكافحة البيوتين المنصوص عليها في عدة العزلة CD8α نقاط البيع العاصمة. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة.
    5. إضافة 10 مل الفرز الخلية العازلة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. Resuspend الخلايا في 1 مل خلية عازلة الفرز وتمرير أكثر من عمود LS جديدة وفقا للإجراءات في الخطوات 3.1.6 خلال 3.1.8.
    7. جمع تدفق الخالي من الملصقات من خلال 2 (FT2) وتجاهل retentate العمود. وأثرى هذا جزء الخالي من الملصقات لCD8α نقاط البيع وCD8α NEG البلدان النامية.
    8. بيليه الخلايا في FT2 بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    9. Resuspend الخلايا في 1 مل العازلة خلية الفرز وإضافة 200 ميكرولتر من-CD8α المضادة حبات مغناطيسية مترافق المنصوص عليها في عدة العزلة CD8α نقاط البيع العاصمة.
    10. ممثلأكل الخطوات 3.2.2 خلال 3.2.6. وأثرى تدفق من خلال العمود لCD8α NEG البلدان النامية واستنزاف لCD8α نقاط البيع البلدان النامية. هذا هو المسمى تدفق من خلال 3 (FT3).
    11. إلى أزل CD8α نقاط البيع البلدان النامية الاحتفاظ بها في العمود، وإزالة عمود من المغناطيس، إضافة 5 مل من خلية عازلة الفرز وتطهير مصفوفة عمود باستخدام المكبس المتوفرة مع عمود LS.
    12. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح وطاف resuspend في 1 مل خلية عازلة الفرز. لزيادة نقاء، تشغيل خلايا مزال مرة أخرى من خلال عمود LS جديدة بتكرار الخطوات 3.1.6 إلى 3.1.8، إلا تجاهل التدفق من خلال وجمع الخلايا الاحتفاظ بها في 3.2.11.
    13. لتنقية CD8α NEG البلدان النامية من تعليق FT3، بيليه FT3 بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وresuspend في 300 ميكرولتر من خلية عازلة الفرز.
    14. إضافة 100 ميكرولتر من المجموعة الاستشارية للألغام المضادة للCD11c وحبات المغنطيسية. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة.
    15. إضافة 10 مل خلية فرز خلايا العازلة وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    16. كرر الخطوات من 3.1.5 خلال 3.1.8. ويتم اختيار CD8α NEG البلدان النامية بشكل إيجابي مع الخرز CD11c وولا بد أن العمود. تدفق من خلال يمكن التخلص منها.
    17. أزل الخلايا الاحتفاظ بها في العمود كما هو موضح في الخطوة 3.2.11 لجمع النقي CD8α NEG البلدان النامية.

4. النبض ناقلات الجنود المدرعة مع المستضدات ونقل خلية

  1. عد الخلايا الحية بعد تنقيتها باستخدام الأزرق الاستبعاد التريبان 21 لتمييز الخلايا الحية والميتة.
  2. احتضان الخلايا مع مستضد في الاختيار. استخدام نظائرها من المستضد شحمي سكري يسمى ألفا galactosyl سيراميد (αGalCer) في 100 نانومتر تركيز 13. عادة، لوحة 10 6 خلايا قابلة للحياة / جيد في المتوسط ​​RPMI كاملة باستخدام فائقة منخفضة اتاكhment U-أسفل 96 لوحات جيدة للحد من مرفق الخلية. احتضان الخلايا في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعة.
  3. حصاد الخلايا بواسطة pipetting بلطف عدة مرات. استخدام واسعة نصائح تتحمل ماصة للتقليل من تلف الخلايا من قوى القص. غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني وتجمع هذه يغسل لتعظيم حصاد الخلايا.
  4. بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend إلى كثافة المطلوبة في برنامج تلفزيوني. عادة، حقن 1000000 الخلايا في 200 ميكرولتر في الحيوان المتلقي. تبقي الخلايا على الجليد لتحقيق أقصى قدر من الجدوى قبل الإدارة في الحيوانات المضيفة.
  5. حقن الخلايا عن طريق الوريد في الفئران إما من خلال عبثا الذيل الأفقي أو الضفيرة الوريدية الرجعية المدارية 19. استخدام 27 G إبرة في حقنة 1 مل، وحقن الحد الأقصى لحجم 0.1 مل في الماوس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نتائج هذا الإجراء تعتمد على التوسع في مجموعات فرعية العاصمة من قبل الفئران FLT-3L التي أعرب عنها خلايا سرطان الجلد المزروع. وقد استمدت الورم B16.Flt3L من C57BL / 6 الماوس، وينبغي زرعها في الحيوانات مع هذه الخلفية سلالة من أجل تجنب الفشل من الورم لتصبح المنشأة بسبب الرفض. في بعض الحالات، قد يكون من المستحسن استخدام الفئران المعدلة وراثيا لاشتقاق البلدان النامية مع العيوب المعروفة في مسارات الإشارات أو مستقبلات المصالح. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتقبل الخلايا الجذعية ليكون المستضد المهنية الرئيسية تقديم الخلايا المشاركة في فتيلة من ردود الخلايا التائية. وظيفتها الرئيسية هي لمسح المكروية الأنسجة عن طريق تناول ومعالجة المستضدات لعرضها على خلايا تي. من أجل دراسة وظيفة فرعية العاصمة محددة، وهذه تحتاج إلى أن تكون معزولة في أعداد كافية باستخدام النهج الذي يحافظ على النمط الظاهري وظائف وضعها الطبيعي. معظم البروتوكولات تعتمد على عزل فرعية العاصمة معينة من الفئران ساذجة. وبما أن هذه الخلايا هي نادرة، وإجراءات العزل ليست فعالة وتسف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIAID منحة AI45889 إلى SAP التدفق الخلوي وأجريت دراسات من استخدام المرافق الأساسية FACS بدعم من مركز أينشتاين السرطان (NIH / NCI CA013330) ومركز لأبحاث الإيدز (NIH / NIAID AI51519).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials



List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05٪ Trypsin-EDTA لايف تكنولوجيز ، جيبكو25300-054
Isoflurane   ؛سيجما ألدريتشCDS019936-250 ملغ
كولاجيناز د & nbsp ؛Roche Diagnostics11088858001
DNase I (مسحوق جاف)QIAGEN79254
200 دليل على الإيثانول   ؛ثيرمو فيشر العلمي9-6705-004-220تستخدم لتحضير 70٪
الإيثانول RBC المخزن المؤقتSigma-AldrichR7757
RPMI-1640 مع L-glutamine & nbsp ؛تقنيات الحياة ، Gibco11875-119
DMEM medium مع L-glutamine   ؛لايف تكنولوجيز ، جيبكو11995-073
200 ملي مولار L-glutamine   ؛25030081Life Technologies
الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM  لايف تكنولوجيز ، جيبكو11140-050
MEM الأحماض الأمينية الأساسية   ؛لايف تكنولوجيز11130-051 
β-mercaptoethanol Life Technologies, Invitrogen21985-023
بيروفات الصوديوم  Life Technologies11360-070
HEPESLife Technologies ، Invitrogen15630
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup> درجة الحموضة الحرة 7.2)Life Technologies ، Invitrogen20012-050
Dulbecco s PBS (DPBS مع Ca2+ و Mg2+)Life Technologies، Gibco14040-182
0.5 M محلول الإيثيلين ديامين تترا أسيتات (EDTA)  لايف تكنولوجيز15575-020
ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتشA2153
مصل عجل الجنينأتلانتا بيولوجيزS11050   ؛
البنسلين / الستربتومايسين  Life Technologies, Invitrogen15140-163
Trypan blue (مسحوق جاف) سيجما ألدريتشT6146-5G تحضير 0.08٪ مع PBS
طقم عزل الخلايا المتغصنة البلازماسيويدي II ، الفأرMiltenyi Biotech130-092-786
حبات مغناطيسية مترافقة مع CD11c & nbsp المضادة للفأر ؛Miltenyi Biotech130-152-001
CD8 & alpha ؛ <افترض>Pos طقم عزل DC للماوس Miltenyi Biotech130-091-169
الجسم المضاد لمنع مستقبلات Fc-gamma (استنساخ 2.4G2)BD Biosciences553141
مضاد للفأر CD11c-FITC BD Biosciences553801
مكافحة الفئران CD8 &alpha ; -PerCP   ;BD Biosciences553036
مضاد للفأر B220-PE   ؛BD Biosciences553090
1 مل محاقن 26048د.ب
23 G1 إبرة د.ب305145
أطباق بتري 100 ملم  ثيرمو فيشر 875712
للأدوات الجراحية كينت ScientificINSMOUSEKIT
(70 & micro; م)352350دينار بحريني
ألواح بتري كبيرة Thermo Fisher
Scientific (500 مل (0.22 & micro; م))أعمدةكورنينج431097
LS Miltenyi130-042-401
MACS المغناطيسي  Miltenyi Biotec130-042-302
التجويف العريض 200 & mu; ل أطراف الماصة PerkinElmer111623
Corning مرفق منخفض للغاية 96 بئر ألواح  CorningCLS3474-24EA
6-8 أسابيع أنثى C57BL / 6 فئران   ؛مختبرات جاكسون للأبحاث ،
Murine B16.Flt3Lالموصوفة بواسطة Mach et al.< / em> ، 2000
10  ملم)
5 مل HEPES Buffer (1 M)
5 مل L-glutamine (200 & nbsp; ململ)
0.5 مل 2-mercaptoethanol (5.5 × 10-2< / sup> M)		امزج جميع المكونات في خزانة السلامة الحيوية مع وسائط DMEM أو RPMI حسب حاجتك. تصفية تعقيم الوسائط عن طريق المرور عبر 0.22 & micro; م نظام الترشيح الفراغي.
<قوي > كامل RPM و DMEM media< / قوي>أضف 50 مل من مصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة إلى وسائط RPMI أو DMEM الخالية من المصل للحصول على وسائط كاملة.
<قوي >MACS buffer < / قوي>أضف 2 مل من 0.5 M EDTA و 10 مل من مصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة إلى 500 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، Ca 2 + < / sup> و Mg2 + < / sup> Free ، درجة الحموضة 7.2) و 2 & nbsp ؛ ومايكرو. جم / مل 2.4G2 (الجسم المضاد Fc-Block).
<قوي > FACS المخزن المؤقت < / قوي>قم بإذابة أزيد الصوديوم إلى 0.05٪ (0.25 جم لكل 500 مل) في المخزن المؤقت MACS للحصول على محلول تلطيخ FACS
<قوي>10x محلول مخزون كولاجيناز D و DNase 1 < / strong>
قم بإذابة 1 جم من الكولاجيناز D و 0.2 مل من مخزون DNase 1 (1 مجم / مل ، 100x) في 20 مل من PBS يحتوي على Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup> للحصول على محلول حوالي 1,000-2,000 وحدة من نشاط الكولاجيناز لكل مل.		يمكن تحضير حل المخزون 10x هذا في وقت مبكر وتخزينه عند -20 درجة ؛ ج لعدة أسابيع. خفف 1 مل من هذا مع 9 مل من RPMI الخالي من المصل مباشرة قبل الاستخدام.
من محلول العلميةمصفاة خلايا نظام الترشيح الفراغي FB0875712 فاصل خط خلايا الورم الميلانيني Jax < قوي > مصل DMEM و RPMI الوسائط< / قوي >500 مل DMEM مع L-glutamine ، أو 500 مل RPMI-1640 مع L-glutamine 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x ،

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
  4. Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
  5. den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
  6. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  7. Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
  8. Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
  9. Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
  10. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).
  11. Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
  12. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  13. Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
  14. Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
  15. Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
  16. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
  17. Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
  18. Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
  19. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  20. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  21. Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  22. Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Cell IsolationMouse Dendritic CellsDendritic Cell SubsetsMagnetic Bead SeparationPlasmacytoid Dendritic CellsCD8alpha Dendritic CellsCell Sorting BufferAntigen PresentationSplenic Dendritic CellsFlt3 Ligand Expansion

Related Articles